パッシブCLARITYを使用したマウス中枢神経系の光学クリア

本プロトコルの全体的な目的は、元のCLARITYプロトコルに修正を加えることで、より一貫性がありコスト効率の高い結果を得る方法を提示することです。この手法は、中枢神経系における3D形態やコネクティビティなど、神経科学における重要な問いに答えるのに役立ちます。本手法の主な利点は、マウスの中枢神経系における光学透明化と顕微鏡観察の一貫性が向上することにあります。

コスト効率が高く、再現可能な方法で実施します。イメージングチャンバーの構築は複雑であり、記述的な説明だけでは容易に理解できないため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。

蛍光タンパク質を発現しているマウスから、パラホルムアルデヒド固定した脳および脊髄組織を採取します。プラスチック製のマウス脳マトリックスに脳をセットし、マトリックスブレードを用いて正中線に沿って切断し、脳を半球に分けます。それぞれの脳半球と脊髄を、別々の50 milliliter遠心チューブに入れます。

それぞれに40 millilitersのハイドロゲル溶液を分注します。フルオロフォアを保護するため、チューブをアルミホイルで覆います。そして、サンプルとハイドロゲルを含むチューブを4 °Cで、緩やかに振盪しながら7日間インキュベートします。

インキュベーション期間の後、ハイドロゲル25 millilitersを廃棄し、遠心チューブ内にサンプルと約25 millilitersのハイドロゲルを残します。次に、キャップを取り外し、遠心チューブをデシケーターに入れ、デシケーターを真空ポンプに接続してサンプルを脱酸素します。少なくとも10分間、真空状態にします。

軽く振って、放出された酸素の気泡を取り除きます。10分後、デシケーター瓶内の真空を100%窒素ガスで2～3分かけて置換します。圧力が等しくなり、デシケーター瓶の上部が開けられるようになったら、酸素が再混入するのを防ぐために、速やかにチューブにキャップをします。

次に、サンプルが入ったチューブを37 °Cの温浴に3時間浸し、重合が完了するまでハイドロゲルを重合させます。3時間後、重合したハイドロゲルはゲル状の硬さになります。スパチュラを使用して、遠心チューブから重合したサンプルを取り出し、サンプルから過剰なハイドロゲルを切り取ります。

最後に、サンプルをリントフリーワイプの上に置き、組織を優しくこすりながら転がして残ったハイドロゲルを除去し、サンプル上に重合したハイドロゲルの薄い層だけが残るようにします。脂質除去プロセスを開始するには、重合したサンプルを45 mLのクリアリングバッファーが入った清潔な50 milliliter遠心チューブに移し、45 degrees celsiusで緩やかに振盪しながら7日間インキュベートします。この最初の7日間は、使用済みのクリアリングバッファーを化学廃棄物容器に捨て、毎日バッファーを交換してください。

次に、新鮮な透明化バッファーを45 milliliters加えます。すべての脂質が可溶化され、組織が透明になったら、サンプルを45 millilitersのPBSTを満たした新しい50 milliliter遠心チューブに移し、その後24時間にわたって40 degrees celsiusで緩やかに振盪しながら4回洗浄し、残留したSDSを除去します。最後のPBST洗浄後、サンプルを1 microgram per milliliter DAPIおよび1xPBSTを満たした清潔な15 milliliter遠心チューブに移します。

アルミホイルで包み、室温で24時間インキュベートする。翌日、室温のPBSTで1回につき少なくとも6時間、計3回洗浄する。その後、屈折率整合に進む。

本手順を開始するために、サンプルを2-2 thiodiethanolとpH 7.5の1xPBSを満たした清潔な15 milliliter遠心チューブに移し、画面に表示されている通りにインキュベートします。2回目のインキュベーションの終了近くで、再利用可能な粘着テープを、サンプルの厚みよりわずかに大きい均一な直径の円柱状に丸めて、イメージングチャンバーを作成します。この円柱を、40 millimeterのガラス底ディッシュの上に、端が開いた円状に配置します。

次に、P1000ピペットチップを使用して、再利用可能な粘着剤をシリンダーの外縁に沿って転がし、粘着剤とガラスの間にシールを作成します。約100 µLの63% TDEをガラスディッシュにピペットで滴下し、再利用可能な粘着剤の円内のガラス表面を覆うように広げます。その後、スパチュラを用いて、気泡が入らないように注意しながら、サンプルの中心を円の中に慎重に配置します。

次に、63%TDEをさらに100 µLサンプルに直接ピペッティングし、すぐに再利用可能な接着剤の上に直径40 mmの円形カバーガラスを載せます。両手の人差し指、中指、薬指を使用して、カバーガラスがサンプルに接触するまで、円の周囲を慎重に押さえます。その後、ガラスボトムディッシュをゆっくりと垂直に立てて表面に固定し、溶液が上部の小さな開口部に達するまでピペットで63%TDEを加えます。

溶液がガラス上に滴下しないよう、糸くずの出ないワイプを使用してピペットチップの水分を拭き取ります。最後に、シリコンエラストマーを小さな開口部に追加して円を閉じ、密閉チャンバーを作成します。5分間乾燥させた後、イメージングに進みます。

サンプルを入れたイメージングチャンバーを共焦点レーザー走査顕微鏡のステージに設置します。イメージングソフトウェアを開き、アルゴン励起レーザーをオンにするには、プログラム上部の設定（configuration）タブをクリックし、次にレーザーアイコンをクリックします。アルゴンの横にあるチェックボックスをオンにしてレーザーに電源を入れ、スライドスケールを30%に移動させます。上部の取得（acquire）タブに戻ります。

ビームパス設定ボックス内のロード・セーブ設定ボックスへ進み、ドロップダウンメニューからYFPを放出させるための適切な波長チャンネルを選択します。チャンネル設定ボックスにおいて、「objective current object」と記載された赤色のハイパーリンクをクリックし、イメージングに適した対物レンズを選択してください。組織の厚さよりも作動距離が長い対物レンズを使用してください。

そして、面内画像分解能を最大化し、光学切片厚を最小限に抑えるために、大きな開口数（NA）を用います。ドロップダウンメニューの左列にあるXY分解能ウィンドウを開き、フォーマットと呼ばれる取得マトリックスを1024x1024、または対物レンズの側方分解能限界に適した値に設定します。ズーム倍率は可能な限り低く設定してください。

ここでは1.7を使用します。同じウィンドウ内で、個別にラベル付けされたドロップダウンメニューから、8行平均（eighth line average）および1フレーム平均（one frame average）のパラメータを設定します。ステージコントロールを使用してサンプルを特定します。

代表的な視野が表示されたら、YFPのゲインを760から780の間、オフセットを1.0から1.5の間に設定します。タイルスキャンを選択し、次に取得するZスタックの上限値と下限値を設定します。

対物レンズの光学切片分解能の限界に基づいて光学切片の厚さを設定し、撮像を開始します。この画像は、大脳皮質および海馬におけるYFP陽性ニューロンを5倍の倍率で撮像し、3D再構成したものです。スケールバーは1 mmを表しています。

大脳皮質の10枚の画像スタックから作成したこの最大強度投影画像は、皮質第5層錐体ニューロンの樹状突起分枝を示しています。ここでのスケールバーは100 micronsを表しています。ここでは、5倍の倍率で撮影し3D再構成した、無傷の頸髄および胸髄におけるTHY-1YFP発現を示しています。

スケールバーは2 mmを示しています。最後に、脊髄の10倍像スタックの最大強度投影法により、個々の軸索が示されています。スケールバーは100 µmを示しています。適切に実施すれば、この手法は脊髄全体で2〜4週間、半側切断脳で4〜6週間で完了させることができます。

本手順に続き、より複雑な生化学的フェノタイプ解析が必要な疑問を解決するために、免疫組織化学などの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、パッシブクリアリングおよび共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、マウスの中枢神経系を光学的に透明化し、イメージングする方法について十分に理解できるはずです。