工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

こんにちは、セシルです。私はマルセイユのLGBPに勤務しています。このビデオで説明するプロトコルは、翻訳が活発に行われているmRNAを同定し、翻訳調節について研究するために、さまざまな植物組織からポリソームとモノソームを単離する簡便な手法です。

例として、6日齢のArabidopsis thaliana苗からのポリソームの単離、それに続くRNAの単離および結果の解析について示します。種子をプレートに播種し、4°Cで2日間静置します。その後、植物を6日間育成させます。

苗を回収し、液体窒素中で粉砕します。植物粉末 300 mgを量り取り、2.4 mLのポリソームバッファーを加えます。遠心分離して植物断片を回収し、上清をショ糖密度勾配の上に載せます。

超遠心分離機で密度勾配を作り、OD（吸光度）を連続的に測定しながら、底部から上部に向かって分画物を回収します。ポリソーム分画、モノソーム分画、および上清分画に分け、RNAを一夜かけて沈殿させます。超遠心分離後、ペレットを再懸濁し、後の解析のためにRNAを抽出します。ポリソームプロファイリングを実施する数日前に、ショ糖密度勾配を準備しておきます。

50%、35%、20%のショ糖溶液を調製し、4°Cで保存します。50%ショ糖層を注ぎます。これを-40°Cのフリーザーで凍結させます。

6時間後、35%層を加え、-40°Cのフリーザーで一晩凍結させます。最初の20%層を注ぎ、凍結させます。実験当日に、必要な本数のグラジエントをフリーザーから取り出します。

最後の20% sucrose層を加え、コールドルームでグラジエントを解凍させます。新しく採取した植物サンプルを調製します。ここでは、6日齢のArabidopsis thalianaの苗を使用しています。

液体窒素で凍結させた植物を採取し、十分に粉砕します。植物粉末を 300 milligrams 量り取ります。新鮮なポリソームバッファー 2.4 milliliter を速やかに加え、ホモジナイズします。

溶液を1.5 mLチューブ2本に分注します。細胞質抽出液を遠心分離し、上清を回収します。

植物片が混入しないよう注意してください。混入すると、次のステップでプロファイルが損なわれます。勾配を乱さないように、上清をスクロース勾配にロードしてください。

勾配をSW 41ローターバケットに入れます。遠心分離を行います。ポリソームプロファイルを可視化し、画分を回収するために、勾配に浸漬させるキャピラリーチューブで構成された簡便なシステムを使用します。これはUVキュベットに接続されています。

ペリスタルティックポンプに接続されています。UV分光光度計により、キュベット内をグラジエントが通過する際のODが連続的に記録されます。フラクションコレクターを用いて、2 mLずつの分画を回収します。

キュベットを洗浄し、分光光度計にセットします。グラジエントを乱さないように注意しながら、バケットから取り出します。クロロフィルはグラジエントの上部に濃縮されている必要があります。

キャピラリーチューブをグラジエントの底まで浸します。ペリスタルティックポンプを開始します。グラジエントを底から上に向かって回収し、ODを連続的に測定します。

2 mLずつの画分を回収します。これが典型的なプロファイルの形状です。RNAの沈殿は、グアニジン塩酸塩とイソプロパノールを用いて行います。

まず、50 milliliterのチューブに1ボリュームのグアニジン塩酸塩を注ぎ、そこに分画液を加えます。次に、1.5ボリュームのイソプロパノールと50 microgram相当のキャリアを加えます。RNAを-20 degreesで一晩沈殿させます。

分画物を40 milliliterの超遠心管に移し、イソプロパノールでチューブの重量を調整します。遠心分離を行います。上清を除去し、ペレットを風乾させます。ペレットを200 microlitersの温めたTE bufferで再懸濁します。

古典的なフェノール・クロロホルム抽出を行い、RNAをさらに抽出します。ここに、生後6日目のArabidopsis幼苗から抽出したポリソームの代表的なプロファイルを示します。メインピークは、単一のリボソームに結合したmRNAであるモノソームに対応しています。

プロファイルの最初の部分はポリソーム画分、すなわち多くのリボソームが結合したmRNAに対応しています。各ピークは、新しいリボソームのmRNAへの結合に対応しています。プロファイルの最後の部分は、遊離リボソームサブユニットおよびRNAを含む、いわゆる上清画分に対応しています。

大量の60Sサブユニットがモノソームピークに隣接してショルダーを形成します。これらの完全性を評価するため、分画から抽出したRNAを、さらなる実験に使用する前に従来のアガロースゲルで電気泳動することができます。我々はこのプロトコルを用いて、Arabidopsis thalianaの苗だけでなく、若年および成熟したロゼット、さらにNicotiana benthamiana、トマト、イネの葉からポリソームを単離しており、幅広い植物種および組織に適用可能であると考えられます。

精製されたRNAは、マイクロアレイ解析およびポリソーム分画に関連する小型RNAの同定に適しています。