グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング
June 1st, 2021
このプロトコルでは、自動グラジエントメーカーやグラジエント分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを生成する方法について説明します。
このプロトコルは、細胞内のリボソームの活性に関する分子の詳細を明らかにするポリソームプロファイルを生成する方法を説明しています。この技術により、ユーザーは、自動グラジエント分画システムにアクセスできないポリソームプロファイルによって提供される貴重な情報を取得できます。勾配を準備するときは時間をかけて、線形勾配に落ち着くときにコンプレッサーやその他の機械的操作によって中断されない場所に勾配を保管してください。
まず、スクロースグラジエントバッファーに7%および47%スクロースのストック溶液を調製します。フィルターは、0.22ミクロンのフィルターを通してショ糖ストック溶液を滅菌します。14%ストック溶液と27%ストック溶液を分注して混合することにより、17、27、および47%のスクロース溶液を47ミリリットル準備します。
6本のポリプロピレン製遠心チューブをフルビューの試験管ラックに入れます。一方のチューブでのアクションが他のチューブの邪魔にならないように、チューブ間に十分なスペースがあることを確認してください。先端が鈍い9インチ、22ゲージの針を3ミリリットルのシリンジに取り付け、テスト充填と分注を実行して、シリンジが滴り落ちることなくショ糖溶液を保持できることを確認してから、勾配を設定します。
各遠沈管の底に2ミリリットルの7%スクロースを加えます。次に、針先をチューブ底部のすぐ近くに配置することにより、7%溶液の下に17%スクロースを2ミリリットル加えます。慎重にゆっくりと溶液を分配します。
27、37、および47%スクロース溶液のそれぞれ2ミリリットルで手順を繰り返し、各層が密度の分離を示す線によって互いに区別できることを確認します。勾配を摂氏4度で一晩保存して、スクロースの割合が連続的に増加するようにします。酵母の増殖および回収後、サッカロミセス・セレビシエ細胞を、冷却した700マイクロリットルのポリソーム抽出バッファーに細胞を再懸濁する。
RNAse阻害剤を100単位添加します。次に、約425〜600ミクロンのサイズの400マイクロリットルのプレチルドガラスビーズを追加します。ガラスビーズを入れた1.5ミリリットルの遠沈管に混合物を移し、ビーズビーターで5分間激しく攪拌して酵母細胞を破壊します。
細胞を破壊した後、遠心分離によってライセートを清澄化する。蛍光ベースのRNA検出システムを使用して、260ナノメートルの吸光度を測定することにより、清澄化されたライセート中のRNAの濃度を決定します。RNA濃度がマイクロリットルあたり0.5〜1マイクログラムであることを確認してください。
RNA濃度が低すぎる場合は、細胞を再懸濁するために使用する抽出バッファーの量を減らします。ライセートをグラデーションの上部に慎重にロードします。ピペットチップをポリプロピレンチューブ上部の内壁に置きます。
チューブを傾け、ライセートをグラデーションの上部にゆっくりと分注し、壁に滴り落ちます。チューブをスイングバケットローターの事前に冷却されたバケットにそっと置き、グラジエントを遠心分離します。遠心分離後、スイングバケットローターから遠心管を慎重に取り外し、チューブホルダーに入れます。
96ウェルプレートにラベルを付けて画分を保存し、氷上でプレチルします。ピペットチップをグラジエントの上部に注意深く挿入し、グラジエント全体が分注されるまでフラクションを収集することにより、グラジエントの上部から100または200マイクロリットルのフラクションを収集します。ブランクとして7%および47%スクロース溶液に対して分光光度計を使用して254ナノメートルで各画分の吸光度を測定します。
分数対吸光度をプロットしてポリソームプロファイルを作成します。酵母S.Cerevisiae由来の3つの代表的なポリソームプロファイルが、示されている。各リボソームサブユニットの頂上およびポリソームピークは、各プロファイル上で明らかである。
自動密度分画システムの代表的なプロファイルをここに示します。このプロファイルは、スクロース勾配が追跡溶液によって下から上に置換され、検出器フローセルを介してフラクションに収集されたときの連続吸光度プロファイルから生成されました。200マイクロリットルと100マイクロリットルのサンプルを手で分画することによって生成されたポリソームプロファイルをここに示します。
この手順で覚えておくべき最も重要なことは、グラデーションを乱さないことです。溶液の分注が速すぎて気泡が発生したり、勾配が乱れたりしないように注意してください。この手順に続いて、RNAをグラジエントから抽出してさらに分析し、活性リボソームと会合しているmRNAを決定することができます。
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概要
このプロトコルは、細胞内のリボソームの活動に関する分子的詳細を明らかにするポリソームプロファイルを生成する方法を説明しています。この技術により、ユーザーは自動化された勾配分画システムなしで貴重な情報を得ることができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 分子生物学
背景
- ポリソームプロファイリングはリボソーム活性を理解する上で重要です。
- 翻訳と遺伝子発現に関する洞察を提供します。
- 自動化システムは常に研究者にアクセス可能ではありません。
- このプロトコルは勾配調製の代替方法を提供します。
研究目的
- ポリソームプロファイルを生成するための詳細な方法を提供すること。
- 様々な研究環境でリボソーム活性分析を容易にすること。
- 自動化システムを持たない研究者がこの分析を実行できるようにすること。
使用される方法
- サクロース勾配溶液の調製。
- サクロースストック溶液の濾過。
- 異なるサクロース濃度の段階的混合。
- 勾配の安定性を維持するための慎重な保管。
主要な結果
- 直線的なサクロース勾配の成功的な生成。
- 自動化システムなしでリボソーム活性を分析する能力。
- ポリソームプロファイリングの信頼性のある方法の提供。
- 翻訳の分子メカニズムへの洞察。
結論
- このプロトコルは研究者にとって貴重なリソースです。
- ポリソームプロファイリング技術へのアクセスを民主化します。
- さらなる研究は様々な応用のためにこの方法を基に構築できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Polysome profiling enables mechanistic de-risking of target validation by revealing translational activity of specific mRNAs, supporting predictive confidence in early discovery. This protocol provides a cost-effective, reproducible method for generating ribosome profiles using standard laboratory equipment, expanding access to translational biomarker analysis in resource-constrained settings. It supports workflow positioning from hypothesis testing to lead identification by enabling quantitative assessment of ribosomal engagement without reliance on expensive fractionation systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by identifying mRNAs actively engaged with ribosomes under experimental conditions.
- Operational Value: Enable functional target validation through direct measurement of translational output in disease-relevant systems.
- Predictive Value: Support portfolio triage by correlating polysome shifts with pathway modulation and target engagement.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepare validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline translational profiles.
- Reproducibility: Generate consistent sucrose gradients without specialized equipment, ensuring reliable fractionation for comparative analysis.
- Quantitative Output: Measure absorbance at 254 nm to produce quantifiable polysome profiles enabling hit validation and dose-response assessment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Adapt the protocol to various cell types to study translational dysregulation in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Link target modulation to changes in ribosome profiling, reducing ambiguity in mechanism of action.
- Translational Continuity: Support biomarker alignment by extracting RNA from fractions to identify mRNAs associated with active ribosomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling ribosome profiling as a functional readout prior to preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing which transcripts are translationally active, clarifying pathway involvement beyond transcriptional changes.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible gradient generation, allowing reliable comparison of compound effects on translational output.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (absorbance at 254 nm) that allow teams to compare ribosomal engagement across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling extraction of polysome-associated RNA for further analysis of translationally regulated biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for ribosomal activity analysis across projects, reducing dependency on centralized core facilities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct measurement of translational activity, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization and reproducibility of gradient preparation using accessible laboratory equipment.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement at the translational level.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on polysome profiling data, reducing late-stage biological risk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in gradient preparation and careful handling to avoid disruption of sucrose layers.
- Needs access to swinging bucket rotor, spectrophotometer, and bead-beater for lysate preparation.
- Demands cross-team standardization in fraction collection and absorbance measurement protocols.
- Requires adaptation considerations when applying to mammalian or plant cell types due to differences in lysis and polysome stability.
- Practical limitation: Manual fractionation is lower throughput than automated systems, suited for validation rather than high-volume screening.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Preparation of 7 to 47% Sucrose Gradients
2:14
Preparation of Yeast Cell Extracts
3:21
Centrifugation of Gradients
3:49
Fraction and Data Collection
4:36
Results: Polysome Profiling Without Gradient Makers or Fractionation Systems
5:19
Conclusion
