βアミロイド斑とミクログリアの相互作用を研究するために相関光と電子顕微鏡

この手順の全体的な目標は、電子顕微鏡法のための免疫染色および組織処理を事前に埋め込む前に、アルツハイマー病マウスモデルの脳切片のβアミロイドプラークを同定することです。この方法は、ミクログリア細胞とアミロイドベータプロット近くのシナプスとの相互作用など、神経免疫学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、目的の領域や層にアミロイドベータプロットを含む脳組織切片を事前にスクリーニングできることです。

この方法はアルツハイマー病に適用できますが、アミロイドーシスが存在する他の病気や組織にも適用できます。まず、メトキシX04化合物の5ミリグラム/ミリリットル溶液を調製します。ミルコ天びんを使用して、メトキシX04の5ミリグラムを重量化します。

ヒュームフードの下で、メトキシX04を100マイクロリットルのDMSOに溶解し、透明で緑がかった溶液が得られるまで攪拌します。攪拌しながら、450マイクロリットルのプロピレングリコールと450マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水を連続して加えます。溶液を摂氏4度で一晩混合し続けます。

翌日、黄緑色のエマルジョンが見られるはずです。メトキシX04を注射した後、体重1キログラムあたり10ミリグラムの用量を追加し、承認された方法に従って動物を希望の時点で犠牲にし、パラオルムアルデヒド固定脳を冷やしたPBSで3回洗浄します。次に、鋭利なカミソリの刃を使用して嗅球を取り外し、脳を冠状にほぼ同じ高さの2〜3片に切断します。これらすべてを同時に切片にして、手順を加速できます。

トレイに固定された標本プレートに脳組織の断片を接着します。滑らかな切断面が試料プレートにしっかりとくっついていることを確認してください。脳の表面全体が完全に水没するまで、PBS溶液をトレイに加えます。

トレイをビブラトームに置き、ビブラトームの設定を調整して、厚さ50ミクロンのセクションを生成します。カットを開始し、スクリーニングする場合はすぐに細い絵筆を使用してセクションをPBSに移します。あるいは、切片を凍結保護溶液を含むガラスバイアルに入れて、摂氏20度で保存することもできます。

定位固定装置マウス脳アトラスを用いて、関心領域を含む脳切片を選択し、各切片を24ウェル培養プレートのウェル内の凍結保護剤に入れます。次に、使い捨てピペットを使用してPBSの液滴を顕微鏡スライドに追加し、液滴に切片を置きます。蛍光顕微鏡で切片を検査し、a-βプラークと標識されたメトキシX04を含む領域を特定します。

顕微鏡ステージを動かさずに、明視野および蛍光モードで関心領域の画像をキャプチャします。各画像は、プラークを組織切片の構造領域に関連付けるために、両方のフィールドで同じ領域を示す必要があります。動物番号に従って撮影した画像を保存し、名前を付けます。

また、撮影した写真のプレートとフィールド内のウェル番号も記録します。イメージングが完了したら、セクションを指定されたウェルに戻します。同じ手順を使用してシーケンスの次のセクションを調べ、セクションが乾燥しないようにします。

イメージを整列させるには、ImageJ で同じ ROI の明視野イメージと UV フィールド イメージを開きます。次に、MosaicJプラグインを使用して、2つの画像の端を揃えます。ウェル番号に従って整列および結合された画像を、特定の動物の番号を含むフォルダーに保存します。

同じ動物の異なる切片の画像を組み合わせて、関心領域のプラークを特定し、位置を特定します。スクリーニングプロセスが完了したら、免疫染色またはさらなる処理が行われるまで、凍結保護剤を含む24ウェル培養プレートである20°Cで検査切片を保存します。まず、ガラスバイアル内のリン酸緩衝液中の1%四酸化オスミウム溶液を調製します。

四酸化オスミウムは感光性があるため、ガラスバイアルをアルミホイルで覆い、溶液を光から保護します。リン酸緩衝液で洗浄した後、切片から緩衝液を取り出し、細い絵筆を使用して平らに広げます。四酸化オスミウムを追加すると、切片の折り目が永久的になり、オスミウム固定後に組織を平らにしようとすると切片が壊れるだけなので、必ず切片を平ら

トランスファーピペットを使用して、切片が浸漬されるまで、四酸化オスミウムを一度に1滴ずつ切片に加えます。ウェルをアルミホイルで覆って切片を光から保護し、室温で30分間インキュベートします。このインキュベーション中に、使い捨てビーカーにプラスチック樹脂を準備します。

成分を順番に組み合わせ、10ミリリットルの血清ピペットを使用して均一な色が得られるまでよく混合します。準備した混合物をアルミニウム製の計量皿に移します。これらは、脱水状態になると組織切片を受け取ります。

インキュベーション時間が経過したら、エタノールの濃度を増やしながら切片をそれぞれ2分間脱水します。24ウェル培養プレートから脱水切片を20ミリリットルのガラスバイアルに移します。次に、切片をプロピレンオキシドに3回、毎回2分間浸して、残留エタノールを除去します。

次に、曲がったガラスピペットの先端または細い絵筆を使用して、プロピレンオキシド溶液からプラスチック樹脂に切片を移し、室温で一晩浸潤させます。浸潤後、試料が入ったアルミニウム製の計量皿を摂氏50〜60度のオーブンに10〜15分間入れます。ポリクロロトリフルオロエチレンフィルムシートに切片を埋め込むには、まず細い絵筆を使用して、切片に樹脂の薄層をペイントします。

次に、ティッシュの1つのセクションをアルミニウム製の計量皿からPCTFEフィルムシートに一度に移動します。ティッシュの周りから余分な樹脂を取り除き、邪魔にならないように注意してください。1つの計量皿からすべてのセクションをPCTFEフィルムシートに移動した後、2枚目のPCTFEシートを最初のPCTFEシートの上に置き、2枚のシートの間にティッシュと樹脂を挟みます。

インキュベーター内で55〜60°Cで3日間重合します。その後、組織は極薄切片化および超微細構造検査の準備が整います。次の図は、明視野モードと蛍光モードを使用した 1 つの海馬切片のデュアルイメージングを示しています。

関心のある領域とレイヤーは、明視野の下で視覚化されます。一方、α-βプラークは、340〜380ナノメートルの範囲でUVフィルターを使用して首尾よく局在化します。この画像は、IBA1 の免疫染色を事前にインテージする前の海馬切片を示しています。

目に見えるプラークは点線で囲まれています。この画像は、IBA1の免疫染色と透過型電子顕微鏡のプロセッシングをプレインディングした後の同じ切片を示しています。点線で囲まれたプラークは、電子顕微鏡の組織処理後もまだ見えることに注意してください。

このプロトコルをマスターすると、適切に実行すれば1週間で完了できます。この手順を試みる際には、サンプルの品質に影響を与える汚染やその他の構造劣化の可能性を減らすために、すべてのステップを厳密に行う必要があることを覚えておくことが重要です。オスミウムの取り扱いは非常に危険であるため、この手順を実行する際には、白衣や手袋を着用するなどの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。

実験終了後の使用後は、必ず施設のガイドラインに従って廃棄してください。