パッシブCLARITYを使用したマウス中枢神経系の光学クリア

このプロトコルの全体的な目標は、元のCLARITYプロトコルへの変更を実証し、より一貫性があり費用対効果の高い結果が得られるようにすることです。この方法は、3D形態や中枢神経系の接続性など、神経科学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウスの中枢神経系における光学的透明化と顕微鏡観察の一貫性を向上させることです。

費用対効果が高く、再現可能な方法で。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。イメージングチャンバーの構造は複雑で、書面による説明からは容易には明らかではありません。

蛍光タンパク質を発現するマウスからパラホルムアルデヒド固定脳および脊髄組織を取得します。脳をプラスチック製のマウス脳マトリックスに入れ、マトリックスブレードで正中線に沿って切断することにより、脳を半球切除します。各半球と脊髄を別々の50ミリリットルの遠心分離チューブに追加します。

それぞれ40ミリリットルのヒドロゲル溶液が含まれています。蛍光色素を保護するために、チューブをアルミホイルで覆います。そして、サンプルとハイドロゲルの入ったチューブを摂氏4度で7日間穏やかに振とうしながらインキュベートします。

インキュベーション期間の後、サンプルから残る25ミリリットルのヒドロゲルと約25ミリリットルのヒドロゲルを遠心分離チューブに廃棄します。次に、キャップを取り外し、遠心分離管をデシケータージャーに入れ、ジャーを真空に接続してサンプルを脱酸素します。バキュームを少なくとも10分間適用します。

軽く振って、放出された酸素の泡を取り除きます。10分後、デシケータージャー内の真空を2〜3分かけて100%窒素ガスと交換します。圧力が等しくなり、デシケータージャーの上部が開けられるようになったら、酸素の再導入を防ぐためにチューブをすばやくキャップします。

次に、重合が完了するまで、サンプルの入ったチューブを摂氏37度の水浴に3時間入れて、ヒドロゲルを重合します。3時間後、重合したヒドロゲルはゲルのような粘稠度を帯びます。ヘラを使用して重合したサンプルを遠心分離チューブから取り出し、サンプルから余分なヒドロゲルを切り取ります。

最後に、サンプルを糸くずの出ないワイプに置き、その上で組織を優しくこすったり転がしたりして、残りのヒドロゲルを取り除き、サンプル上に重合ヒドロゲルの薄い層だけを残します。脂質除去のプロセスを開始するには、重合したサンプルを45ミリリットルの透明化緩衝液が入った清潔な50ミリリットルの遠心分離チューブに移し、摂氏45度で7日間穏やかに振とうしながらインキュベートします。この最初の7日間は、使用済みのクリアリングバッファーを化学廃棄物容器に注ぎ、バッファーを毎日交換します。

そして、45ミリリットルの新鮮なクリアリングバッファーを追加します。すべての脂質が可溶化され、組織が透明になったら、45ミリリットルのPBSTを充填した新しい50ミリリットルの遠心分離管にサンプルを移し、次の24時間にわたって摂氏40度で4回穏やかに振とうしながら洗浄し、残留SDSを除去します。最終的なPBST洗浄後、サンプルを1ミリリットルあたり1マイクログラムのDAPIと1xPBSTで満たされた清潔な15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。

ホイルで包み、室温で24時間インキュベートします。翌日、PBSTで室温で3回、1回の洗濯につき少なくとも6時間洗濯します。次に、屈折率マッチングに進みます。

この手順のこの部分を開始するには、サンプルを2-2チオジエタノールと1xPBSを充填した清潔な15ミリリットルの遠心分離チューブにPH 7.5で移し、画面に示すようにインキュベートします。2回目のインキュベーションの終わりに向かって、再利用可能な接着剤を転がして、サンプルの厚さよりわずかに大きい均一な直径のシリンダーにチャンバーを作成し、イメージングします。シリンダーを40ミリメートルのガラス底皿に開いた円で置きます。

次に、P1000ピペットチップを使用して、再利用可能な接着剤とガラスをシリンダーの外縁に転がすことで、ガラスとの間にシールを作成します。約100マイクロリットルの63%TDEをガラス皿にピペットで固定し、再利用可能な接着剤の円の中でガラス表面を覆うように広げます。次に、へらを使用して、泡を形成しないように注意しながら、サンプルを円の中央に慎重に配置します。

次に、さらに100マイクロリットルの63%TDEをサンプルに直接ピペットで移し、すぐに40mmの円形カバーガラスを再利用可能な接着剤の上に置きます。両手の人差し指、中指、薬指を使って、カバーガラスがサンプルに接触するまで円の周囲を慎重に押します。次に、ガラス底の皿をゆっくりと表面に立てかけた位置に戻し、溶液が上部の小さな開口部に到達するまでピペットで63%TDEを追加します。

糸くずの出ないワイプを使用してピペットチップを乾かし、溶液がガラスに滴り落ちないようにします。最後に、小さな開口部にシリコンエラストマーを追加して円を囲み、閉じたチャンバーを作成します。乾燥するまで5分待ってから、イメージングに進みます。

サンプルが入ったイメージングチャンバーをレーザー走査型共焦点顕微鏡のステージに置きます。イメージングソフトウェアを開き、アルゴン励起レーザーをオンにするには、プログラムの上部にある[構成]タブをクリックしてから、レーザーアイコンをクリックします。アルゴンの横にあるチェックボックスをオンにしてレーザーに電力を供給し、スライドスケールを30%に移動します上部の取得タブに戻ります。

ビームパス設定ボックスで、ロードセーブ設定ボックスに移動し、ドロップダウンメニューを選択して、YFPを放出する適切な波長チャネルを選択します。チャンネル設定ボックスで、対物レンズの現在のオブジェクトというラベルの付いた赤いハイパーリンクをクリックして、イメージングに適した対物レンズを選択します。作動距離が組織の厚さよりも大きい対物レンズを使用してください。

また、面内画像の解像度を最大化し、光学セクションの厚さを最小限に抑えるための大きな開口数。ドロップダウンメニューの左側の列で、XY解像度ウィンドウを開き、取得マトリックス(形式)を1024x1024または対物レンズの横方向の解像度制限に適した値に設定します。ズーム係数はできるだけ低く設定します。

ここでは 1.7 を使用します。同じウィンドウで、個別にラベル付けされたメニューをドロップダウンして、8行目の平均と1フレームの平均パラメータを設定します。ステージコントロールを使用してサンプルを見つけます。

代表フィールドが表示されたら、YFPのゲインを760〜780に設定し、オフセットを1.0〜1.5に設定します。タイルスキャンを選択します。そして、取得するZスタックの上限と下限を設定します。

対物レンズの光学断面分解能制限に基づいて光学断面の厚さを設定し、取得を開始します。この画像は、大脳皮質と海馬のYFP陽性ニューロンを5倍倍で画像化し、3Dで再構築したものです。スケールバーは 1 ミリメートルを表します。

大脳皮質の10倍画像スタックのこの最大強度投影は、皮質層5錐体ニューロンの樹状突起異常を実証しています。ここで、スケールバーは100ミクロンを表しています。ここでは、THY-1YFPの発現を無傷の頸椎と胸椎で示し、5倍の倍率で画像化し、3Dで再構築しています。

スケール バーは 2 ミリメートルを表します。最後に、脊髄の10倍の画像化されたスタックのこの最大強度投影は、個々の軸索を示し、スケールバーは100ミクロンを表します。適切に準備されていれば、この技術は全脊髄で2〜4週間、半角脳で4〜6週間で行うことができます。

この手順に続いて、より複雑な生化学的表現型決定を必要とする質問に答えるために、免疫ヒスト化学などの他の方法を準備することができます。このビデオを見た後、マウスの中枢神経系を光学的にクリアしてイメージングする方法を十分に理解しているはずです。パッシブクラリティとレーザー共焦点顕微鏡を使用します。