Name: グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: 学ぶポリソームプロファイリング手法で、自動分画システムを使わずに細胞内リボソーム活性の分子メカニズムを解析できます。Saccharomyces cerevisiaeを用いた翻訳制御研究に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、この原稿を批判的に読んでくれたパーシー・タンバレ博士とメリッサ・ウェルズ博士に感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所の壁内研究プログラムによってサポートされました。米国国立環境衛生科学研究所(NIEHS;ZIA ES103247 から R.E.S.

1. 7%〜47%スクロースグラジエントの調製
注:スクロース勾配の線形範囲は、使用する細胞の種類に応じて、より良い分離を達成するために変更できます。このプロトコルは、 S. cerevisiaeのポリソームプロファイル用に最適化されています。
<ol><li>スクロースグラジエントバッファー(20 mM Tris-HCl pH 7.4、60 mM KCl、10 mM MgCl2、および1 mM DTT)で7%および47%スクロースのストック溶液を調製します。フィルターは、ショ糖ストック溶液を0.22 μmフィルターで滅菌し、4°Cで保存します。</li>
	<li> 表1に記載の方法で7%および47%のスクロースストック溶液を分注および混合することにより、17%、27%、および37%のスクロース溶液の14mLを調製する。</li>
	<li>6本のポリプロピレン製遠心チューブ(14 x 89 mm)をフルビューの試験管ラックに入れます。1つのチューブでのアクションが他のチューブを邪魔しないように、チューブ間に十分なスペースを確保してください。</li>
	<li>長い針を3 mLシリンジに取り付けます。このプロトコルでは、先端が鈍い9インチ、22 Gの針を使用しますが(図1)、遠心管の底に達するのに十分な長さの針で十分です。 注意: グラジエントを設定する前に、シリンジが滴下することなくショ糖溶液を保持できることを確認するために、テスト充填と分配を実行します。</li>
	<li>各遠沈管の底に2 mLの7%ショ糖を加えます。</li>
	<li>針の先端をチューブ底部のすぐ近くに配置し、溶液をゆっくりと慎重に分注することにより、7%溶液の下に17%スクロース2 mLを追加します。</li>
	<li>27%、37%、および47%のショ糖溶液をそれぞれ2 mLで繰り返します。各層が密度の分離を示す線で互いに区別できることを確認します(図2)。 注:グラジエントが48時間以内に使用されない場合は、この時点で、連続グラジエントに落ち着く前に、液体窒素中の層状スクロース溶液でチューブを瞬間凍結し、長期保存のために-80°Cの冷凍庫に保管します。</li>
	<li>グラジエントを4°Cで一晩保存して、グラジエントを連続的に沈降させ、スクロースの割合を増やします。層状スクロース溶液が線形スクロース勾配に落ち着くまでに8〜12時間かかります。線形勾配は最大48時間安定しています。4°Cで一晩保存すると、凍結した層状スクロース溶液を使用するための線形勾配への融解と沈降に十分な時間が得られます。濃度計を使用して、勾配の品質を評価します。 注意: 勾配は、動きや振動によって勾配が乱れるため、邪魔されない安定した場所に保管することが重要です。</li>
</ol>2.酵母細胞エキスの調製
<ol><li>目的の酵母株を50 mLの酵母エキスペプトンデキストロース(YPD)培地に植菌し、振とうインキュベーターで30°Cで一晩増殖させて固定相にします。 注:温度は酵母株の要件によって異なる場合があります。</li>
	<li>10 mLの固定相培養液を1 Lの新鮮なYPD培地に移します。培養物が指数関数的成長期(OD600 = 0.4-0.6)に達するまで、30°C(または他の適切な温度)で激しく振とうしながら細胞をインキュベートします。</li>
	<li>指数関数的成長の中間段階で、シクロヘキシミドを最終濃度0.1 mg/mLで培養液に加えます。氷上で5分間インキュベートします。</li>
	<li>3,000 x g で4°Cで10分間遠心分離して細胞を回収します。 注:この時点で、細胞は凍結して-80°Cで保存できます。</li>
	<li>細胞を冷やした700 μLのポリソーム抽出バッファー(20 mM Tris-HCl pH 7.4、60 mM KCl、10 mM MgCl2、1 mM DTT、1% Triton X-100、0.1 mg/mLのシクロヘキシミド、0.2 mg/mLのヘパリン)に再懸濁します。RNase阻害剤を100単位添加し、1.5 mLの遠沈管に移します。</li>
	<li>425〜600 μmのサイズ範囲の~400 μLのプレチルドガラスビーズを遠沈管に追加します。ビーズビーターで5分間激しく攪拌して酵母細胞を破壊します。</li>
	<li>8,000 x g で4°Cで5分間遠心分離することにより、ライセートを清澄化します。</li>
	<li>分光光度計または蛍光ベースのRNA検出システムを使用して260 nmの吸光度を測定することにより、清澄化されたライセート中のRNAの濃度を決定します。 注:非常に正確なRNA濃度測定には、蛍光ベースのRNA検出キットを使用してください。</li>
	<li>RNA濃度が0.5〜1μg/μLであることを確認してください。RNA濃度が低すぎる場合は、将来の実験で細胞を再懸濁するために使用するポリソーム抽出バッファーの量を減らしてください。 注:溶解およびRNA定量の直後にライセートをグラジエントにロードします。必要に応じて、ライセートを液体窒素中で瞬間凍結し、-80°Cで数日間保存します。</li>
</ol>3. グラジエントの遠心分離
<ol><li>ライセートをグラデーションの上部に慎重にロードします。ピペットチップをポリプロピレンチューブの上部の内壁に置きます。チューブをゆっくりと傾け、壁にドリブルしてライセートをグラデーションの上部にゆっくりと分配します。ライセートをロードするときに勾配を乱したり乱したりしないように細心の注意を払ってください。 注:負荷されるライセートの量は、細胞の種類によって異なります。RNAの含有量も異なります。最適なポリソームプロファイルを生成するために必要な溶解物の量を決定するために、いくつかの実験を実行する必要があるかもしれません。酵母の場合、300 μgのRNAが最適化の出発点として適しています。</li>
	<li>チューブをスイングバケットローターの事前に冷やしたバケットにそっと入れます。 注意: 各ポリプロピレン製遠心分離管には、等量の勾配と負荷される溶解液の量が必要です。これはチューブごとに異なる場合があります。変動が超遠心分離中に不均衡エラーを引き起こさないことを確認してください。</li>
	<li>グラジエントを260,110 x g で4°Cで150分間遠心分離します。</li>
</ol>4.分数とデータ収集
<ol><li>スイングバケットローターから遠心管を慎重に取り外し、チューブホルダーに入れます。</li>
	<li>96ウェルプレートにラベルを付けて画分を保存し、氷上でプレチルします。 注:260 nm/280 nmでの核酸測定には、230 nmまでの光学ウィンドウを備えた分光光度計に適した96ウェルプレートを使用してください。</li>
	<li>ピペットチップをグラジエントの上部に慎重に挿入することにより、グラジエントの上部から100 μLまたは200 μLの画分を収集します。勾配全体が分注されるまで分数を収集します。分数の数は、総勾配体積に依存します。 注意: グラデーションの残りの部分を乱さない方法で分数を収集します。すべての分数が等しいことを確認してください。手動分画に加えて、分画のための別の低コストの方法は、小型の蠕動ポンプを使用することである。</li>
	<li>各フラクションを96ウェルプレートに移し、遠沈管の底部に到達します。集めた画分を常に氷の上に保管してください。</li>
	<li>分光光度計で254nmにおける各画分の吸光度を測定する。7%および47%のスクロース溶液をブランクとして使用します。 注意: フラクションの吸光度を測定する場合、ほとんどの分光計および比色計では、最も効果的な吸光度の範囲は0.1〜1であることに注意してください。吸光度測定値が範囲外(≥1.0)の場合、画分の材料が多すぎます。サンプルを希釈し、データを再回収してから、プロファイルをプロットするときに希釈係数を考慮します。</li>
	<li>分数対吸光度をプロットしてポリソームプロファイルを作成します。</li>
</ol>

<ol><li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).</li>
<li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).</li>
<li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79(2019).</li>
<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3(2018).</li>
<li>Karamysheva, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+in+leishmania%2C+human+cells+and+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600(2018).</li>
<li>Jin, H. Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).</li>
<li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15(2017).</li>
<li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate%2C+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573(2017).</li>
<li>Kudla, M., Karginov, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+translation+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA translation by polysome profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295(2014).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164(2014).</li>
<li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+to+analyze+mRNA+distribution+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles.</a> Bio-protocol. 7 (3), 2126(2017).</li>
<li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcn2+eIF2alpha+kinase+mediates+combinatorial+translational+regulation+through+nucleotide+motifs+and+uORFs+in+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+footprint+profiling+of+translation+throughout+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome.</a> Cell. 165 (1), 22-33 (2016).</li>
<li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRS1+to+DRS7%2C+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).</li>
<li>Lo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513(2019).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li>
<li>Woolford, J. L., Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li>
<li>Klinge, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+assembly+coming+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome assembly coming into focus.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li>
<li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+ribosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li>
<li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+puzzle+of+life%3A+Crafting+ribosomal+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li>
<li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+nascent+ribosome%3A+AAA-ATPases+in+eukaryotic+ribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis.</a> Biomolecules. 9 (11), 715(2019).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3%2FLas1+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).</li>
<li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li>
<li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymolog%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li>
<li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+%28eEF%29+1A+and+eEF3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li>
<li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

ここでは、高価な自動分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを作成する方法について説明しました。この方法の利点は、自動分画システムを持たないラボがポリソームプロファイリングにアクセスできることです。このプロトコルの主な欠点は、専用の密度分画システムと比較して、面倒な手の分画と感度の低下です。
このプロトコルでは、リボソームサブユニット、モノソーム、およびポリソームを分離するのに十分な分解能でスクロース勾配を慎重に調製する必要があります。スクロース勾配を調製する場合、勾配層をロードするときに気泡を導入しないことが重要です。気泡は下から上に上昇し、勾配の直線性を乱す可能性があります。さらに、各勾配層の完全性を確保するために、各使用前に針の外側を拭き取り、余分なスクロース溶液を内腔から取り除く必要があります。4°Cでの勾配の一晩保管は、冷蔵室で行う必要があります。冷蔵庫でコンプレッサーのオンとオフを切り替えることによって引き起こされる振動は、勾配を乱す可能性があります。
このアッセイのもう一つの重要な部分は、グラジエントの量と...

リボソームは、mRNAをタンパク質に翻訳する基本的なプロセスを実行するメガダルトンリボ核タンパク質複合体です。リボソームは、細胞内のすべてのタンパク質の合成を実行する役割を果たします。真核生物のリボソームは、沈降係数に応じて小さなリボソームサブユニット(40S)と大きなリボソームサブユニット(60S)として指定された2つのサブユニットで構成されています。完全に組み立てられたリボソームは80Sモノソームとして指定されます。ポリソームは、単一のmRNA分子の翻訳に従事するリボソームのグループです。スクロース密度勾配遠心分離によるポリソーム分画は、リボソームプロファイルの作成、翻訳リボソームに関連する特定のmRNAの同定、およびポリソーム関連因子の分析に使用される強力な方法です1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 、13。この技術は、単一のリボソーム、リボソームサブユニット、およびメッセンジャーリボ核タンパク質粒子からポリソームを分離するためによく使用されます。分画から得られたプロファイルは、ポリソーム14の翻訳活性およびリボソーム15、16、17の集合状態に関する貴重な情報を提供することができる。
リボソーム集合は、リボソーム集合因子18、19、20、21として知られるタンパク質群によって促進される非常に複雑なプロセスである。これらの因子は、ATPアーゼ、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ、GTPアーゼ、RNAヘリカーゼ、およびRNA結合タンパク質を含む他の多くのタンパク質との相互作用を通じて、リボソーム生合成中に幅広い機能を果たします22。ポリソーム分画は、リボソームアセンブリにおけるこれらの因子の役割を調査するために使用される強力なツールです。例えば、この方法は、pre-rRNAプロセシング因子であるポリヌクレオチドキナーゼGrc3の変異がリボソームアセンブリプロセスにどのように悪影響を及ぼし得るかを実証するために利用されている17,23。ポリソームプロファイリングはまた、ATPase Rix7内の保存されたモチーフがリボソーム産生にどのように不可欠であるかを強調し、示しています16。
ポリソーム分画の手順は、目的の細胞から可溶性細胞ライセートを作ることから始まります。ライセートは、RNA、リボソームサブユニット、およびポリソーム、ならびに他の可溶性細胞成分を含有する。連続的な直線的なスクロース勾配は、超遠心チューブ内で行われます。細胞ライセートの可溶性画分は、スクロース勾配チューブの上部に穏やかにロードされます。次に、装填された勾配チューブを遠心分離にかけ、重力によってスクロース勾配内のサイズによって細胞成分を分離します。大きいコンポーネントは、小さいコンポーネントよりも勾配にさらに移動します。グラデーションの上部には、小さくて移動の遅い細胞成分が格納され、大きくて移動の速い細胞成分は下部にあります。遠心分離後、チューブの内容物をフラクションとして収集します。この方法は、リボソームサブユニット、モノソーム、およびポリソームを効果的に分離します。次いで、各画分の光学濃度は、波長254nmにおける分光吸光度を測定することによって決定される。吸光度対分数を比較すると、ポリソームプロファイルが得られます。
線形スクロース密度勾配は、勾配メーカーを利用して生成することができる。遠心分離後、グラジエントはしばしば分画され、吸光度は自動密度分画システム3、7、13、24、25を用いて測定される。これらのシステムはポリソームプロファイルを生成するのに非常にうまく機能しますが、高価であり、一部のラボでは法外なコストがかかる可能性があります。ここでは、これらの機器を使用せずにポリソームプロファイルを生成するためのプロトコルが提示されています。代わりに、このプロトコルは、ほとんどの分子生物学研究室で通常利用可能な機器を利用します。

<table><tbody><tr><td>自動分画装置</td><td>Brandel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clariostar マルチモード プレート リーダー</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ、酸洗浄</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td>425&ndash;600 &mu;m</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム、1 m</td><td>KD 医療</td><td>CAC-5290</td><td></td></tr><tr><td>針、22 g、メタル ハブ</td><td>ハミルトン カンパニー</td><td>7748-08</td><td>カスタム長さ 9 インチ、ポイント スタイル 3</td></tr><tr><td>オプティマ XL-100K 超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン遠心分離管</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン試験管 ペグラック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-810-54A</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 蛍光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Q33228</td><td></td></tr><tr><td>量子ビット RNA HS アッセイキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>RNAse 阻害剤</td><td>応用バイオシステム</td>ズ <td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW41 スイング バケット ローター パッケージ</td><td>ベックマン コールター</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、3 mL</td><td>Coviden</td><td>888151394</td><td></td></tr><tr><td>Tris、1 M、pH 7.4</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>UV-Star Microplate、96 ウェル</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td>655801</tr></tbody></table>

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

スクロース密度勾配遠心分離によるポリソーム分画は、リボソームプロファイルの作成、リボソームによって翻訳されている特定のmRNAの同定、およびポリソーム関連因子の分析に使用できる強力なツールです。この技術では、自動グラジエントメーカーとグラジエント分画システムが一般的に使用されますが、これらのシステムは一般的に高価であり、リソースが限られている、または研究のためにこの方法を実行する頻度が低いか時折必要ないために費用を正当化できないラボにとっては法外なコストになる可能性があります。ここでは、特殊な分画装置なしでほとんどの分子生物学研究室で利用可能な標準装置を使用して、ポリソームプロファイルを再現性よく生成するためのプロトコルが提示されています。さらに、グラジエント分画システムの有無にかかわらず生成されたポリソームプロファイルの比較が提供されます。再現性のあるポリソームプロファイルを最適化して生成するための戦略について説明します。 サッカロミセス・セレビシエ は、このプロトコルのモデル生物として利用されています。ただし、このプロトコルは、多くの異なる生物および細胞タイプのリボソームプロファイルを生成するために簡単に変更および適合させることができます。

3つの代表的なポリソームプロファイルを図3に示す。すべてのプロファイルは同じ酵母株からのものです。典型的なポリソームプロファイルは、40S、60S、および80Sリボソームサブユニットおよびポリソームのよく分解されたピークを有する。各リボソームサブユニットの頂上とポリソームピークは、各プロファイルで明らかになります(図3)。自動密度分画システムの代表的なプロファイルを図3Aに示します。このプロファイルを生成するために使用されるスクロース勾配は、このプロトコルに記載されているように手作業で調製されました。図3Aに示すこのプロファイルは、スクロース勾配が検出器フローセルを通る追跡溶液によって下から上に置換され、フラクションに収集されたときの連続吸光度プロファイルから生成されました。これらのシステムは吸光度を継続的に測定するため、1,500を超えるデータポイントを記録できます。同じ数のデータポイントを手動で生...

このプロトコルでは、自動グラジエントメーカーやグラジエント分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを生成する方法について説明します。

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

このプロトコルは、細胞内のリボソームの活性に関する分子の詳細を明らかにするポリソームプロファイルを生成する方法を説明しています。この技術により、ユーザーは、自動グラジエント分画システムにアクセスできないポリソームプロファイルによって提供される貴重な情報を取得できます。勾配を準備するときは時間をかけて、線形勾配に落ち着くときにコンプレッサーやその他の機械的操作によって中断されない場所に勾配を保管してください。まず、スクロースグラジエントバッファーに7%および47%スクロースのストック溶液を調製します。フィルターは、0.22ミクロンのフィルターを通してショ糖ストック溶液を滅菌します。14%ストック溶液と27%ストック溶液を分注して混合することにより、17、27、および47%のスクロース溶液を47ミリリットル準備します。6本のポリプロピレン製遠心チューブをフルビューの試験管ラックに入れます。一方のチューブでのアクションが他のチューブの邪魔にならないように、チューブ間に十分なスペースがあることを確認してください。先端が鈍い9インチ、22ゲージの針を3ミリリットルのシリンジに取り付け、テスト充填と分注を実行して、シリンジが滴り落ちることなくショ糖溶液を保持できることを確認してから、勾配を設定します。各遠沈管の底に2ミリリットルの7%スクロースを加えます。次に、針先をチューブ底部のすぐ近くに配置することにより、7%溶液の下に17%スクロースを2ミリリットル加えます。慎重にゆっくりと溶液を分配します。27、37、および47%スクロース溶液のそれぞれ2ミリリットルで手順を繰り返し、各層が密度の分離を示す線によって互いに区別できることを確認します。勾配を摂氏4度で一晩保存して、スクロースの割合が連続的に増加するようにします。酵母の増殖および回収後、サッカロミセス・セレビシエ細胞を、冷却した700マイクロリットルのポリソーム抽出バッファーに細胞を再懸濁する。RNAse阻害剤を100単位添加します。次に、約425〜600ミクロンのサイズの400マイクロリットルのプレチルドガラスビーズを追加します。ガラスビーズを入れた1.5ミリリットルの遠沈管に混合物を移し、ビーズビーターで5分間激しく攪拌して酵母細胞を破壊します。細胞を破壊した後、遠心分離によってライセートを清澄化する。蛍光ベースのRNA検出システムを使用して、260ナノメートルの吸光度を測定することにより、清澄化されたライセート中のRNAの濃度を決定します。RNA濃度がマイクロリットルあたり0.5〜1マイクログラムであることを確認してください。RNA濃度が低すぎる場合は、細胞を再懸濁するために使用する抽出バッファーの量を減らします。ライセートをグラデーションの上部に慎重にロードします。ピペットチップをポリプロピレンチューブ上部の内壁に置きます。チューブを傾け、ライセートをグラデーションの上部にゆっくりと分注し、壁に滴り落ちます。チューブをスイングバケットローターの事前に冷却されたバケットにそっと置き、グラジエントを遠心分離します。遠心分離後、スイングバケットローターから遠心管を慎重に取り外し、チューブホルダーに入れます。96ウェルプレートにラベルを付けて画分を保存し、氷上でプレチルします。ピペットチップをグラジエントの上部に注意深く挿入し、グラジエント全体が分注されるまでフラクションを収集することにより、グラジエントの上部から100または200マイクロリットルのフラクションを収集します。ブランクとして7%および47%スクロース溶液に対して分光光度計を使用して254ナノメートルで各画分の吸光度を測定します。分数対吸光度をプロットしてポリソームプロファイルを作成します。酵母S.Cerevisiae由来の3つの代表的なポリソームプロファイルが、示されている。各リボソームサブユニットの頂上およびポリソームピークは、各プロファイル上で明らかである。自動密度分画システムの代表的なプロファイルをここに示します。このプロファイルは、スクロース勾配が追跡溶液によって下から上に置換され、検出器フローセルを介してフラクションに収集されたときの連続吸光度プロファイルから生成されました。200マイクロリットルと100マイクロリットルのサンプルを手で分画することによって生成されたポリソームプロファイルをここに示します。この手順で覚えておくべき最も重要なことは、グラデーションを乱さないことです。溶液の分注が速すぎて気泡が発生したり、勾配が乱れたりしないように注意してください。この手順に続いて、RNAをグラジエントから抽出してさらに分析し、活性リボソームと会合しているmRNAを決定することができます。

polysome-profiling-without-gradient-makers-or-fractionation-systems

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

この記事では、真核細胞からリボソームを翻訳するの抽出のためのプロトコルについて説明します。解凍したら、リボソームが異なるリボソーム集団を分析できるようにショ糖密度勾配分画によってmonosomesとpolyribosomesに分かれています。このように、このメソッドは、翻訳の調節を調べるためのゴールドスタンダードです。...

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

ここでは、ストレス条件に応答する真核細胞のmRNA翻訳の開始の変化を分析するための方法を記載している。このメソッドは、非翻訳リボソームからリボソームを翻訳するショ糖勾配に速度の分離に基づいています。...

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

このプロトコルは、in vivoでのCNSサンプルのtranslatomeを研究するためにポリリボソーム分画の本質的な変更を示している。これは、結合したRNA画分をリボソームへの全RNAの単離と比較を通じて翻訳と転写制御の全体的な評価が可能になります。...

ポリリボソーム画によって中枢神経系Translatomeの生体尋問中

リボソームはタンパク質合成の中心的な役割を果たしている。ショ糖密度勾配遠心分離によりポリリボソーム（ポリソーム）分画は、ゲノムワイドな規模での個々のmRNAの翻訳効率の直接測定を可能にする。さらに、この方法は、シャペロンおよびシグナル伝達分子としてのリボソーム及びポリソーム関連因子の生化学的分析のために使用することができる。...

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

細胞がストレスに適応する能力は、彼らの生存にとって非常に重要です。mRNA翻訳の制御は、プロテオームの迅速な制御を可能にする適応戦略の1つです。ここでは、ストレス条件下で選択的に翻訳される特定のmRNAを同定するための標準化されたポリソームプロファイリングプロトコルを提供します。...

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

このプロトコルは、結合したリボソームの数に基づいて植物組織から転写物を抽出し、分画する簡単な方法を説明しています。これにより、翻訳活性の全体的な推定と、特定のmRNAの翻訳状態の決定が可能になります。...

工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

翻訳制御蛋白質量の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、我々...

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

ポリソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、タンパク質合成時に個々 の mRNAs のトランスクリプトーム Mrna...

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

哺乳類の脳の発達には、翻訳のレベルでの遺伝子発現の適切な制御が必要です。ここでは、発達中の脳におけるmRNAの翻訳状態を評価するための、組み立て易いショ糖勾配および分画プラットフォームを備えたポリソームプロファイリングシステムについて説明する。...

ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析

生きた酵母や哺乳動物細胞におけるホルムアルデヒド架橋を用いた翻訳(タンパク質生合成)複合体を迅速に安定化させる技術を紹介する。このアプローチにより、一過性の中間体と動的RNA:タンパク質相互作用の解剖が可能になります。架橋された複合体は、深いシーケンシングベースのプロファイリング方法、顕微鏡、質量分析など、複数のダウンストリームアプリケーションで使用できます。...

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

ここで紹介するプロトコールは、ショ糖密度勾配遠心分離により 、シロイヌナズナからトランス ラトーム、リボソームに関連するmRNAを非ポリソームおよびポリソームRNAに単離するためのポリソームプロファイリングを含みます。この方法は、熱ストレスを受けた...

ポリソームプロファイルを用いた熱ストレス下での翻訳効率試験

学ぶポリソームプロファイリング手法で、自動分画システムを使わずに細胞内リボソーム活性の分子メカニズムを解析できます。Saccharomyces cerevisiaeを用いた翻訳制御研究に有用です。

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

さらに動画を探す