工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

こんにちは、セシルです。私はマルセイユのLGBPで働いています。このビデオで説明するプロトコルは、さまざまな植物組織からポリソームとモノソームを単離して、活発に翻訳されるmRNAを特定し、翻訳制御を研究する簡単な方法です。

例として、生後6日齢のシロイヌナズナの実生からのポリソームの単離、その後のRNAの単離、および結果の分析を示します。皿に種を蒔き、4度で2日間放置します。その後、6日間で植物を育てます。

苗を収穫し、液体窒素で挽きます。300ミリグラムの植物粉末を重量で量し、2.4ミリリットルのポリソーム緩衝液を追加します。遠心分離機で植物の破片を採取し、上清をショ糖勾配の上にロードします。

超遠心分離機の勾配は、ODの連続読み取りで下から上に収集します。画分をポリソーム、モノソーム、上清画分に引き込み、RNAを一晩沈殿させます。超遠心分離機にかけ、ペレットを再懸濁し、その後の分析のためにRNAを抽出します。ポリソームプロファイリングを行う数日前に、ショ糖の勾配を準備します。

50、35、20%のショ糖溶液を準備し、4度に保ちます。50%スクロース層を注ぎます。マイナス40度の冷凍庫で冷凍します。

6時間後、35%レイヤーを追加し、マイナス40度の冷凍庫で一晩冷凍します。最初の20%レイヤーを注ぎ、凍結します。実験当日は、必要な数のグラジエントを冷凍庫から取り出します。

最後の20%スクロース層を追加し、寒い部屋で勾配を解凍します。採集したばかりの植物をサンプルで準備します。ここでは、シロイヌナズナの生後6日間の苗木を使用しています。

液体窒素凍結植物を収穫し、徹底的に挽きます。重量300ミリグラムの植物粉末。2.4ミリリットルの新鮮なポリソームバッファーをすばやく追加し、均質化します。

溶液を2本の1.5ミリリットルチューブにピペットで移します。細胞質抽出物を遠心分離します。上清をピペットで撒きます。

植物の破片を避けるように注意してください。彼らは次のステップでプロファイルを台無しにするでしょう。グラジエントを乱さずにショ糖グラジエントに上清をロードします。

グラディエントをSW41ローターバケットに入れます。遠心機。ポリソームプロファイルを視覚化し、フラクションを収集するために、グラジエントに突入するキャピラリーチューブで作られた単純なシステムを使用します。UVキュベットにリンクされています。

これは、蠕動ポンプに自己接続されています。UV分光光度計は、キュベットを通って勾配が進行するにつれて、ODを連続的に登録します。フラクションコレクターは、2ミリリットルのフラクションの収集を可能にします。

キュベットを清掃し、分光光度計に入れます。バケツの邪魔をせずにバケツからグラデーションを取り除きます。クロロフィルは勾配の上部に集中する必要があります。

キャピラリーチューブを勾配の底に突っ込みます。蠕動ポンプを始動します。グラデーションは下から上に収集され、ODは連続的に読み取られます。

2ミリリットルのフラクションが収集されます。こちらがクラシカルなプロファイルの形です。RNA沈殿は、塩酸グアニジニウムとイソプロパノールを使用して行われます。

まず、50ミリリットルのチューブに1容量の塩酸グアニジンを注ぎ、次に画分を追加します。次に、1.5容量のイソプロパノールと50マイクログラムの等しい宅配便を追加します。RNAをマイナス20度で一晩沈殿させます。

フラクションを40ミリリットルの超遠心チューブに移し、チューブをイソプロパノールとバランスを取ります。遠心機。上清を取り除き、ペレットを風乾します。ペレットを200マイクロリットルの温かいTEバッファーに再懸濁します。

さらに、古典的なフェノールクロロホルム抽出を行うことによりRNAを抽出する。シロイヌナズナの生後6日の苗からのポリソーム抽出物の代表的なプロファイルを以下に示します。メインピークはモノソーム、つまり単一のリボソームに関連するmRNAに対応します。

プロファイルの最初の部分は、ポリソーム画分、すなわち多くのリボソームに関連するmRNAに対応します。各ピークは、新しいリボソームとmRNAとの会合と一致します。プロファイルの最後の部分は、遊離リボソームサブユニットとRNAを含む、いわゆる上清画分に対応します。

大量の60Sサブユニットは、モノソームピークの隣にショルダーを形成します。その完全性を評価するために、フラクションから抽出したRNAを従来のAragoseゲルで実行してから、さらなる実験に使用できます。このプロトコルを使用して、シロイヌナズナの苗木だけでなく、老若男女のロゼット、ニコチアナベンタミアナ、トマト、イネの葉からもポリソームを分離しました。

精製されたRNAは、マイクロアレイ解析だけでなく、ポリソーム画分に関連する低分子RNAの同定にも適合します。