パッシブCLARITYを使用したマウス中枢神経系の光学クリア
2016年6月30日
光学的透明化技術は、組織の可視化方法に革命をもたらしています。このレポートでは、より一貫性があり、より安価な結果をもたらす元のClear Lipid交換アクリルアミドハイブリダイズド硬質イメージング適合組織-hYdrogel(CLARITY)プロトコルの修正について説明します。
このプロトコルの全体的な目標は、元のCLARITYプロトコルへの変更を実証し、より一貫性があり費用対効果の高い結果が得られるようにすることです。この方法は、3D形態や中枢神経系の接続性など、神経科学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウスの中枢神経系における光学的透明化と顕微鏡観察の一貫性を向上させることです。
費用対効果が高く、再現可能な方法で。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。イメージングチャンバーの構造は複雑で、書面による説明からは容易には明らかではありません。
蛍光タンパク質を発現するマウスからパラホルムアルデヒド固定脳および脊髄組織を取得します。脳をプラスチック製のマウス脳マトリックスに入れ、マトリックスブレードで正中線に沿って切断することにより、脳を半球切除します。各半球と脊髄を別々の50ミリリットルの遠心分離チューブに追加します。
それぞれ40ミリリットルのヒドロゲル溶液が含まれています。蛍光色素を保護するために、チューブをアルミホイルで覆います。そして、サンプルとハイドロゲルの入ったチューブを摂氏4度で7日間穏やかに振とうしながらインキュベートします。
インキュベーション期間の後、サンプルから残る25ミリリットルのヒドロゲルと約25ミリリットルのヒドロゲルを遠心分離チューブに廃棄します。次に、キャップを取り外し、遠心分離管をデシケータージャーに入れ、ジャーを真空に接続してサンプルを脱酸素します。バキュームを少なくとも10分間適用します。
軽く振って、放出された酸素の泡を取り除きます。10分後、デシケータージャー内の真空を2〜3分かけて100%窒素ガスと交換します。圧力が等しくなり、デシケータージャーの上部が開けられるようになったら、酸素の再導入を防ぐためにチューブをすばやくキャップします。
次に、重合が完了するまで、サンプルの入ったチューブを摂氏37度の水浴に3時間入れて、ヒドロゲルを重合します。3時間後、重合したヒドロゲルはゲルのような粘稠度を帯びます。ヘラを使用して重合したサンプルを遠心分離チューブから取り出し、サンプルから余分なヒドロゲルを切り取ります。
最後に、サンプルを糸くずの出ないワイプに置き、その上で組織を優しくこすったり転がしたりして、残りのヒドロゲルを取り除き、サンプル上に重合ヒドロゲルの薄い層だけを残します。脂質除去のプロセスを開始するには、重合したサンプルを45ミリリットルの透明化緩衝液が入った清潔な50ミリリットルの遠心分離チューブに移し、摂氏45度で7日間穏やかに振とうしながらインキュベートします。この最初の7日間は、使用済みのクリアリングバッファーを化学廃棄物容器に注ぎ、バッファーを毎日交換します。
そして、45ミリリットルの新鮮なクリアリングバッファーを追加します。すべての脂質が可溶化され、組織が透明になったら、45ミリリットルのPBSTを充填した新しい50ミリリットルの遠心分離管にサンプルを移し、次の24時間にわたって摂氏40度で4回穏やかに振とうしながら洗浄し、残留SDSを除去します。最終的なPBST洗浄後、サンプルを1ミリリットルあたり1マイクログラムのDAPIと1xPBSTで満たされた清潔な15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。
ホイルで包み、室温で24時間インキュベートします。翌日、PBSTで室温で3回、1回の洗濯につき少なくとも6時間洗濯します。次に、屈折率マッチングに進みます。
この手順のこの部分を開始するには、サンプルを2-2チオジエタノールと1xPBSを充填した清潔な15ミリリットルの遠心分離チューブにPH 7.5で移し、画面に示すようにインキュベートします。2回目のインキュベーションの終わりに向かって、再利用可能な接着剤を転がして、サンプルの厚さよりわずかに大きい均一な直径のシリンダーにチャンバーを作成し、イメージングします。シリンダーを40ミリメートルのガラス底皿に開いた円で置きます。
次に、P1000ピペットチップを使用して、再利用可能な接着剤とガラスをシリンダーの外縁に転がすことで、ガラスとの間にシールを作成します。約100マイクロリットルの63%TDEをガラス皿にピペットで固定し、再利用可能な接着剤の円の中でガラス表面を覆うように広げます。次に、へらを使用して、泡を形成しないように注意しながら、サンプルを円の中央に慎重に配置します。
次に、さらに100マイクロリットルの63%TDEをサンプルに直接ピペットで移し、すぐに40mmの円形カバーガラスを再利用可能な接着剤の上に置きます。両手の人差し指、中指、薬指を使って、カバーガラスがサンプルに接触するまで円の周囲を慎重に押します。次に、ガラス底の皿をゆっくりと表面に立てかけた位置に戻し、溶液が上部の小さな開口部に到達するまでピペットで63%TDEを追加します。
糸くずの出ないワイプを使用してピペットチップを乾かし、溶液がガラスに滴り落ちないようにします。最後に、小さな開口部にシリコンエラストマーを追加して円を囲み、閉じたチャンバーを作成します。乾燥するまで5分待ってから、イメージングに進みます。
サンプルが入ったイメージングチャンバーをレーザー走査型共焦点顕微鏡のステージに置きます。イメージングソフトウェアを開き、アルゴン励起レーザーをオンにするには、プログラムの上部にある[構成]タブをクリックしてから、レーザーアイコンをクリックします。アルゴンの横にあるチェックボックスをオンにしてレーザーに電力を供給し、スライドスケールを30%に移動します上部の取得タブに戻ります。
ビームパス設定ボックスで、ロードセーブ設定ボックスに移動し、ドロップダウンメニューを選択して、YFPを放出する適切な波長チャネルを選択します。チャンネル設定ボックスで、対物レンズの現在のオブジェクトというラベルの付いた赤いハイパーリンクをクリックして、イメージングに適した対物レンズを選択します。作動距離が組織の厚さよりも大きい対物レンズを使用してください。
また、面内画像の解像度を最大化し、光学セクションの厚さを最小限に抑えるための大きな開口数。ドロップダウンメニューの左側の列で、XY解像度ウィンドウを開き、取得マトリックス(形式)を1024x1024または対物レンズの横方向の解像度制限に適した値に設定します。ズーム係数はできるだけ低く設定します。
ここでは 1.7 を使用します。同じウィンドウで、個別にラベル付けされたメニューをドロップダウンして、8行目の平均と1フレームの平均パラメータを設定します。ステージコントロールを使用してサンプルを見つけます。
代表フィールドが表示されたら、YFPのゲインを760〜780に設定し、オフセットを1.0〜1.5に設定します。タイルスキャンを選択します。そして、取得するZスタックの上限と下限を設定します。
対物レンズの光学断面分解能制限に基づいて光学断面の厚さを設定し、取得を開始します。この画像は、大脳皮質と海馬のYFP陽性ニューロンを5倍倍で画像化し、3Dで再構築したものです。スケールバーは 1 ミリメートルを表します。
大脳皮質の10倍画像スタックのこの最大強度投影は、皮質層5錐体ニューロンの樹状突起異常を実証しています。ここで、スケールバーは100ミクロンを表しています。ここでは、THY-1YFPの発現を無傷の頸椎と胸椎で示し、5倍の倍率で画像化し、3Dで再構築しています。
スケール バーは 2 ミリメートルを表します。最後に、脊髄の10倍の画像化されたスタックのこの最大強度投影は、個々の軸索を示し、スケールバーは100ミクロンを表します。適切に準備されていれば、この技術は全脊髄で2〜4週間、半角脳で4〜6週間で行うことができます。
この手順に続いて、より複雑な生化学的表現型決定を必要とする質問に答えるために、免疫ヒスト化学などの他の方法を準備することができます。このビデオを見た後、マウスの中枢神経系を光学的にクリアしてイメージングする方法を十分に理解しているはずです。パッシブクラリティとレーザー共焦点顕微鏡を使用します。
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概要
この報告書は、元のCLARITYプロトコルの修正について議論し、光学クリアリング技術の一貫性とコスト効率を向上させます。これらの進歩は、神経科学研究における組織の視覚化に不可欠です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 光学イメージング
- 組織クリアリング技術
背景
- 光学クリアリング技術は組織の視覚化を改善します。
- CLARITYプロトコルは神経科学におけるイメージングに広く使用されています。
- 修正は再現性を向上させ、コストを削減することを目的としています。
- 複雑な方法を理解するためには、視覚的な実演が不可欠です。
研究の目的
- CLARITYプロトコルの修正を示す。
- 光学クリアリングにより一貫した結果を達成する。
- 神経科学研究のためのコスト効率の高い方法を提供する。
使用された方法
- 元のCLARITYプロトコルの修正。
- イメージングチャンバー構造の実演。
- マウスの中枢神経系への適用。
- 3D形態と接続性の分析に焦点。
主な結果
- 光学クリアリングの一貫性の向上。
- 研究者のためのコスト効率の高い方法。
- 神経科学におけるイメージング能力の向上。
- 複雑な手順のための視覚的補助の提供。
結論
- CLARITYプロトコルの修正は有益です。
- 一貫した結果は神経科学研究を進歩させることができます。
- 視覚的な実演は複雑な方法を理解するのに役立ちます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Optical clearing techniques like passive CLARITY enable 3D visualization of intact neural tissue, addressing a key bottleneck in neuroscience target validation where serial sectioning introduces artifacts that compromise morphological and connectivity analysis. By improving consistency and reducing cost, this method supports reliable preclinical modeling of CNS disorders, enhancing predictive confidence in early discovery stages. The approach facilitates mechanistic de-risking by allowing direct observation of structural phenotypes in disease-relevant systems without tissue deformation artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through intact 3D morphology and connectivity analysis in the mouse CNS.
- Operational Value: Provides biological de-risking by preserving tissue integrity while removing light-scattering lipids for clear imaging.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative structural data on neuronal networks for target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by rendering tissue transparent and amenable to high-resolution imaging.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through passive CLARITY modifications that improve consistency in clearing outcomes.
- Platform Reuse: Enables scalable compound evaluation by creating reusable imaging chambers compatible with laser scanning confocal microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports translational biomarker alignment by allowing longitudinal imaging of structural changes in intact spinal cord and brain models.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by providing 3D structural readouts applicable to disease progression studies.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates advancement decisions by delivering clear axonal and dendritic morphology data for mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work, specifically supporting hypothesis testing and pathway clarification in CNS target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling 3D imaging of neuronal morphology and connectivity in intact mouse CNS tissue.
- Screening: Describes assay readiness through tissue transparency achieved via lipid removal and refractive index matching with TDE.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as 3D reconstruction of YFP-positive neurons, dendritic arborization, and axonal tracking for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing structural biomarkers in disease-relevant CNS models without sectioning artifacts.
- Enterprise Reuse: Frames the technique as a reusable capability through the construction of a durable imaging chamber using reusable adhesive and glass-bottom dishes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced mechanistic ambiguity in CNS structural analysis.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via passive CLARITY protocol modifications that eliminate electrophoretic variability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by providing reliable 3D structural data to reduce late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative imaging of neuronal networks for target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, hydrogel polymerization, and lipid clearing techniques.
- Needs instrumentation including centrifuge tubes, water baths, vacuum desiccators, and laser scanning confocal microscopes.
- Demands cross-team standardization for buffer exchange, washing steps, and refractive index matching procedures.
- Involves adaptation considerations across model systems, as timing varies from 2-4 weeks for spinal cords to 4-6 weeks for hemisected brains.
- Includes practical limitations such as the need for fluorescent protein expression or immunostaining for visualization and careful handling to avoid bubble formation during imaging chamber setup.
