Name: 蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列その場でハイブリダイゼーション（FISH）線虫（Caenorhabditis elegans） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学ぶFISH法によるCaenorhabditis elegansのテロメア長と数の定量化。24時間以内で可視化・定量化でき、がん研究や細胞老化のメカニズム解明に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

突然変異型ワーム株は、Caenorhabditis遺伝学センターから提供されました。本研究は、韓国保健福祉部(HI14C1277)の資金提供を受けた韓国健康産業開発院(KHIDI)を通じた韓国医療技術研究開発プロジェクトの助成を受けて行われました。

PCRによりジゴキシゲニンdUTPで1標識プローブ<ol><li>以前に13を説明したようにジゴキシゲニンdUTPをを含む10×dNTPミックスでPCRラベリングを行います。 </li><li>製造者の指示に従ってスピンカラム精製を用いてPCR産物を精製します。 <ol><li>プローブはより短い200bpのであれば、反応混合物からのスピンカラムクロマトグラフィーではなく、スピンカラム精製で無料ジゴキシゲニンdUTPをを削除します。 </li></ol></li></ol> 2.準備ポリリジン被覆スライド注：全体の手順は、約2時間かかります。ステップのほとんどは、乾燥工程を除いて、室温で行われます。 <ol><li>スライドのクリーニング<ol><li>プラスチック容器にスライドを置き、簡単に蒸留水（DW）でスライドをすすぎます。水を除去し、1％のガラスクリーナーを含むDWで容器を満たします。 </li><li>室温（RT）で50 rpmで15分間スライドを攪拌します。 DW 3でスライドを洗浄室温で5分間、回。 </li><li>攪拌しながら15分間、70％エタノールでスライドを洗浄します。 70％エタノールを捨て、15分間65℃で乾燥ブロックと空気乾燥でスライドを配置します。 </li></ol></li><li>マルチウェルガラススライドのポリリジンコーティング 注：それは染色手順を通じてサンプルの接着性を提供するので、スライドガラスのポリリジンコーティングは、重要なステップです。不十分なコーティングされたスライドは、サンプルが失われます。 <ol><li>蒸留水で（w / v）の0.01％にポリリジン原液を希釈します。きれいなガラススライドのウェルにポリリジン（w / v）の希釈した0.01％の20μLを加えます。 </li><li>室温で5分間、ガラススライドをインキュベートします。 </li><li> 1時間65℃で乾燥ブロックと空気乾燥でスライドを置きます。 </li><li>埃ボックスにポリリジンスライドを保管してください。 </li></ol></li></ol>スライドガラス上のワームの3.固定（図1） <ol><li> FISHのための準備胚 注：収穫のワームをすべてト​​ンの前に彼細菌食品は、顕微鏡下で増殖培地を見て消費されます。飢餓は、成虫の産卵を低減し、卵の孵化を増加させます。詳細な方法は、14,15に記載されています。 <ol><li>標準的な方法14に従って50ミリメートルペトリ皿にワームを育てます。 </li><li>すべての細菌の食物が消費された後、スパチュラで四半期の寒天培地をカット。汚染を防止するために切断する前へらを滅菌します。 </li><li> 100ミリメートル線虫の増殖培地（NGM）プレート上の寒天のすべてのピースを置きます。新鮮な細菌性食品に到達するためにワームのために逆さまに寒天片を回します。 </li><li> 48〜72時間後、M9バッファーでワームを収集します。 NGMプレート上のM9緩衝液5ml - 3を追加します。ワームを洗浄するNGMの表面上にピペットM9バッファー。 </li><li>ワームと液体を収集し、15mlチューブに追加します。 注：30％ショ糖溶液中での収穫、遠心ワーム後の寒天の破片がある場合。破片をペレット化しているが、ワームは、上のフロート表面。 </li><li> 15ミリリットルにボリュームを補うためにM9のバッファを追加します。 3分間300×gで遠心分離することによってワームをペレットし、M9バッファーの大部分を除去。このステップをさらに2回繰り返します。 注：ワームはまだ遠心分離後、浮遊している場合は、値= 1に遠心分離機のブレーキレベルを設定します。 </li><li>吸引しM9バッファー。ワームに漂白液を追加します。ワームの0.5ミリリットル当たり、次亜塩素酸の2ミリリットルをDWの6.5ミリリットルを追加し、5 M KOHの1ミリリットル。 </li><li> 50 rpmで3分間室温で揺らしながらワームをインキュベートします。 15秒間ボルテックスワームは、機械的にワームをせん断し、卵を露出させます。 </li><li>漂白時に解剖顕微鏡下で管を観察します。ワームは半分に切断され、卵が放出されていることを確認します。成人の体のほとんどが解散されたときは、15ミリリットルにボリュームを補うためにM9のバッファを追加します。 </li><li> 3分間300×gで遠心分離します。吸引しM9の大部分を、15 mlにボリュームを構成するために、新鮮なM9バッファーを追加します。繰り返し洗浄ステップ3回。 注意：彼らは漂白工程を妨げるとして、ワームの過剰な量を使用することは避けてください。未満8分洗浄まで、全体的な反応時間をおいてください。過漂白卵は強い自家蛍光を生成します。 </li><li> 200μlの2％PFAを行うための4％パラホルムアルデヒド（PFA）を200μlまでのポリソルベート20（PBST）を含むリン酸緩衝生理食塩水を加えます。 注意：PFAは発癌性であるため、PFAを使用する前に、防護服、手袋、アイシールドを着用してください。 </li><li>ポリリジンコートスライドのウェルに2％PFAで卵の40μLを加えます。 </li><li>加湿チャンバー内でスライドを置き、RTで15分間インキュベートします。スライドを内側に配置された直後の湿潤チャンバーを閉じます。 注：固定された状態で卵がスライドの底に沈みます。 </li></ol></li><li> FISHのための解剖生殖腺の準備<ol><li>収穫成虫はM9緩衝液1mlをピペットで50ミリメートルNGMプレート上で増殖させました。細菌性食品の前に収穫ワームが枯渇しています。 </li><li>任意の細菌のウィットからワームを洗いますH M9緩衝液、2回。 注：残留細菌はポリリジン被覆スライドに付着解剖生殖腺を妨害し得ます。 </li><li> 300×gで遠心分離することによりワームをペレット。 M9を取り外し、マイクロピペットによって空のNGMプレートにワームを転送します。 </li><li>ポリリジン処理したスライドのほかに2mMのレバミゾールを含むM9緩衝液30μlを追加します。 </li><li> 1ミリリットルチューブにM9バッファー500μlのを追加します。口のピペットでワームを転送するために、このバッファを使用します。 </li><li> M9緩衝液を含む1mLのチューブに毛管を配置することによって、M9緩衝液で口ピペットの先端を満たします。 </li><li>ワームの頭が口のピペットに入るように解剖顕微鏡下で、ちょうど大人のワームやドラッグ口のピペットの頭の前で口のピペットの先端を置きます。ワームのヘッドが先端に入ると、ワームの本体全体をチップ内に描画されます。 </li><li>口のピペットを用いて、ポリリジンコートスライドにワームを転送します。 </li><li>のかみそり、カットを使用して、頭やスライド上のワームの尾の先端F。ワームが切断されると、生殖腺が飛び出します。生殖腺は、スライドに固執します。 <ol><li> 1つのウェル中に少なくとも30ワームを準備します。複数のウェルをさらに30ワームのために使用することができます。 </li></ol></li><li>加湿チャンバー内でスライドを入れて、口のピペットでM9バッファーを吸引します。 </li><li>加湿チャンバー内で室温で15分間2％PFAを20μlを添加することにより、サンプルを修正してください。 </li></ol></li></ol> 4.固定および透過処理<ol><li>ドライアイス上にアルミニウムブロックを配置し、ディープフリーザーに保管（-80°C）。 -20℃に保管し、メタノールおよびアセトン。 </li><li> PFA固定工程3.1.15または3.2.11た後、固定液の〜5μLを残しマイクロピペットを用いて固定液を除去します。 </li><li>試料スライド上の別のポリリジンコートスライドを入れてください。解決策が過剰である場合はペーパータオルで固定液を除去します。彼らは一緒に立ち往生しているしたら、スライドを移動しないでください。 </li><li>スライドを凍結少なくとも15分間、アルミブロック上。 注：サンプルは、少なくとも2のために保存することができます - 3日間。 </li><li>スライドが凍結されている間、氷上で冷メタノールおよびアセトンを含むjarを置きます。 </li><li>スライドを取り出し、サンプルを凍結クラックするためにそれらをねじります。上部のスライドを捨てます。すぐに5分間氷冷メタノール中にスライドを浸します。 </li><li> 5分間氷冷アセトンにスライドを転送します。 </li><li>残留固定剤を除去するために、5分間、スライドをPBSTで3回洗浄します。次のステップに進むか、4℃で、100％エタノールでスライドを保存します。 注：サンプルは、少なくとも2のために保存することができます - 3日間。 </li></ol>固定された細胞の5ハイブリダイゼーション<ol><li> （PBSTはを10μg/ mlのRNase Aを含む）のRNase溶液20μlを追加します。 37℃で1時間湿潤チャンバー内のスライドをインキュベートします。 </li><li> 15分ごとに（2×SSCT）ポリソルベート20で2回生理食塩水とクエン酸ナトリウムで二回スライドを洗浄します。 </li><li> 20を追加します。ハイブリダイゼーション溶液μlの37℃のインキュベーターで加湿チャンバーを置きます。 1時間後、ピペッティングによりハイブリダイゼーション溶液を除去します。 </li><li>ハイブリダイゼーション溶液を取り外す前に、プローブを準備します。プローブが二本鎖DNAである場合、乾燥ブロック上95℃で5分間加熱することにより、プローブを変性させます。加熱後、簡単に氷の上にプローブを冷却します。 </li><li>サンプルにプローブを含むハイブリダイゼーション溶液10μlを加えます。 2,000及びDIG標識プローブのための、1の比率で使用濃度：200 PNAプローブ、1の比で使用濃度について。カバーガラスでサンプルをカバーしています。 </li><li>ヒートブロック（80℃）で水に浸した紙タオルを置きます。湿度と温度を維持するためにヒートブロック上のプラスチックの箱のカバーを置きます。 </li><li>加熱ブロックの温度（80℃まで）安定した後、加熱されたペーパータオルの試料スライドを配置し、プラスチック製の箱のカバーを有するサンプルをカバーします。 3分間サンプルを変性。 </li><li>株式会社一晩37℃で湿潤チャンバー内のスライドをubate。 </li></ol> 6.洗浄および免疫蛍光<ol><li> 37°Cへのハイブリダイゼーション洗浄溶液（2×SSC、50％ホルムアミド）をウォームアップ。 </li><li>室温で5分間二回PBSTでサンプルを洗ってください。カバーガラスを外します。 </li><li> 30分間、37℃でハイブリダイゼーション洗浄溶液中で試料を洗浄します。 </li><li> RTでPBSTで試料スライドを3回洗浄します。注：室温で湿潤チャンバー内の後続のすべての手順を実行します。 </li><li>ブロッキング溶液の20μlを添加して、湿潤チャンバー中、室温で1時間インキュベートします。 </li><li>ブロッキング溶液を外し、FITC結合抗ジゴキシゲニン抗体溶液（1：200）を追加し、室温でまたは4℃で一晩3時間。 </li></ol> 7.取付け・観測<ol><li> 15分間ずつPBSTで2回サンプルスライドを洗浄します。 </li><li> DAPIでマウント溶液10μlを加えます。カバーガラスとプレスを静かに置きます。余分な溶液を除去しますペーパータオルで。 </li><li>取付溶液の蒸発を防ぐために、マニキュアでカバーガラスのエッジをシール。 </li><li>共焦点顕微鏡下で観察します。高いバックグラウンドを持つ胚を除外します。 20核 - 4でフィールドに焦点を当てています。 </li><li> 100X対物レンズで、製造元の指示に従って画像を撮影します。 注：FITCのための488nmレーザーで、Cy3のための555 nmレーザーで、DAPI用の405 nmのレーザーを試料にエキサイト。 </li></ol>テロメアシグナルの8定量注意：以前に16記載のように定量化が行われました。比較されるすべての画像は、露光時間と光源を含む同じ設定で撮影する必要があります。 <ol><li> tifファイル形式で画像をエクスポートします。 </li><li>画像解析ソフトウェアをダウンロードし、インストールします。 </li><li>画像解析ソフトウェアを実行し、ボタンを同意する]をクリックします。 </li><li>オープンボタンをクリックします。イメージファイルをダブルクリックすることにより、テロメアFISHで画像を開きます。 </li><li>クリック[編集] - [選択処理領域]、左クリックしてドラッグすることで、目的とする選択領域。すべての非特異的な染色を除外します。 </li><li> [対策]をクリックして - 、[光学密度を見つけ]テロメア信号とチャンネルを選択し、.txtファイルに結果を保存するファイル名を入力します。 注：結果の列の順序は、次のようにスポットの蛍光、スポットとスポットのエリアの背景強度を。 </li><li>値をコピーし、スポットの蛍光からのスポットのバックグラウンド強度を差し引きます。値は、現在、統計的に分析することができます。 </li></ol>

<ol><li>Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+cells+with+no+detectable+telomerase+activity.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-Moscow%22%5BJournal%5D)">Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review.</a> Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).</li>
<li>Seo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+maintenance+through+recruitment+of+internal+genomic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions.</a> Nat Commun. 6, 8189(2015).</li>
<li>Cesare, A. J., Reddel, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+lengthening+of+telomeres%3A+models%2C+mechanisms+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications.</a> Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).</li>
<li>Meier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((trt-1+is+the+Caenorhabditis+elegans+catalytic+subunit+of+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase.</a> Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).</li>
<li>Cawthon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+measurement+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere measurement by quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 30, 47(2002).</li>
<li>Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+of+longevity+and+telomere+length+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans.</a> PLoS Genet. 1, 30(2005).</li>
<li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Specific+Sequences+among+DNA+Fragments+Separated+by+Gel-Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98, 503(1975).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+extension+by+telomerase+and+ALT+generates+variant+repeats+by+mechanistically+distinct+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes.</a> Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).</li>
<li>Cheung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+telomere+length+revealed+by+single+telomere+length+analysis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).</li>
<li>Shtessel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+POT-1+and+POT-2+repress+telomere+maintenance+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways.</a> G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).</li>
<li>Duerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook+%28The+C.+elegans+Research+Community%29%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry.</a> WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).</li>
<li>Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhillips%2C+CM+%22Meiosis%3A+Volume+2%2C+Cytological+Methods%22">Meiosis: Volume 2, Cytological Methods</a>. , Springer. 171-195 (2009).</li>
<li>Emanuel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+system+for+synthesis+of+non-radioactive+nucleic+acid+hybridization+probes+using+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR.</a> Nucleic acids research. 19, 2790(1991).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J Vis Exp. , e4019(2012).</li>
<li>Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurements+using+digital+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy.</a> Cytometry. 36, 267-278 (1999).</li>
<li>Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shelterin+protein+POT-1+anchors+Caenorhabditis+elegans+telomeres+through+SUN-1+at+the+nuclear+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery.</a> J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).</li>
<li>Lee, M. H., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+in+situ+hybridization+of+dissected+gonads%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">RNA in situ hybridization of dissected gonads.</a> WormBook. , 1-7 (2006).</li>
<li>Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-well+version+of+in+situ+hybridization+on+whole+mount+embryos+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).</li>
<li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+%28Q-FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH).</a> Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14(2001).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

私たちのプロトコルの主な利点は、細胞構造の形態に目立つダメージのない手続きの簡単さです。いくつかのステップは、C。のために最適化されましたこのプロトコルでFISH エレガンス 。成功FISHのための重要なステップは、プローブのラベリング、胚および浸透の固定を含みます。ジゴキシゲニンdUTPを標識方法は、PCRまたはニックトランスレーションにより使いやすい標識法を提供します。長い標的配列にラベルを付けるには、ニックトランスレーションが好ましいです。この場合、プローブは、プローブの侵入を容易にするために、適切な制限酵素で消化されるべきです。ビオチン標識プローブは、細胞質からのバックグラウンド信号を過剰に産生されているためビオチン-dUTPタグは推奨されません。内因性ビオチンブロッキング試薬が市販されているが、それは行われませんでした。 このプロトコルは、効率的な定量化のための細胞の密度を増加させるために、単離された胚を使用します。 Cの腸内核。エレガンスは、サイズが大きく、過剰な数と体細胞核の残りの部分に比べてテロメアスポットの強度...

テロメアは、異常な融合と分解か​​ら染色体末端を保護します。哺乳類テロメアは、Gリッチ六量繰り返し、TTAGGG、およびshelterin複合体で構成されています。線虫のテロメア反復配列は、哺乳動物（TTAGGC）のものと同様です。ほとんどの真核生物は、それらの染色体の末端にテロメアリピートを追加するには、テロメラーゼを利用します。しかし、10 -癌細胞の15％がテロメアの代替長くする（ALT）3として知られているテロメラーゼ独立した機構を利用します。以前、我々はテロメアとTALTという名前のその関連配列は、重要な無菌性2を生き延びテロメラーゼ変異系統のテロメアで増幅されたことを報告しました。 テロメア長は、定量的PCRにより、または合計テロメア4,5,6,7-の平均長さを提供し、サザンブロットによって測定しました。全ゲノム配列データにテロメアリピートの回数を読むまた、全テロメア内容8の指標です。罪が、GLEテロメア長解析（STELA）は、それがテロメア9の空間的な情報を提供することができない、単一のテロメアの長さを提供することができます。 POT-1 :: mCherryをレポータータンパク質が生体内でテロメアの空間的な情報を提供していますがPOT-1は、タンパク質10を結合一本鎖テロメアであるとして、それは、二本鎖テロメアの長さを表すことはできません。 上述の方法は、反復配列の平均の情報を提供するが、 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、染色体規模量、対象の個々の配列の空間的なパターンを観察することができます。代わりにDNAの精製、組織または細胞は、FISHにおける天然の空間情報を保存するために固定されています。このように、FISHは、テロメアリピートなどの個々の反復配列の観察のための定量的および定性的な両方のツールです。 このプロトコルは、両方のteloの同時検出のための効率的な方法を提供します前述の方法11,12からの改良に基づく単なるおよびその他の繰り返し。C.エレガンスの幼虫や成虫は非常に分化した細胞と多細胞生物です。細胞の不均一性は、テロメアスポットの多数の定量分析に妨げます。分析した細胞の数を最大にするために、胚を単離し、FISH用ポリリジン被覆スライド上に広げています。また、このプロトコルは、免疫蛍光法と組み合わせることができます。 プロトコルが動作していることの証明として、我々は、2つの異なる反復配列を観察し、定量化することが可能であることを示します。 TALT1に対するDNAプローブは、ジゴキシゲニンdUTPをを取り入れたシンプルなPCRで生成しました。このTALT1プローブおよび蛍光標識されたテロメアPNAプローブを同時にハイブリダイズさせました。その後、ジゴキシゲニンは、標準的な免疫蛍光法によって検出しました。ここではTALT1はTRT-1にテロメアと共局在代表画像を提示します</eメートル&gt;生存者。

<table><tbody><tr><td>PNAプローブ</td><td>PANAGENE</td><td>カスタムオーダー</td><td></td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン-フルオレセイン、Fabフラグメントロ</td><td>シュ</td><td>11207741910</td><td>PBSTで希釈した1:200を使用</td></tr><tr>ジ<td>ゴキシゲニン-dUTP</td><td>ロシュ</td><td>11573152910</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-6148</td><td>数滴のNaOHを含むDWで加熱することにより、4%パラホルムアルデヒドを調製します。0.1ボリュームの10x PBSを追加します。</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Hybridizaiton溶液</td><td></td><td></td><td>3x SSC、50% ホルムアミド、10% (w/v) デキストラン硫酸塩、50 &#956;g / mlヘパリン、100 &#956;g/ml 酵母 tRNA , 100 &#956;g / ml超音波処理されたサケ精子DNA</td></tr><tr><td>ハイブリダイザイトン洗浄液</td><td></td><td></td><td>2x SSC、50%ホルムアミド</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>BIONEER</td><td>C-9012</td><td>有毒</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>カルロエルバ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>カルロエルバ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>は、ストック溶液デキストラン硫酸塩のために10mg / mlを作ります</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>67578</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td></td><td>1 L DW 用 : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4&#8226;7H2O、2.4 g KH2PO</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1x PBS、0.1% tween-20</td></tr><tr><td>ポリソルベート 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-2287</td><td>商品名はTween-20</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine溶液(0.1% w/v)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8920</td><td>M9</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>を使用する前に新鮮な0.01%w/v溶液を準備します3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl、1 ml 1 M MgSO4、H2O to 1 L</td></tr><tr><td>漂白液</td><td></td><td></td><td>20% 次亜塩素酸ナトリウム、 0.5 M KOH</td></tr><tr><td>抗体バッファー</td><td></td><td></td><td>1x PBST、1 mM EDTA、0.1% BSA、0.05% アジ化ナトリウム (毒性)</td></tr><tr><td>ブロッキング溶液</td><td></td><td></td><td>5% ウシ血清アルブミン (BSA) を含む抗体バッファーillustra</td></tr> <tr><td>Microspin G-50</td><td>GE healthcare</td><td>27-53310-01</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td></td><td></td><td>1 L を作るには、1 L で 175.3 g の NaCl、88.2 g のクエン酸ナトリウム、H2O から 1 L、 pHを7.0に調整</td></tr><tr><td>2x SSCT</td><td>2x SSC</td><td></td><td></td>, 0.1% tween-20</tr><tr><td>10x ジゴキシゲニン-dUTPミックス</td><td></td><td></td><td>1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP</td></tr><tr><td>PCR精製カラム</td><td>Cosmo genetech</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>ガラスクリーナー / ULTRA CLEAN</td><td>Dukssan 純薬品</td><td>8AV721</td><td></td></tr><tr><td>マルチウェルスライドガラススライド</td><td>MP バイオメディカル</td><td></td><td></td>96041205</tr><tr><td>線虫増殖培地</td><td></td><td></td><td>1 L、NaCl 3 g、寒天17 g、ペプトン2.5 g、H2Oを974 mlに作製します。1 mLの1 M CaCl2、4 mg/mlコレステロール1 mLをエタノールに浸し、1 mLの1 M MgSO4、25 mlの1 M KPO4を加えます。</td></tr>対物レンズには<tr><td>、Levamisole</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>196142</td><td></td></tr><tr><td>Razor</td><td>Feather</td><td>blade No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Enzynomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microsope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>EC Plan-Neofluar 100Xを使用しました。</td></tr><tr><td>湿ったチャンバーDW</td><td></td><td></td>画像解析ソフトウェア<td>に浸したペーパータオルで満たされたプラスチックボックス</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ピーター・ランズドープ博士</td><td>TFL-telo</td><td><a href="http://www.flintbox.com/public/project/502">http://www.flintbox.com/public/project/502</a></td></tr></tbody></table>

蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列<em&gt;その場で</empnaプローブのある&gt;ハイブリダイゼーション（fish）<em&gt;線虫（caenorhabditis elegans）</em

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

テロメアは、染色体の末端を異常な融合と分解から保護するリボ核タンパク質構造です。テロメアの長さは、テロメラーゼまたはテロメアの代替延長(ALT)として知られる代替経路によって維持されます1。最近、C.エレガンスはテロメアとALT2の研究のための多細胞モデル生物として浮上しています。ゲノム内の反復配列の可視化は、テロメアの生物学を理解する上で非常に重要です。テロメアの長さは、テロメア制限フラグメントアッセイまたは定量的PCRで測定できますが、これらの方法では平均化されたテロメアの長さしか得られません。それどころか、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)は、細胞内の個々のテロメアの情報を提供することができます。ここでは、蛍光in situハイブリダイゼーションによりC.エレガンスのテロメア長を決定する方法のプロトコルと代表的な結果を提供します。この方法は、形態に目立った損傷を引き起こさない、シンプルでありながら強力なin situ手順を提供します。蛍光標識ペプチド核酸(PNA)とジゴキシゲニン-dUTP標識プローブを用いることで、C.エレガンスの胚と生殖腺におけるテロメアリピートとALT(TALT)のテンプレートという2つの異なる反復配列を可視化することができました。

これは、以前にALTの生存者は、内部ローカライズ」ALTのテンプレート「テロメア維持2用（TALT）配列を複製することによって、低周波では、テロメラーゼ欠損変異体、TRT-1（ok410）から出てくることが報告されました。 PNAプローブを使用して、我々は解剖生殖腺（ 図2A）にテロメアを可視化することができました。かすかなテロメア信号は、TRT-1（ok410）とALTの生存者の両方で検出されました。ファジー信号は、それらが自家蛍光ではないかもしれないことを示唆している、唯一のDAPIと重なりました。間質テロメア様反復（ITR）は、一貫してCの研究にTRFアッセイで観察されますエレガンステロメア4,10。 PNAプローブの高い特異性を考慮すると、それらは、ITRは、ゲノム全体に分散される可能性があります。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

私たちは、反復配列の観察と定量化のために、線虫Caenorhabditis elegansの生殖腺と胚における蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)の簡潔な手順を報告します。 私たちは、テロメアリピートとテロメアの代替的延長のテンプレート(TALT)という2つの異なる反復配列の観察と定量化に成功しました。

蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列<em&gt;その場で</emPNAプローブのある&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

この蛍光in situハイブリダイゼーション法の全体的な目的は、C. elegansにおけるテロメアの数と長さを簡潔に解析することです。この手法は、腫瘍の再発、テロメアの代替延長、および細胞老化に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、手順が簡潔であり、24時間以内にテロメアを可視化および定量化できることです。デブリを含まない少量の液体培地とともに、抱卵した成虫を15 mLチューブに回収します。次に、以下の手順で虫体を3回洗浄します。M9バッファーを加え、全量を15 mLにします。次に、チューブを300 Gで3分間遠心分離し、線虫のペレットの上にある上清を捨てます。その後、この工程を繰り返します。遠心分離後に線虫が浮遊している場合は、遠心分離機のブレーキを弱めてください。3回目の洗浄後、虫体を5 millilitersのM9に浸したままにします。次に、6.5 millilitersの蒸留水、2 millilitersの次亜塩素酸塩、および1 milliliterの5 molar水酸化カリウムを加えます。この漂白液中で、50 RPMの撹拌を加えながら3分間インキュベートします。その後、ボルテックスミキサーで虫体を破砕し、卵を放出させます。解剖顕微鏡下で、放出された卵を確認します。まだ放出されていない場合は、最大8分までインキュベーションを継続してください。線虫の大部分が溶解し、卵が遊離している場合は、チューブにM9を15 mLまで満たし、線虫の洗浄時と同様に、卵を3回洗浄します。M9の大部分を除去した洗浄後の卵に、PBSTを加えて容量を500 microlitersにし、続いて4%PFAを500 microliters加えます。次に、2%PFAに入った卵の40 microliter分注液を、ポリリシンコートスライドのウェルにロードします。その後、スライドを加湿チャンバーに移し、室温で15分間インキュベートします。本プロトコルのために、ドライアイス上で-80°Cに冷却したアルミブロックを用意します。また、メタノールとアセトンを20°Cで保存しておきます。固定工程が完了した後、スライドからPFA溶液の大部分を取り除き、約5µLだけ残します。次に、2枚のポリリシンコートスライドのコート面同士が密着し、組織がウェル内に閉じ込められるように、各サンプルスライドの上に2枚目のポリリシンコートスライドを重ねます。固定液が過剰な場合は、ティッシュで拭き取ってください。その後、スライドを冷えたアルミニウムブロック上に少なくとも15分間置いて凍結させます。その間に、スライドガラス用にメタノールとアセトンのバスを氷上で準備します。スライドが凍結したら、1枚をひねってサンプルを凍結破砕します。上のスライドを廃棄し、下のスライドを氷冷メタノールに5分間浸します。すべてのサンプルに対してこの操作を行います。フリーズクラッキングを行うことで、硬い卵殻を透過してプローブや抗体を浸透させることができます。フリーズクラッキングが適切に行われていれば、両方のスライド上に卵が観察されるはずです。メタノールに少なくとも5分間浸した後、スライドを冷えたアセトンに移し、5分間処理します。さらに5分後、サンプルをPBSTに3回、1回につき5分間浸漬させます。PBSTでの洗浄後、スライドは100%エタノール中で4 °Cで数日間保存することが可能です。次に、サンプルウェルに20 µLのRNase溶液を加え、加湿チャンバー内で37 °Cで1時間インキュベートします。次に、2x SSCTで2回、1回あたり15分間スライドを洗浄します。2回の洗浄後、サンプルに20 µLのハイブリダイゼーション溶液を加え、加湿チャンバー内で37 °Cで1時間インキュベートします。その間に、二本鎖DNAプローブを調製します。95°Cで5分間加熱して変性させた後、短時間氷上で冷却します。1時間後、ハイブリダイゼーション溶液を吸引除去し、プローブ溶液を加えます。これ以降の工程では、サンプルを遮光してください。プローブを添加した後、サンプルをガラスカバースリップで覆います。次に、80°Cのヒートブロック上に加湿チャンバーを作成します。ヒートブロックが80 °Cに復帰して安定したら、サンプルスライドを加熱チャンバーに入れ、3分間変性させます。次に、処理したすべてのスライドを、加湿したチャンバー内で37 °Cで一晩インキュベートします。一晩のインキュベート後、サンプルを室温のPBSTで5分間洗浄します。準備として、洗浄の1時間前にハイブリダイゼーション溶液を37°Cまで温めておきます。次に、スライドをハイブリダイゼーション洗浄液を入れたジャーに入れ、37°Cで30分間インキュベートします。ハイブリダイゼーション溶液を除去するため、サンプルを室温のPBSTで15分間洗浄します。この操作を3回繰り返します。最後のPBST洗浄液を吸引後、各サンプルに20 µLのブロッキング溶液を加え、加湿チャンバー内で室温・暗所で1時間インキュベートします。その後、ブロッキング溶液を吸引し、1:200に希釈したFITC標識抗digoxigenin抗体溶液に置換します。スライドをカバーし、室温・暗所で3時間インキュベートします。抗体染色後、サンプルをPBSTで2回洗浄します（1回につき15分間、暗所で行います）。次にPBSTを吸引し、DAPIを含む封入剤10 µLに置き換えます。カバーガラスを被せ、余分な溶液を吸い取ります。最後に、カバーガラスの縁をネイルポリッシュで密封し、蛍光顕微鏡でサンプルの観察を行います。PNAプローブを用いて、テロメア十分変異の生存動物のテロメアを観察しました。生殖腺において、核あたりのテロメア数は定量可能です。テロメア信号がTALT1信号と同局在していたことは、TALT1がテロメアなしでの生存を担っているという考えを支持しています。テロメア信号の強度は、ソフトウェアを用いて比較しました。テロメア欠損変異体の作製に使用した親株よりも、ALTサバイバーにおいてシグナルが強く認められました。パラホルムアルデヒドおよびホルムアミドの使用は非常に危険であるため、この操作を行う際は、常に手袋を着用するなど、十分な注意を払ってください。

observation-quantification-telomere-repetitive-sequences-using

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

線虫を維持し、伝播の容易さ...

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

ここでは、固定された無傷の線虫のゲノムDNAを視覚化するために使用される技術について説明します。このビデオには、未受精のC.エレガンス卵子のクロマチンをカウントするプロトコルの例が含まれています。...

エタノール固定とDAPI染色:C.エレガンスのDNAを可視化する方法

出典:Pigazzini, M. L., et.al. 老化におけるアミロイド構造の特性評価 C. Elegans 蛍光寿命イメージングを使用。 J. Vis. Exp.

線虫ニューロンにおけるPolyQタンパク質凝集の蛍光寿命イメージング

ここでは、C.エレガンスの発生過程を追跡し定量化する方法を示しています。提示されている方法は、簡単に実装できるオープンソースのツールに基づいています。3D細胞形状モデルの再構築方法、細胞内構造の手動追跡方法、皮質収縮流の解析方法などを実演します。...

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

ここでは、光漂白後の線虫 カエノールハブディティス・エレガン...

カエノハブディティス・エレガンスにおけるデノボタンパク質合成率の評価

蛍光標識End結合タンパク質を用いて 生体内で 動的微小管をイメージングするプロトコルが提示された。...

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

細胞外細菌やオルセーウイルスや微胞子虫(真菌)などの細胞内病原体を含む腸内微生物は、野生の カエノラブディティス 線虫と関連していることがよくあります。この記事では、 C.エレガンス...

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)による カエノラブディティスエレガンス 腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

このプロトコルはC .のelegansのRNAi誘導されたサイレンシングおよび準のchromatinの修正のエピジェネティックな遺伝を調査するRNAの干渉およびChIPの試金を記述する。...

線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析

ここでは、広視野顕微鏡画像内の個々のワームを自動セグメンテーションするために開発した深層学習システムであるSegElegansを、その後ImageJなどの画像解析ソフトウェアで使用するために効果的に活用する方法を説明します。オンラインとオフラインの両方でシステムの利用方法を提供します。...

SegElegansを用いたC .エレガンス 蛍光画像の自動解析

学ぶFISH法によるCaenorhabditis elegansのテロメア長と数の定量化。24時間以内で可視化・定量化でき、がん研究や細胞老化のメカニズム解明に有用です。

蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列

さらに動画を探す