タンデムアフィニティータグ法を用いた構造解析のためのネイティブ複合体の精製

本プロトコルの全体的な目的は、生物物理学的研究に適した品質の天然高分子複合体を精製することです。本プロトコルは、単に複合体を精製する方法であるだけでなく、精製過程におけるサンプルの構造的品質を評価するための詳細なガイドとしても機能します。本プロトコルの主な利点は、生理的条件に近いバッファー条件下で天然の複合体を簡便かつ迅速に精製でき、組成の均一性を確保できることです。

テキストプロトコルに従ってS.cerevisiae細胞を遠心分離し、上清をデカンテーションした後、冷却したライシスバッファーを2 mL加え、旋回混和するか、または10 mLセロロジカルピペットを用いてペレットを懸濁させます。細胞懸濁液を氷上に保持した空の50 mL円錐形ポリプロピレン遠心チューブに移します。次に、さらに2 mLの冷却したライシスバッファーを用いて各遠心ボトルを洗浄し、その溶液を50 mLチューブに加えます。

細胞ペレットの湿重量を測定した後、50 mLコニカルポリプロピレン遠心チューブ内および周囲に液体窒素バスを作成します。次に、懸濁細胞を5 mLシリンジで吸い取り、シリンジに16Gの針を接続します。その後、細胞懸濁液をシリンジと針を通して液体窒素バスに約1 mL/minの速度で滴下し、液滴を形成させることで凍結させます。

酵母細胞を溶解させるために、まず液体窒素を用いてコーヒーグラインダーを予冷します。次に、最大 40 grams の酵母細胞を加え、25 seconds 間粉砕し、この粉砕工程を 8 回または 9 回繰り返します。一度に精製する細胞培養液の量は 10 liters 以下にすることをお勧めします。

これにより、精製時間を最小限に抑え、複合体の構造的完全性が維持されることを確実にします。2回粉砕するごとに、グラインダーに少量の液体窒素を加え、蒸発させます。細胞の凝集を防ぐため、液体窒素で冷却したスパチュラを用いて細胞を撹拌し、細胞が融解しないようにしてください。

溶解後、細胞は微細な白色粉末状になります。細胞の溶解を確認し、テキストプロトコルに従ってPMSF、DTT、およびプロテアーゼ阻害剤を含む溶解バッファーを調製した後、液体窒素で冷却したスパチュラを使用して、凍結した溶解細胞粉末を調製済みの50 milliliterチューブに入ったバッファーに少量ずつすくい入れます。粉末を加えるたびに、50 milliliterチューブを室温で緩やかに回転させ、細胞を融解・溶解させるとともに、気泡の発生を防ぎます。

細胞が溶解するにつれて、細胞パウダーをさらに追加します。すべての細胞を追加した後、チューブ内に凍結した細胞の塊が見られなくなるまで、細胞の解凍と溶解を続けます。この工程には約50分かかります。

次に、細胞溶解液を 25,000 ×g、4 °C で 20 分間遠心分離します。細胞が溶解し遠心分離が行われると、不溶性ペレットに小さな暗色の層が観察されることがあります。上清をポリカーボネート製超遠心管に移し、満杯のチューブ1本につき 10 µL の 200 mM PMSF を加えます。

サンプルを100,000 ×g、4 °Cで1時間遠心分離します。遠心終了後、4つの層が確認できるはずです。主にリボソーム複合体を含む硬い透明なペレット、脂質に富む柔らかいペレット、細胞の可溶性タンパク質や複合体の大部分を含む黄色味を帯びた大きな透明な層、そして脂質で構成される鱗状の最上層です。

4°Cの低温室にて、1mLピペットを使用して上部の鱗状の脂質層を可能な限り取り除き、廃棄します。10mLセロロジカルピペットを使用して、透明な黄色い層の大部分を回収します。その後、下層の2層を乱さないよう1mLピペットを用いて、この層の残りの数mLを回収します。

40 gの湿潤細胞ペレットから、通常は約48 mLの中間層が回収されます。テキストのプロトコルに従ってIgG sepharoseを調製した後、IgGレジン、中間相上清、および細胞40 gあたり2錠のミニプロテアーゼ阻害剤タブレットを混合します。その後、4 °Cのローテーターで2時間静置します。

これはIgGバッチ溶液です。ポリプレップカラムを2本、先端を切断して開口部を平らにし、10 mL用に準備します。サスペンドIgGレジンスラリーまたはバッチ溶液を各カラムに24 mLずつ注ぎ、重力で沈殿させます。

これは、充填されたIgGレジンの200 µLに相当します。沈降に30分以上かかる場合は、中間相に脂質が混入した可能性があります。沈降が完了したら、10 mLのIgG D150バッファーを4回連続で使用して、充填したカラムを洗浄してください。

カラム内でタバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼによる切断を行うには、カラムの底部を密閉し、1 mLのIgG D150バッファーと100 µLのTEVプロテアーゼを加えます。カラムの上部を密閉し、サーマルミキサーを用いて750 RPM、18 °Cで20分間混合します。レジンを再懸濁し、さらに20分間混合します。

その後、再懸濁し、20分間の混合を3回目まで繰り返します。カラムを4 °Cに戻し、重力を用いてタンパク質複合体を溶出させます。次に、デッドボリュームを溶出させるために200 µLのIgG D150を加えます。

テキストのプロトコルに従ってカルモジュリンアフィニティーレジンを調製した後、カルモジュリン結合バッファーとサンプルをレジンに加え、チューブローテーターを用いて 4 °C で 1 時間インキュベートします。カラムの端を切断して平らな開口部を作成し、カルモジュリンスラリー 100 µL あたり 2 mL の PolyPrep カラムを準備します。プロトコルでは、複合体を濃縮状態に保ち、レジンへの滞在時間を最小限に抑えるために選択された、特定のバッファー量および滞在容量が詳述されています。

培養液の量である場合は、その変更に合わせて重力カラムの樹脂量およびバッファー量を変更することが推奨されます。100 µL 以下のカルモジュリンスラリーを用いてカラムを充填し、重力を用いて 5 mL のカルモジュリン結合バッファーで樹脂を3回洗浄します。200 µL のカルモジュリン溶出バッファーを用いて、タンパク質を3回溶出します。

次に、カラムの底部を封止し、20 µLの溶出バッファーを加えて2.5分間インキュベートした後、封止を解除してタンパク質を重力で溶出させます。再びカラムの底部を封止し、200 µLの溶出バッファーを加えて5分間インキュベートします。その後、カラムの底部を脱封止し、溶液を溶出させます。

6回目にして最後となる溶出では、カラムの底部を密閉し、溶出バッファーで10分間インキュベートします。その後、密閉を解除して溶出させます。精製後の解析を行い、テキストプロトコルに従ってサンプルを保存してください。

ここに示すように、既報のプロトコルに従って複合体の初期TAP精製を行ったところ、銀染色ゲル上で3本のバンドとして移動する複合体が得られました。TAP法の最適化を繰り返し行った結果、ネイティブゲル上で単一のバンドとして移動する複合体が得られ、より均一なアセンブリであることが示されました。ネイティブゲルの結果と一致して、既報のプロトコルで精製した複合体に対し、複合体に対するTAP抗体を用いたウェスタンブロッティングを行ったところ、TAPタグ付きタンパク質であるSNU-71のタンパク質分解が検出されました。

TAP法の改良により、タンパク質分解の量が大幅に減少しました。その結果、U1 snRNP複合体の17種類のタンパク質のほぼすべてがSDS-PAGEで分離され、マルチ質量分析によって正しく同定されました。陰性染色電子顕微鏡法では、TAPの1段階目および2段階目の後の精製に成功した場合に、単分散した粒子が観察されます。対照的に、精製に失敗した場合には、適切なサイズの粒子は観察されません。

最終的な複合体の品質は、ここに示す精製粒子を敷いた状態で評価され、陰性染色EMの生画像では単分散していることがわかります。さらに、粒子のクラス平均により、サンプルが構造解析に適している可能性を示す明確な特徴が明らかになりました。このプロトコルに習熟すれば、凍結溶解細胞パウダーの融解から10〜12時間以内に完了させることができます。

このプロトコルに従う際は、すべての溶液にプロテアーゼおよびヌクレアーゼが含まれていないことを確認し、複合体の凝集や解離を防ぐために迅速に作業することが重要です。このビデオを視聴することで、構造研究に適した品質の天然複合体を精製する方法と、それが達成されたかを確認する方法を理解できるはずです。