高感度免疫組織化学を使用してシトシンの修飾された形態の検出

この免疫化学プロトコルの全体的な目的は、ペルオキシダーゼ結合二次抗体とチラミド信号増幅法を用いて、さまざまな組織および細胞のコンテクストにおけるシトシンの修飾型の空間分布を評価することです。この手法は、シトシン修飾型の生物学的機能を理解するために必要な空間情報を提供できない他の技術の限界を克服します。さらに、本法ではシトシン修飾型とタンパク質系譜マーカーの共検出が可能であり、それらの核内局在の研究に利用できます。

本手順を開始するには、再水和させた野生型CD1マウス胚および成体脳組織の切片を、氷冷した4%PFAまたは4%FAに室温で15分間浸し、固定します。次に、室温でPBSを用いて切片を5分間洗浄し、余分な固定液を除去します。続いて、PBXを満たしたコプリンジャーに切片を室温で30分間浸し、組織の透過処理を行います。

続いて、切片をPBTで短時間洗浄し、余分なPBXを除去します。次に、透過処理した切片を2 N HClに入れ、室温で60分間置いてDNAの脱プリン化を行います。その後、切片を10 millimolar Tris-Hclに移し、室温で30分間置いてHClを中和します。

あるいは、切片をPBSで5分間ずつ3回洗浄します。切片をPBTに入れ、室温で5分間インキュベートします。その後、組織切片の周囲の液体を慎重に取り除きます。

その間、組織切片を湿った状態に保ちます。疎水性バリアペンを使用して、切片に触れないように周囲を囲みます。その後、湿潤チャンバー内にて、100 µLのブロッキング液で室温で1時間インキュベートします。

次に、組織切片を、ブロッキング液で希釈したマウスモノクローナルanti-5hmC一次抗体（1:5000希釈）100 µLおよびウサギポリクローナルanti-5caC一次抗体（1:1000希釈）とともに、室温で1時間インキュベートします。あるいは、4 °Cで一晩インキュベートすることも可能です。続いて、PBTを満たしたコープリンジャー内で切片を室温で5分間ずつ3回洗浄し、余分な抗体を除去します。

次に、過剰なPBTを除去し、必要に応じて疎水性バリアペンで再度セクションを囲みます。PBTに含まれる界面活性剤によって疎水性バリアが弱くなる可能性があるためです。続いて、ブロッキング溶液を用いて、ヤギ抗ウサギHRP標識抗体を1:400に、ロバ抗マウス555標識抗体を1:400に希釈します。その後、組織セクションを100 µLの二次抗体混合液に入れ、加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。

その後、PBTを満たしたコプリンジャー内で、組織切片を室温で5分間ずつ3回洗浄します。次に、組織切片を、tyramide signal amplification bufferで1:200に希釈した100 µLのtyramide溶液に移し、室温で2分間反応させます。信号強度とtyramideを用いた信号増幅の時間との間に線形関係が認められるため、インキュベーション時間は、使用するtyramide signal amplification kitのロットごとに実験的に最適化する必要があります。

直後に、PBTで5分間ずつ3回洗浄し、余分なチラミド溶液を除去します。PBTを慎重に取り除き、すぐに切片に封入剤を1滴滴下します。組織切片の上にカバーガラスをそっと乗せ、ネイルポリッシュでカバーガラスを密封します。

その後、組織切片を4°Cで数時間保存し、顕微鏡観察に供します。脳組織切片における5hmCの分布を決定するため、このエピジェネティック修飾と、ポストミトーティックニューロンのマーカーであるNeuNとの共検出を行いました。免疫組織化学的解析の結果、顕著な5hmC染色はNeuN陽性細胞と共局在していた一方で、NeuN陰性のグリア細胞ではゲノム5hmCレベルが低いことが明らかになりました。

分化中の神経幹細胞における5caCの分布を決定するため、グリア分化誘導から3日後の固定済み神経幹細胞培養物において、このマーカーとグリアマーカーであるGFAPの共染色を行いました。神経幹細胞や成熟アストロサイトとは異なり、GFAPを発現している大部分の細胞で強い5caCシグナルが観察されました。この手法に習熟すれば、適切に実施することで約8時間で完了できます。

本手順を実施する際は、すべての試薬と材料をサンプルと共に準備しておくことが重要です。本手順に続き、共焦点イメージングを行うことで、シトシンの修飾体の核内分布に関するさらなる疑問を解消することができ、その潜在的な生物学的機能の解明に寄与します。

2 N HClを取り扱う際は非常に危険であるため、本手順を実施する際は、常に安全キャビネットの使用や保護具の着用などの予防措置を講じてください。