タンデムアフィニティータグ法を用いた構造解析のためのネイティブ複合体の精製

このプロトコルの全体的な目標は、生物物理学的研究に適した品質の天然高分子複合体を精製することです。このプロトコルは、複合体を精製する方法としてだけでなく、精製中のサンプルの構造品質を評価するための詳細なガイドとしても機能します。このプロトコルの主な利点は、組成の均質性を確保するために、生理学的に近い緩衝条件下でネイティブアセンブリを簡単かつ迅速に精製できることです。

S.cerevisiae細胞を遠心分離し、テキストプロトコルに従って上清をデカントした後、2ミリリットルの冷却溶解バッファーを加え、渦巻くおよび/または10ミリリットルの血清ピペットを使用してペレットを懸濁します。細胞懸濁液を、氷上に保管された空の50ミリリットルの円錐形ポリプロピレン遠心分離管に移します。次に、さらに2ミリリットルの冷却溶解バッファーを使用して各遠心分離ボトルを洗浄し、溶液を50ミリリットルのチューブに加えます。

細胞ペレットの湿重量を決定した後、50ミリリットルの円錐形ポリプロピレン遠心分離チューブ内およびその周囲に液体窒素浴を作成します。次に、懸濁細胞を5ミリリットルの注射器に引き込み、16ゲージの針を注射器に接続します。次に、細胞懸濁液をシリンジと針に通して1分あたり約1ミリリットルの速度で浴に通して凍結し、液滴を生成します。

酵母細胞を溶解するには、まず液体窒素を使用してコーヒーグラインダーを予冷します。次に、最大40グラムの酵母細胞を加えて25秒間挽き、挽くことを8〜9回繰り返します。一度に10リットルを超える細胞培養物を精製しないことをお勧めします。

これにより、精製時間が最小限に抑えられ、複合体の構造的完全性が維持されます。2ラウンドの粉砕ごとに、液体窒素の浅い層をグラインダーに追加し、蒸発させます。細胞が凝集しないようにするには、液体窒素冷却ヘラを使用して細胞を攪拌することにより、細胞が解凍するのを防ぎます。

溶解後、細胞は細かい白い粉末として現れるはずです。細胞溶解をチェックし、テキストプロトコルに従ってPMSF、DTT、およびプロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液を調製した後、液体窒素冷却スパチュラを使用して、凍結溶解した細胞粉末を調製した50ミリリットルの緩衝液チューブに段階的にすくい入れます。増分を追加するたびに、50ミリリットルのチューブを室温でゆっくりと回転させて、細胞を解凍して溶解させ、気泡が形成されるのを防ぎます。

細胞が溶解したら、細胞粉末をさらに追加します。すべての細胞を添加した後、チューブ内に凍結細胞塊が観察されなくなるまで、細胞の解凍と溶解を続けます。これには約 50 分かかります。

次に、細胞溶解物をgの25,000倍、摂氏4度で20分間遠心分離します。細胞を溶解し、遠心分離を行った後、不溶性ペレットに小さな暗い層が観察される場合があります。上清をポリカーボネート製超遠心チューブに移し、各フルチューブに10マイクロリットルの200ミリモルPMSFを加えます。

サンプルを100、000倍g、摂氏4度で1時間遠心分離します。スピンの終わりには、4つの層が見えているはずです。主にリボソーム錯体を含む硬質透明ペレット。柔らかい脂質が豊富なペレット。大きくて透明な黄色がかった層には、細胞の可溶性タンパク質と複合体のほとんどが含まれています。そして脂質からなるうろこ状の最上層。

摂氏4度の冷蔵室で、1ミリリットルのピペットを使用して、上部のうろこ状の脂質層をできるだけ多く取り除き、廃棄します。10ミリリットルの血清ピペットを使用して、透明な黄色の層の大部分を回収します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、下部の2つの層を乱さないように、この層の最後の数ミリリットルを回復します。

40グラムの湿式細胞ペレットから、通常、約48ミリリットルの中間層が回収されます。テキストプロトコルに従ってIgGセファロースを調製した後、IGG樹脂を中期上清および細胞40グラムあたり2つのミニプロテアーゼ阻害剤錠剤と組み合わせます。次に、摂氏4度のローテーターに2時間置きます。

これがIgGバッチソリューションです。10ミリリットルのポリプレップカラムを2本用意し、カラムの端を切断して平らな開口部を作ります。24ミリリットルの懸濁液IgG樹脂スラリーまたはバッチ溶液を各カラムに注ぎ、重力によって沈殿させます。

これは、200マイクロリットルの充填されたIgG樹脂に相当します。沈降に30分以上かかる場合は、中相が脂質で汚染されている可能性があります。沈降が完了したら、10 mL の IgG D150 バッファーを 4 回連続して使用して、充填カラムを洗浄します。

カラム上でタバコエッチングウイルスまたはTEVプロテアーゼの切断を行うには、カラムの底をシールし、1ミリリットルのIgG D150バッファーと100マイクロリットルのTEVプロテアーゼを追加します。カラムの上部を密封し、750 RPMおよび18°Cのサーマルミキサーを使用して20分間混合します。樹脂を再懸濁し、再度20分間混合します。

次に、再度一時停止し、20分間のミキシングを3回繰り返します。カラムを摂氏4度に戻し、重力を利用してタンパク質複合体を溶出します。次に、200マイクロリットルのIgG D150を加えて、デッドボリュームを溶出します。

テキストプロトコールに従ってカルモジュリンアフィニティー樹脂を調製した後、カルモジュリン結合バッファーとサンプルを樹脂に加え、チューブローテーターを使用して摂氏4度で1時間インキュベートします。カルモジュリンスラリー100マイクロリットルあたり2ミリリットルのポリプレップカラムを調製し、カラムの端を切断して平らな開口部を作ります。このプロトコルでは、複合体を集中させ、その樹脂滞留時間を最小限に抑えるために選択された特定のバッファーと滞留量について詳しく説明します。

文化的なボリュームが変更された場合は、その変更を考慮して、重力カラムの樹脂とバッファーのボリュームを変更することをお勧めします。カラムに 100 マイクロリットル以下のカルモジュリンスラリーを充填し、重力により 5 ミリリットルのカルモジュリン結合バッファーを使用して樹脂を 3 回洗浄します。200マイクロリットルのカルモジュリン溶出バッファーを使用して、タンパク質を3回溶出します。

次に、カラムの底部をシールし、20 μリットルの溶出バッファーを加えて 2.5 分間インキュベートした後、シールを剥がし、タンパク質を重力で溶出させます。カラムの底部を再度シールし、200 μLの溶出バッファーを加えてから5分間インキュベートします。次に、カラムの底部を開封し、溶液を溶出します。

6回目で最後の溶出では、カラムの底部を密封し、溶出バッファーと10分間インキュベートします。その後、開封して溶出します。精製後の分析を実施し、テキストプロトコルに従ってサンプルを保管します。

ここに示すように、公開されたプロトコルに従って複合体の最初のTAP精製を行ったところ、銀染色ゲル上で3つのバンドとして移動する複合体が得られました。TAP法の最適化を複数回行うと、ネイティブゲル上に単一のバンドとして移動した複合体が得られ、より均質なアセンブリが示されました。ネイティブゲルの結果と一致して、公開されたプロトコルに従って精製された複合体に対するTAP抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、TAPタグ付きタンパク質SNU-71のタンパク質分解が検出されました。

TAP法の改良により、U1 snRNP複合体の17種類のタンパク質のほぼすべてがSDS-PAGEによって分離され、マルチ質量分析によって確実に同定されたため、タンパク質分解の量が大幅に減少しました。ネガティブステイン電子顕微鏡は、TAPの第1ステップと第2ステップ後の成功した精製からの単分散粒子を示しています。対照的に、精製が失敗した場合、正しいサイズの粒子は観察されません。

最終的な複雑な品質は、ここに示されている精製粒子の芝生で評価され、ネガティブ染色EM生画像で単分散しているように見えます。さらに、粒子のクラス平均は、サンプルが構造研究に適している可能性があることを示す明確な特徴を明らかにします。このプロトコールを習得すると、凍結溶解細胞粉末を解凍してから10〜12時間以内に完了できます。

このプロトコルに従いながら、すべての溶液にプロテアーゼやヌクレアーゼが含まれていないことを確認し、複合体の凝集や解離を防ぐために迅速に機能することが重要です。このビデオを見た後、構造研究に適した品質の天然複合体を精製する方法と、これが達成されたことを評価する方法を理解できるはずです。