蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列その場でハイブリダイゼーション（FISH）線虫（Caenorhabditis elegans）

この蛍光in situハイブリダイゼーション技術の全体的な目標は、C.Elegansのテロメア数と長さを簡潔に分析することです。この方法は、腫瘍の再生、テロメアの代替的延長、および細胞老化に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、手順が簡潔で、テロメアを24時間以内に視覚化および定量化できることです。

妊娠した成虫を、破片のない少量の液体媒体で15ミリリットルのチューブに集めます。次に、次のようにワームを3回洗います。M9バッファーを追加して、合計容量を15ミリリットルにします。

次に、チューブを300 Gで3分間回転させ、溶液をワームのペレットの上に捨てます。次に、プロセスを繰り返します。遠心分離後にワームが浮いている場合は、遠心分離機のブレーキを軽くします。

3回目の洗浄後、ワームに5ミリリットルのM9を残します。次に、6.5ミリリットルの蒸留水、2ミリリットルの過塩素酸塩、および1ミリリットルの5モルの水酸化カリウムを追加します。ワームをこの漂白液中で50RPMの攪拌で3分間インキュベートします。次に、ワームを渦巻いて剪断し、卵を解放します。

解剖顕微鏡で、放出された卵を探します。まだリリースされていない場合は、インキュベーションを続けるか、最大8分間続けます。ワームがほとんど溶解し、卵が空いている場合は、チューブをM9で15ミリリットルまで満たし、以前にワームを洗浄したのと同じように卵を3回洗浄します。

洗浄した卵に、M9の大部分を取り除いた状態で、PBSTで容量を500マイクロリットルまで満たし、次に500マイクロリットルの4%PFAを追加します。次に、2%PFA中の40マイクロリットルの卵をポリリジンコーティングスライドのウェルにロードします。次に、スライドを加湿チャンバーに移し、室温で15分間インキュベートします。

このプロトコルでは、摂氏80度で保存したドライアイスの上にアルミニウムブロックを用意します。また、メタノールとアセトンは摂氏20度で保存してください。固定ステップが完了したら、スライドからほとんどのPFA溶液を取り除き、約5マイクロリットルを残します。

次に、2番目のポリリジンコーティングされたスライドを各サンプルスライドの上に置いて、2つのコーティングされた表面がくっつき、組織をウェルに閉じ込めます。固定剤が過剰にある場合は、ティッシュで拭き取ります。次に、スライドを冷たいアルミニウムブロックの上に少なくとも15分間置いて凍結します。

その間、スライド用の氷上にメタノールとアセトンの浴を準備します。スライドが凍結したら、片方をひねってサンプルのクラックを凍結します。上部のスライドを廃棄し、下部のスライドを氷冷したメタノールに5分間浸します。

これをすべてのサンプルに対して行います。凍結分解により、硬い卵殻を通じてプローブと抗体が浸透します。卵がうまく凍結され、割れると、両方のスライドに卵を見ることができます。

メタノールで少なくとも5分間過ごした後、スライドを冷たいアセトンに5分間移動します。さらに5分後、サンプルをPBSTに3回、浴ごとに5分間浸します。PBST洗浄後、スライドは摂氏4度で100%エタノールに数日間保存できます。

続行するには、20マイクロリットルのRNase溶液をサンプルウェルに加え、摂氏37度の加湿チャンバーで1時間インキュベートします。次に、スライドを2x SSCTで2回、1回の洗浄につき15分間洗浄します。2回の洗浄後、20マイクロリットルのハイブリダイゼーション溶液をサンプルに加え、加湿チャンバー内で摂氏37度で1時間インキュベートします。

その間、二本鎖DNAプローブ用のプローブを準備します。摂氏95度で5分間変性させた後、氷の上で短時間冷やします。1時間後、ハイブリダイゼーション溶液を吸引し、プローブ溶液を添加します。

このステップから、サンプルを光から保護します。プローブを追加した後、サンプルをガラスカバースリップで覆います。次に、摂氏80度のヒートブロックに加湿チャンバーを作ります。

ヒートブロックが摂氏80度まで安定したら、サンプルスライドを温めたチャンバーに入れ、3分間変性させます。次に、処理されたすべてのスライドを摂氏37度の加湿チャンバーで一晩インキュベートします。一晩インキュベーションした後、サンプルをPBSTで室温で5分間洗浄します。

準備として、ハイブリダイゼーション溶液を洗浄の1時間前に摂氏37度に温めます。次に、スライドをハイブリダイゼーション洗浄溶液の瓶に入れ、摂氏37度で30分間インキュベートします。ハイブリダイゼーション溶液を除去するには、サンプルをPBSTで室温で15分間洗浄します。

これを3回行います。最後のPBST洗浄液を吸引した後、各サンプルに20マイクロリットルのブロッキング溶液を加え、室温の加湿チャンバーで暗所で1時間インキュベートします。次に、ブロッキング溶液を吸引し、1〜200でFITC標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液と交換します。

スライドを覆い、暗所で室温で3時間インキュベートします。抗体染色後、サンプルをPBSTで2回、暗所で15分間洗浄します。次に、PBSTを吸引し、DAPIを含む10マイクロリットルの取り付け液と交換します。

カバーガラスを貼り、余分な溶液を吸い取ります。最後に、カバーガラスの端をマニキュアで密封し、蛍光顕微鏡でサンプルの観察を進めます。PNAプローブを用いて、テロメアが十分な突然変異を生き残った動物のテロメアが観察されました。

生殖腺では、核あたりのテロメアの数は定量化可能です。テロメア信号はTALT1信号と共局在しており、TALT1がテロメアなしでの生存に関与しているという考えを支持しています。テロメア信号の強度をソフトウェアを用いて比較した。

このシグナルは、テロメア欠損変異体の生成に使用された親系統よりもALT生存者の方が強かった。パラホルムアルデヒドとホルムアミドの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。