Name: パッシブCLARITYを使用したマウス中枢神経系の光学クリア (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶパッシブCLARITY法によるマウス中枢神経系の光学クリアリングと3Dイメージング。一貫性とコスト効率を向上させた改良プロトコルで、神経回路の形態と接続性を可視化します。

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この作品は、寛大に神経疾患・脳卒中（NIH / NINDS）助成金1R01NS086981とコンラッドN.ヒルトン財団の健康/国立研究所の国立研究所によってサポートされていました。我々は、共焦点顕微鏡との貴重な援助のために博士ローランBentolila博士マシューSchiblerに感謝します。私たちは、CLARITYフォーラム（http://forum.claritytechniques.org）に寄与しているものに感謝します。我々は、特にこの魅力的な技術を教えるために、彼の研究室を開放するための博士カールDeisserothに感謝します。著者らは、脳マッピング医学研究機構、脳マッピング支援財団、ピアソン・ラブレス財団、アーマンソン財団、キャピタル・グループ会社慈善財団、ウィリアムM.とリンダR. Dietel慈善基金、およびノー​​ススター基金からの寛大な支援に感謝してい。この刊行物で報告された研究はまた、部分的に研究資源のための国立センターと国家のディレクターのオフィスでサポートされていました受賞番号C06RR012169、C06RR015431、およびS10OD011939下の健康のアル研究所。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

すべての実験は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインに従って行われました。 THY1-YFP、PLP-EGFPおよびPV-TdTomatoマウスをこれらの実験に使用したが、蛍光タンパク質を発現している任意のマウスは正常にクリアして画像化することができます。 1.組織標本注意：パラホルムアルデヒド（PFA）とアクリルアミドが毒性と刺激物です。ドラフト内で、適切な個人用保護具（白衣、手袋、目の保護）で、これらの試薬を利用する実験を行います。 <ol><li> （ - 3分〜2）呼吸が停止するまでのイソフルラン〜1ミリリットルで安楽死室で動物を生け贄に捧げます。 </li><li> （ - 10分5）血液が組織からクリアされるまで、心臓内に4℃で灌流液（ 表1）でマウスを灌流するために〜5ミリリットル/分に設定し、蠕動ポンプを使用してください。 </li><li>固定液を灌流液を変更します（ 表1）4℃で首と尾が大幅に補強されるまで（5から10分）。 </li><li>灌流を終了し、動物を刎ねます。慎重に最初の頭蓋骨を周囲の結合組織を除去した後、頭蓋骨の腹面から骨を除去し、20で説明したように、（ 図1a）は、脳を持ち上げて、頭蓋骨から脳を解剖します。 注：小脳の片葉小節のローブと嗅球を周囲の骨の除去に特別な注意を与えます。 <ol><li>優しく脊髄と脊柱の間の微妙な、鋭いハサミの先端を挿入し、21で説明したように、離れて個々の脊柱セグメントを切断することにより脊柱から脊髄を解剖。 </li></ol></li><li>プラスチックマウス脳マトリックス中に配置し、マトリクスの刃で正中線に沿って切断することにより脳を二等分します。 </li><li> 50ミリリットルの遠心分離槽を分離する各半球および脊髄を追加ヒドロゲル溶液（ 表1）~40 mlのエス。この点から前方のすべての後続のステップ中に蛍光団を保護するためにアルミホイルでチューブをカバーしています。 </li><li>穏やかに7日間（〜30 rpm）で振とうしながら4℃でヒドロゲル中にサンプルを含むチューブをインキュベートします。 </li></ol> 2.重合<ol><li>遠心管にサンプルと〜ヒドロゲルの25ミリリットルを維持し、ヒドロゲルの〜25ミリリットルを廃棄します。 </li><li>キャップを外し、デシケータージャーに遠心管を配置し、真空に瓶を接続することにより、試料を脱酸素。溶液およびフォームの泡の出てくるために溶存ガスを可能にするために、少なくとも10分間真空を適用します。静かに気泡を取り除くために振ります。 </li><li> 3分 - 2を超える100％の窒素ガスでデシケータージャー内に真空を交換してください。圧力が（デシケータージャーのトップを開くことができたら）等化したら、すぐに酸素の再導入を防止するためのチューブをキャップ。 </li><li>ポリマー重合が完了するまで、3時間37℃の水浴中で試料と管を配置することによってヒドロゲルをIZE。重合ヒドロゲルは、ゲル状のコンシステンシー（ 図1b）にかかります。注意：上部の未重合ヒドロゲルの少量が許容されます。 </li><li>サンプルから過剰なヒドロゲルを切り取った後、遠心分離管から重合サンプルを除去するために、へらを使用します。 </li><li>無料のワイプリントにサンプルを置き、静かにサンプル上の重合ヒドロゲルの薄層だけを残し、擦れ、その上に組織を圧延することにより、残りのヒドロゲルを削除します。 </li></ol> 3.脂質除去注：脂質クリア組織は壊れやすいので、取り扱いに注意して。チューブを排出する際にサンプルが失われないようにセルストレーナーを使用してください。また、試料は、屈折率整合プロセス中に逆転させることができる膨張が、クリア処理を通じて膨潤します。 注意：SODIUMドデシル硫酸ナトリウム（SDS）およびホウ酸が刺激されています。ドラフト内で、適切な個人用保護具（白衣、手袋、目の保護）とそれらを利用した実験を行います。 <ol><li>きれいな50ミリリットルの遠心分離管に重合したサンプルを移し、緩衝液（ 表1）をクリアする45ミリリットルを追加します。穏やかに振とうしながら45℃（〜30 rpm）でインキュベートします。化学廃棄物への使用クリアリングバッファをオフに注ぐ、新鮮なクリアリングバッファの〜45ミリリットルを添加することにより、最初の7日間毎日バッファを変更します。蛍光団を保護するためにアルミホイルで覆われたサンプルを含む遠心管を保管してください。 </li><li> 3日 - 最初の7日後、すべての2〜40°Cと交換決済バッファーでサンプルをインキュベートします。すべての脂質が可溶化され、組織は透明（ 図1c）に達するまでクリアし続けます。マウス脳半球のための6週間と2 - - 脊髄のための4週間これは4になります。 </li><li>組織がクリアされると、転送新しい50mlの遠心管に試料及び残留SDSを除去するために、24時間にわたって穏やかに振盪（約30 rpm）しながら40℃でPBST（ 表1）で4回洗浄します。 </li></ol> 4.分子染色注意：4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニル二塩酸塩（DAPI）は、刺激性であり、それを利用した任意の実験はドラフト内で、適切な個人用保護具（白衣、手袋、目の保護）を用いて行われるべきです。 <ol><li>きれいな15mlの遠心チューブにサンプルを移し、1×PBST、pH7.5中に1μg/ mlのDAPIで埋めます。 24時間室温（RT）でインキュベートします。蛍光団を保護するためにアルミホイルで覆われたサンプルを含む遠心管を保管してください。 </li><li>少なくとも6時間/洗浄を室温でPBSTで3回洗浄します。 </li></ol> 5.屈折率整合注意：SH 2,2&#39;-チオジエタノール（TDE）は、刺激性であり、任意の実験は、それを利用しますドラフト内で、適切な個人用保護具（白衣、手袋、目の保護）を行うことがウルド。 <ol><li>きれいな15ミリリットルの遠心分離管にサンプルを移し、1×PBS、pH7.5中30％（v / v）のTDEで満たします。 24時間穏やかに振とうしながら40℃（〜30 rpm）でインキュベートします。 </li><li> 1×PBS、pH7.5中63％（v / v）のTDEとの交流30％TDE。穏やかに24時間振盪しながら40℃でインキュベートします。 注：サンプルは、ほぼ元の大きさに戻って縮小します。 </li><li>平らな、きれいな表面上のサンプルの厚さよりもわずかに大きい均一な直径を持つシリンダーに再利用可能な接着剤の一部をロールバックします。 </li><li> 40ミリメートルのガラスボトムディッシュにオープンエンド円（上部に小さな開口部を持つ〜25ミリメートル、内径）で再利用可能な接着剤シリンダーを置きます。訂正がなされる必要がある場合は、ガラスからシリンダーを取り外し、カミソリの刃で切断しました。 </li><li>によって、再利用可能な接着剤とガラスとの間にシールを作成するために、P1000のピペットチップを使用してシリンダーの外側リムの周りにそれを転がします。 </li><li>場所〜100μlの63％のガラス皿の上にTDEと再利用可能な接着剤の円内のガラス表面を覆うように周りに広がります。 </li><li>へらを使用して、慎重に気泡を形成しないように注意しながら、円の真ん中にサンプルを配置します。 </li><li>サンプル上に直接63％TDEの別の100μLをピペットで、その後すぐに再利用可能な接着剤の上に40ミリメートルの円形のカバーガラスを配置します。 </li><li>カバーガラスが試料と接触したまでインデックス、中央、及び両手の薬指を使って、慎重に円形の周囲を押します。 </li><li>ゆっくりと、表面に支え直立位置にガラスボトムディッシュをもたらすソリューションは、上部に小さな開口部に到達するまで、ピペットを用いて63％のTDEを追加します。無料のソリューションは、ガラス上に滴下しないようにピペットチップをオフに乾燥するためにワイプ糸くずを使用してください。チャンバー内の気泡を回避するために、ピペットのすべての方法を空にすることはありません。 </li><li>に小さな開口部は、円を囲み、閉鎖チャンバーを作成するために、シリコンエラストマーを追加します。それは撮影前に乾燥するのを5分待ってください。 </li></ol> 6.顕微鏡注意：共焦点、単一平面照明と光シート顕微鏡で使用されるレーザーは非常に強力であり、失明を引き起こす可能性があります。レーザーを利用した任意の実験は、広範囲の訓練の後、大きな注意し、適切な眼の保護を行うべきです。 <ol><li>レーザー走査共焦点顕微鏡のステージ上の内部サンプルとイメージング室を配置します。 </li><li>イメージングソフトウェアを開きます（材料の表を参照してください）​​。アルゴン励起レーザーをオンにするには、その後、プログラムのレーザアイコンの上部にある[設定]タブをクリックします。レーザーの電源を入れて、30％にスライドスケールを移動させるために、アルゴンの横にあるボックスをチェックします。選択された位置まで温め、ゆっくりとポインタを守ってください。 <ol><li>上部の取得]タブに戻ります。大きなボックスに「ビーム経路の設定＆＃34; /負荷に行くボックスを設定保存し、画像YFP（527 nm）のに適した波長チャネルを選択するドロップダウンメニューを選択します。 </li></ol></li><li>チャネルの設定]ボックスの下：「現在のオブジェクトの目的」というラベルの付いた赤いハイパーリンクを配置することにより、イメージングのために適切な目標を選択します。タブをクリックすると、すべての利用可能な目標を開き、選択がタレットを自動的に回転します。 <ol><li>使用目的（ 例えば 、10倍）大きい作動距離（組織の厚さよりも大きいが、画像化される、 例えば11 mm）とし、大きな開口数（ 例えば 、0.3）を有する面内画像の解像度を最大にし、最小限にします光学部の厚さ。 </li></ol></li><li> 1,024×1024または目的の横方向の解像度の限界に適した値に、「フォーマット」と呼ばれる、取得行列を設定するには：「解像度XY」ウィンドウのドロップダウンメニューの左の欄には、開きます。 （可能な限り低いズーム倍率を設定し、例えば 、1。7）。 </li><li>同じウィンドウでは、それに応じて個別に標識されたメニューをドロップダウンすることにより、8ラインの平均値と1フレーム平均パラメータを設定します。高い信号対雑音比と迅速な取得のための小さな値の大きい値を使用してください。 注：8ラインの平均値と1フレームの平均は約4時間で、マウスの脳半球の高品質な画像を取得します。 </li><li>ステージコントロールを使用してサンプルを探します。代表的なフィールドが表示されたら、ゲインとオフセットを設定します。 フルオロフォア、ゲインとオフセットは、組織の種類に基づいて、実質的に変化し、および/または画像化される解剖学的特徴：注意してください。 YFPの場合、オフセット用のゲインおよび-1.0から-1.5まで、760から780に値を設定します。 </li><li> 「タイルスキャン」を選択し、関心領域の境界を選択します。 zスタックの設定上限値と下限値を取得します。目的の光学部の解像限界に基づいて、光学部の厚さを設定します。 注：目的の光学部の解像限界は、主に、その開口数によって定義されます。ほとんどの顕微鏡制御ソフトウェアが自動的に使用されている目的のために適切な値を計算します。約11ミクロンとなる0.3の開口数の10倍の対物レンズのため。 </li><li>取得を開始します。 注：これは、複数の時間がかかることがあります。 </li><li>関心の特定の領域から高倍率の対物レンズを使用して、より高い解像度の画像を収集します。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

ハイドロゲル包埋組織（パッシブCLARITY）の受動クリアは組織の大部分をクリアするための簡単​​で安価な方法です。このアプローチは、専用の設備を必要とせず、容易に温度制御シェーカー中で行うことができます。数週間のスパンで、このような脳全体または脊髄などであっても大規模な、非常に有髄組織は、顕微鏡検査のために透明性と適切ななります。このレポートは、CNS組織の清算に焦点を当てているにもかかわらず、受動CLARITYは、任意の組織に適用することができます。 光学決済技術の相対的な長所と短所は、文献13,17,22で、以前に議論されてきたが、ほとんど明らかに23にレイアウトされています。受動CLARITYは、多数のサンプルが同時にクリアされ、再現性が非常に重要である実験のために適しています。組織に追加の支持を提供するために、ヒドロゲルを使用することは、Mを容易に組織のプロービングultiple。この報告書では、小分子量染料、DAPIは、実証されたが、抗体検査の複数のラウンドは、このアプローチでも可能です。 <p ...

完全な神経解剖学的構造を画像化する能力は、健康と病気における脳を理解するために非常に価値があります。従来、3Dイメージングでは、軸方向の分解能を提供し、深部の解剖学的構造を視覚化するために、組織切片化が必要でした。このアプローチでは、高解像度のデータセットを生成できますが、高度な画像再構築技術が必要であり、非常に手間がかかります。その結果、少量の組織1〜3のイメージングに限定されてきた。一方、光学セクショニングは、蛍光標識された組織の高解像度3D画像の作成に適しています。光学セクショニングは本質的に 3 次元であるため、3D イメージ ボリュームを生成するために広範な計算は必要ありません。 しかし、光散乱や組織の不透明度により、組織を光学的に切片化できる深さは制限されます。イメージングの深さは、レーザー走査型共焦点顕微鏡では約150μm、2光子励起顕微鏡では800μm未満に制限されています4-8。
>jove_content<これらの制限を克服するために、最近いくつかの光学的透明化技術が開発され、その後、無傷の組織の深い顕微鏡イメージングを可能にするためにさらに改良されました。固定組織を透明にするためのベンジルアルコールと安息香酸ベンジル(BABB)の使用は、最も初期のアプローチの1つでした9。しかし、このアプローチは、サンプル中の蛍光の消光と高有髄構造の不完全な透明化によって制限されていました10。3D Imaging of Solvent Cleared Organs(3DISCO)などのこの技術の改良により、非常に迅速かつ完全な組織クリアが可能になりましたが、依然として蛍光シグナル、特に黄色蛍光タンパク質(YFP)10の急速な損失に悩まされています。Sca/e11やSeeDB12などの水性清澄化溶液は、蛍光シグナルを保持しますが、高髄組織を完全には清浄にしません。クリアで遮るもののない脳イメージングカクテルと計算分析(CUBIC)は、以前に開発された水性クリアリングソリューション13の制限を克服するように見える有望な新しい光学クリアリング技術です。他の光学的クリアリング技術とは対照的に、Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel(CLARITY)14は、多孔質マトリックスに脳を埋め込み、タンパク質、核酸、および小分子に構造的完全性を提供しながら、脂質を非結合のままにします。その後、脂質は電気泳動で除去され、光学的にクリアされた脳が得られます。これは、簡単に視覚化でき、一般的に利用可能な技術を使用して同様に簡単にプローブできます。
電気泳動組織清算(ETC)は、CLARITYでハイドロゲル包埋組織から脂質を除去するために使用されますが、ETCを一貫して実施することは困難であり、電気泳動の対象となる組織は組織の歪み、褐変、蛍光の喪失、抗体反応性を示す可能性があります。受動的な脂質の透明化はこれらの制限を回避しますが、清算時間を増やす必要があります15-17。パッシブクリアリングでは、利用可能なETC装置の数に制限されないため、多数のサンプルを並行してクリアすることもできます。パラホルムアルデヒドの濃度を減少させ、ハイドロゲルからビスアクリルアミドを排除すると、より大きな組織拡張を犠牲にして、透明化の速度が大幅に向上した16。元のCLARITY技術で使用されていた屈折率マッチングソリューションに代わる安価な代替品が開発されました17-19。2,2'-チオジエタノール(TDE)は、脂質除去中に発生する組織拡張の一部を逆転させる安価で迅速な脳クリアリング剤です18。このレポートでは、ハイドロゲル包埋組織の受動的透明化と、元のCLARITY技術に対する屈折率マッチングソリューションとしてのTDEの使用を組み込んで、マウス中枢神経系の光学的透明化のための再現性が高く安価なプロトコルを作成します。

<table><tbody><tr><td>10x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>緩衝液</td></tr><tr><td>32% パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15714-5</td><td>灌流およびヒドロゲル</td></tr><tr><td>2,2'-チオジエタノール (TDE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782-500G</td><td>屈折率マッチング溶液</td></tr><tr><td>40% アクリルア</td><td>ミド Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td>ハイドロゲル</td></tr><tr><td>2% ビスアクリルアミド</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td>ハイドロゲル</td></tr><tr><td>VA-044 開始剤</td><td>和光純薬工業(株)</td><td>VA044</td><td>ヒドロゲル</td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>クリアリングバッファー</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>フィッシャー</td><td>BP166-5</td><td>クリアリングバッファー</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>55255-1</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>52002-100G</td><td>防腐剤</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>X100-500G</td><td>緩衝液</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td>灌流</td></tr><tr><td>硝酸ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>BP360-500</td><td>灌流</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>分子プローブ</td><td>D1306</td><td>核染色</td></tr><tr><td>99.9% イソフルラン</td><td>フェニックス</td><td>57319-559-06</td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>ヒドロコロリン酸</td><td>フィッシャー</td><td>A1445-500</td><td>緩衝液</td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>Willco</td><td>HBSB-5040</td><td>Willco皿</td></tr><tr><td>再利用可能な接着剤</td><td>ボスティック</td><td>371351</td><td>ブルータック</td></tr><tr><td>シリコンエラストマー</td><td>ワールド精密機器</td><td>KWIK-CAST</td><td>Kwik-Cast</td></tr><tr><td>糸くずの出ないワイプ</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>KimWipe</td></tr><tr><td>マウス脳マトリックス</td><td>Roboz</td><td>SA-2175</td><td>切片組織</td></tr><tr><td>マトリックスブレード</td><td>Roboz</td><td>RS-9887</td><td>切片組織</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>コール・パーマー</td><td>77122-24</td><td>pefusion</td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>SP5</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア</td><td>ライカ</td><td>LAS</td><td>AF顕微鏡</td></tr></tbody></table>

パッシブclarityを使用したマウス中枢神経系の光学クリア

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

>jove_content<伝統的に、組織の可視化は、対象の組織を連続的に切片化し、画像化することを必要とし、各組織切片をユニークな非線形変形にさらし、中枢神経系(CNS)における細胞の形態、分布、および接続性を評価する能力を劇的に妨げていました。しかし、光学的透明化技術により、組織の可視化方法が変わりつつあります。これらのアプローチにより、無傷の臓器調製物を深く調査することができ、健康や疾患における組織の構造構成について非常に深い洞察を得ることができます。CLARITY(CLARITY)は、光散乱脂質を自由に拡散させながら重要な生体分子を結合するマトリックスを提供することで、この目標を達成します。脂質の除去とそれに続く屈折率のマッチングにより、組織は透明になり、3次元(3D)で容易に画像化されます。それにもかかわらず、元のCLARITYプロトコルで使用されていた電気泳動組織透明化(ETC)は、成功裏に実装するのが難しい場合があり、独自の屈折率マッチングソリューションを使用すると、この技術を日常的に使用するのに費用がかかります。このレポートでは、組織の完全性を向上させるためのパッシブCLARITYと、前述の屈折率マッチングソリューションである2,2′-チオジエタノール(TDE)を組み合わせた、シンプルで安価な光学クリアリングプロトコルの実装を示しています。

脳の構造組織の可視化形態との接続が健康と病気で脳機能にどのような影響を与えるかを理解するために重要です。光学決済技術は、私たちが凝集的形態との接続性を研究することができ、無傷の組織における3次元の画像細胞集団にことを可能にします。 細胞の亜集団のための特異的プロモーターによって駆動される蛍光タンパク質を発現するマウスは、脳内の神経接続の複雑なパターンを離れていじめるために1つを可能にします。これらのマウスは、脳（ 図2aおよびb）は、投影大脳皮質と海馬に存在する神経細胞、ならびに他の構造体のサブセットにおいてYFPを発現するので、THY1-YFPトランスジェニックマウスは、光学的透明文献において広く使用されてきました。さらに、YFP +皮質層Vのニューロンは、s内の皮質脊髄路を通って突出しますpinalコード（ 図2c＆D）、皮質ニューロン15</sup...

光学的透明化技術は、組織の可視化方法に革命をもたらしています。このレポートでは、より一貫性があり、より安価な結果をもたらす元のClear Lipid交換アクリルアミドハイブリダイズド硬質イメージング適合組織-hYdrogel(CLARITY)プロトコルの修正について説明します。

パッシブCLARITYを使用したマウス中枢神経系の光学クリア

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

本プロトコルの全体的な目的は、元のCLARITYプロトコルに修正を加えることで、より一貫性がありコスト効率の高い結果を得る方法を提示することです。この手法は、中枢神経系における3D形態やコネクティビティなど、神経科学における重要な問いに答えるのに役立ちます。本手法の主な利点は、マウスの中枢神経系における光学透明化と顕微鏡観察の一貫性が向上することにあります。コスト効率が高く、再現可能な方法で実施します。イメージングチャンバーの構築は複雑であり、記述的な説明だけでは容易に理解できないため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。蛍光タンパク質を発現しているマウスから、パラホルムアルデヒド固定した脳および脊髄組織を採取します。プラスチック製のマウス脳マトリックスに脳をセットし、マトリックスブレードを用いて正中線に沿って切断し、脳を半球に分けます。それぞれの脳半球と脊髄を、別々の50 milliliter遠心チューブに入れます。それぞれに40 millilitersのハイドロゲル溶液を分注します。フルオロフォアを保護するため、チューブをアルミホイルで覆います。そして、サンプルとハイドロゲルを含むチューブを4 °Cで、緩やかに振盪しながら7日間インキュベートします。インキュベーション期間の後、ハイドロゲル25 millilitersを廃棄し、遠心チューブ内にサンプルと約25 millilitersのハイドロゲルを残します。次に、キャップを取り外し、遠心チューブをデシケーターに入れ、デシケーターを真空ポンプに接続してサンプルを脱酸素します。少なくとも10分間、真空状態にします。軽く振って、放出された酸素の気泡を取り除きます。10分後、デシケーター瓶内の真空を100%窒素ガスで2～3分かけて置換します。圧力が等しくなり、デシケーター瓶の上部が開けられるようになったら、酸素が再混入するのを防ぐために、速やかにチューブにキャップをします。次に、サンプルが入ったチューブを37 °Cの温浴に3時間浸し、重合が完了するまでハイドロゲルを重合させます。3時間後、重合したハイドロゲルはゲル状の硬さになります。スパチュラを使用して、遠心チューブから重合したサンプルを取り出し、サンプルから過剰なハイドロゲルを切り取ります。最後に、サンプルをリントフリーワイプの上に置き、組織を優しくこすりながら転がして残ったハイドロゲルを除去し、サンプル上に重合したハイドロゲルの薄い層だけが残るようにします。脂質除去プロセスを開始するには、重合したサンプルを45 mLのクリアリングバッファーが入った清潔な50 milliliter遠心チューブに移し、45 degrees celsiusで緩やかに振盪しながら7日間インキュベートします。この最初の7日間は、使用済みのクリアリングバッファー

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Research

JoVE Journal

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神経科学

全体マウス器官の多光子顕微鏡は、光学的にイメージを作成する前に臓器をクリアすることにより可能ですが、そうでない場合、すべてのプロトコルは、蛍光タンパク質の蛍光信号を保持します。エタノールベースの​​脱水およびベンジルアルコールを用いて光学クリア方法を使用する場合：安息香酸ベンジルのクリアは、YFPを発現全体のマウスの脳の高解像度多画像を示す。...

YFPを発現クリアマウス脳の多光子顕微鏡

慢性高眼圧症は、マウスの目に小柱網のレーザー光凝固を使用して誘導される。眼圧（IOP）は、レーザー治療後数ヶ月上昇する。視力と実験動物のコントラスト感度の低下は微細運動テストを使用して監視している。...

ビジュアル欠陥を特徴づけるために慢性高眼圧症のレーザー誘起マウスモデル

この記事では、高分解能、蛍光標識したマウスの脳の微細脳解剖と、再構築するための完全な実験手順について説明します。説明されたプロトコルは、試料調製及び清算、画像化、データ後処理およびマルチスケール視覚化のための取付片を備えている。...

共焦点光シート顕微鏡全体マウスの脳のミクロンスケールの分解能光トモ

脊椎上突起は痛みの知覚やその他の行動にとって重要であり、セロトニン作動性線維はこれらの線維システムの一つです。本研究では、これらのセロトニン作動性線維の終結を調査するために、マウス脊髄へのCLARITY/CUBICプロトコルの組み合わせの適用に焦点を当てました。...

CLARITY / CUBIC技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング

本稿では、高分解能のスペクトル領域光干渉断層法 (SD OCT) とマウス網膜の生体内イメージングのためのプロトコルについて説明します。それは網膜神経節細胞 (RGC)...

光干渉断層計: マウス網膜神経節細胞In Vivoイメージング

ここでは、アクアポリン 4 (AQP4) 伝による麻痺と opticospinal の炎症を誘発するプロトコルを提案-WT マウスに AQP4-/-マウスから特定の T...

麻痺、視神経脊髄炎自己抗原アクアポリン 4 の T 細胞特定のマウスの視覚系障害の誘導

MPACT 最大の光透過性とそのまま齧歯動物のティッシュ血管系の後続の顕微解析を実現するため、psPACT 2...

新規パッシブ全体の中枢神経系組織における光透過性の急速な生産のための方法をクリア

ここでは、脳組織のCLARITY法を全マウントレチナに適応させ、標準的な免疫組織化学染色およびレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングの品質を向上させるプロトコルを提示する。...

CLARITY組織クリアリング法による全マウントレティナの免疫染色

プロトコールは、組織クリアリング法ScaleSFを用いた脳スライスにおけるニューロンイメージングの詳細な方法を提供する。このプロトコルには、脳組織調製、組織清澄化、クリアスライスの取り扱い、およびメゾスコピックレベルから顕微鏡レベルまでのニューロン構造の共焦点レーザー走査顕微鏡イメージングが含まれます。...

メゾスコピックから顕微鏡スケールまでのニューロンイメージングのための組織クリアリング法

分子溶液の吸収などの光学的透明化技術は、光散乱を一時的に低減して生物学的イメージングを強化し、深く埋め込まれた臓器に対する生体適合性のある可逆的な in vivo...

吸収分子を用いたEx vivo および In vivo イメージングのためのトランジェント光学クリアリング

学ぶパッシブCLARITY法によるマウス中枢神経系の光学クリアリングと3Dイメージング。一貫性とコスト効率を向上させた改良プロトコルで、神経回路の形態と接続性を可視化します。

パッシブCLARITYを使用したマウス中枢神経系の光学クリア

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