工場ポリソームプロファイリングのための簡単な方法
August 28th, 2016
このプロトコルは、結合したリボソームの数に基づいて植物組織から転写物を抽出し、分画する簡単な方法を説明しています。これにより、翻訳活性の全体的な推定と、特定のmRNAの翻訳状態の決定が可能になります。
こんにちは、セシルです。私はマルセイユのLGBPで働いています。このビデオで説明するプロトコルは、さまざまな植物組織からポリソームとモノソームを単離して、活発に翻訳されるmRNAを特定し、翻訳制御を研究する簡単な方法です。
例として、生後6日齢のシロイヌナズナの実生からのポリソームの単離、その後のRNAの単離、および結果の分析を示します。皿に種を蒔き、4度で2日間放置します。その後、6日間で植物を育てます。
苗を収穫し、液体窒素で挽きます。300ミリグラムの植物粉末を重量で量し、2.4ミリリットルのポリソーム緩衝液を追加します。遠心分離機で植物の破片を採取し、上清をショ糖勾配の上にロードします。
超遠心分離機の勾配は、ODの連続読み取りで下から上に収集します。画分をポリソーム、モノソーム、上清画分に引き込み、RNAを一晩沈殿させます。超遠心分離機にかけ、ペレットを再懸濁し、その後の分析のためにRNAを抽出します。ポリソームプロファイリングを行う数日前に、ショ糖の勾配を準備します。
50、35、20%のショ糖溶液を準備し、4度に保ちます。50%スクロース層を注ぎます。マイナス40度の冷凍庫で冷凍します。
6時間後、35%レイヤーを追加し、マイナス40度の冷凍庫で一晩冷凍します。最初の20%レイヤーを注ぎ、凍結します。実験当日は、必要な数のグラジエントを冷凍庫から取り出します。
最後の20%スクロース層を追加し、寒い部屋で勾配を解凍します。採集したばかりの植物をサンプルで準備します。ここでは、シロイヌナズナの生後6日間の苗木を使用しています。
液体窒素凍結植物を収穫し、徹底的に挽きます。重量300ミリグラムの植物粉末。2.4ミリリットルの新鮮なポリソームバッファーをすばやく追加し、均質化します。
溶液を2本の1.5ミリリットルチューブにピペットで移します。細胞質抽出物を遠心分離します。上清をピペットで撒きます。
植物の破片を避けるように注意してください。彼らは次のステップでプロファイルを台無しにするでしょう。グラジエントを乱さずにショ糖グラジエントに上清をロードします。
グラディエントをSW41ローターバケットに入れます。遠心機。ポリソームプロファイルを視覚化し、フラクションを収集するために、グラジエントに突入するキャピラリーチューブで作られた単純なシステムを使用します。UVキュベットにリンクされています。
これは、蠕動ポンプに自己接続されています。UV分光光度計は、キュベットを通って勾配が進行するにつれて、ODを連続的に登録します。フラクションコレクターは、2ミリリットルのフラクションの収集を可能にします。
キュベットを清掃し、分光光度計に入れます。バケツの邪魔をせずにバケツからグラデーションを取り除きます。クロロフィルは勾配の上部に集中する必要があります。
キャピラリーチューブを勾配の底に突っ込みます。蠕動ポンプを始動します。グラデーションは下から上に収集され、ODは連続的に読み取られます。
2ミリリットルのフラクションが収集されます。こちらがクラシカルなプロファイルの形です。RNA沈殿は、塩酸グアニジニウムとイソプロパノールを使用して行われます。
まず、50ミリリットルのチューブに1容量の塩酸グアニジンを注ぎ、次に画分を追加します。次に、1.5容量のイソプロパノールと50マイクログラムの等しい宅配便を追加します。RNAをマイナス20度で一晩沈殿させます。
フラクションを40ミリリットルの超遠心チューブに移し、チューブをイソプロパノールとバランスを取ります。遠心機。上清を取り除き、ペレットを風乾します。ペレットを200マイクロリットルの温かいTEバッファーに再懸濁します。
さらに、古典的なフェノールクロロホルム抽出を行うことによりRNAを抽出する。シロイヌナズナの生後6日の苗からのポリソーム抽出物の代表的なプロファイルを以下に示します。メインピークはモノソーム、つまり単一のリボソームに関連するmRNAに対応します。
プロファイルの最初の部分は、ポリソーム画分、すなわち多くのリボソームに関連するmRNAに対応します。各ピークは、新しいリボソームとmRNAとの会合と一致します。プロファイルの最後の部分は、遊離リボソームサブユニットとRNAを含む、いわゆる上清画分に対応します。
大量の60Sサブユニットは、モノソームピークの隣にショルダーを形成します。その完全性を評価するために、フラクションから抽出したRNAを従来のAragoseゲルで実行してから、さらなる実験に使用できます。このプロトコルを使用して、シロイヌナズナの苗木だけでなく、老若男女のロゼット、ニコチアナベンタミアナ、トマト、イネの葉からもポリソームを分離しました。
精製されたRNAは、マイクロアレイ解析だけでなく、ポリソーム画分に関連する低分子RNAの同定にも適合します。
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概要
このプロトコルは、植物組織からポリソームとモノソームを分離する簡単な方法を説明し、活発に翻訳されているmRNAの同定と翻訳制御の研究を可能にします。提供される例は、6日齢のシロイヌナズナの苗からのポリソームの分離に焦点を当てています。
主要な研究要素
科学分野
- 植物生物学
- 翻訳制御
- mRNA分析
背景
- 翻訳活性を理解することは、遺伝子発現を研究する上で重要です。
- ポリソームはmRNAを翻訳しているリボソームのクラスターであり、モノソームは単一のリボソームです。
- この方法は特定のmRNAの翻訳状態に関する洞察を提供します。
- シロイヌナズナは植物研究におけるモデル生物として機能します。
研究目的
- 植物組織からポリソームとモノソームを分離すること。
- 活発に翻訳されているmRNAを同定すること。
- 植物における翻訳の制御を研究すること。
使用された方法
- プレート上に種子を播種し、2日間冷蔵処理すること。
- 最適な条件下で6日間苗を育てること。
- 植物組織からポリソームとモノソームを分離すること。
- 翻訳活性を決定するためにRNAを分析すること。
主要な結果
- シロイヌナズナの苗からのポリソームの成功的な分離。
- 活発に翻訳されているmRNAの同定。
- 植物組織における翻訳の制御に関する洞察。
- 翻訳を研究するための方法の有効性の実証。
結論
- このプロトコルは、植物における翻訳を研究するための信頼できる方法を提供します。
- これは遺伝子発現制御の理解を深めます。
- このアプローチはさまざまな植物種に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Polysome profiling provides a direct snapshot of translational activity, enabling mechanistic de-risking of target hypotheses in plant-based biopharma discovery. By distinguishing actively translated mRNA pools, the method supports target validation and phenotypic screening in agriculturally relevant systems. This approach enhances predictive confidence when prioritizing leads for crop improvement or molecular farming applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mRNA abundance to translational output.
- Operational Value: Clarifies pathway activity through ribosome engagement metrics.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets with sustained translational engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening in plant expression platforms.
- Operational Value: Enables assay standardization via quantitative OD260 profiling and fraction reproducibility.
- Scalability: Supports platform reuse across Arabidopsis, Nicotiana, tomato, and rice tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase target validation to preclinical biomarker assessment in plant systems.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by isolating mRNA populations defined by ribosome load.
- Disease-Relevant System: Applicable to crop models used in molecular farming and biopharma production.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing before lead identification and enabling translational continuity into preclinical evaluation in plant-based systems.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring shifts in polysome/monosome ratios under experimental conditions.
- Screening: Delivers ribosome-profiling readouts that help compare compound or genetic perturbation effects.
- Analytics: Generates quantitative OD260 tracings and fractionated RNA yields for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery in plant molecular farming pipelines.
- Enterprise Reuse: Establishes a fractionation capability applicable across diverse plant tissues and species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving translational states of target mRNAs.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized sucrose gradient fractionation and continuous OD monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target modulation at the translation level.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on translational activity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue handling and polysome buffer preparation.
- Depends on ultracentrifugation equipment and fraction collection systems with UV monitoring.
- Necessitates cross-team standardization for gradient preparation and fraction pooling protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to non-model plant systems.
- Involves practical limitations related to RNA integrity during fractionation and extraction steps.
