マイクロ流体プローブとのライブの細胞層の急速なサブトラクティブパターニング

このビデオ記事で紹介する手法の主な目的は、空間的に定義された細胞パターンを迅速に生成し、細胞間相互作用のin-situ時空間解析を容易にすることです。提示された戦略は、マイクロ流体プローブ技術を活用しています。微細加工されたプローブヘッドは、ナノリットル量の生化学物質を生物学的基質上に局在させ、細胞単層をパターン化します。

MFPベースのパターニング技術の主な利点は、局所的な溶解によりほぼ瞬時に行われるため、パターンのリアルタイムな変更を生成できることです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、細胞パターンを生成する他の方法では、実際に細胞パターンの成功を実感する前に、長い多段階のプロトコルが必要であることに気付いたときでした。細胞表面上の流体力学的流れ閉じ込めで安定した実験を行うには、MFPパラメータを最適化する必要があります。

この目的のためには、視覚的なデモンストレーションが重要です。Aditya KashyapとJulien Corsがこの手順を実演します。プラットフォームの動作モジュールは、電動シリンジ、電動ステージ、およびコントローラーで構成されています。

複合機は電動Zステージに接続され、ヘッドと基板のギャップ距離を制御し、基板ホルダーはスキャンシステムを構成するXおよびY電動ステージに取り付けられています。MFPヘッドには、ポンプステーションに接続するための流体ビア、ヘッドをZステージに取り付けるための取り付け穴、および研磨された頂点から出るチャネルがあります。頂点は、細胞培養基質に対して同一平面上に設定されます。

ポンプステーションと流体処理装置を準備するには、生細胞実験の前と後に超純水で超音波処理と0.5%漂白剤溶液によってシリンジとシリンジプランジャーを洗浄します。それらを水でよくすすいでください。シリンジの先端を水浴に完全に浸し、プランジャーを使用して吸引することにより、シリンジに水を入れます。

シリンジシャフトがシリンジ出口のシールに接触している状態で、ウォーターバス内で液体をパージします。シリンジカラムに気泡が見えなくなるまで、吸引とパージを続けます。.充填されたシリンジをロアロックコネクタを使用してシリンジポンプに接続します。

ポンプに取り付けられたスイッチバルブを使用して、シリンジから液体をMFPヘッドまたは液体リザーバーにつながる2つのキャピラリーの1つに導きます。シリンジのサイズにもよりますが、シリンジのサイズに応じて、シリンジから水で両方のキャピラリーを水でパージし、シリンジに約10マイクロリットルの水が残るまでします。MFPヘッドを、標準的な洗浄にはガラス製品洗剤を、厳格な洗浄には0.5%漂白剤を使用して5分間超音波処理して洗浄します。

頂点を水に浸し、ビアに真空を適用して、チャネルを水でパージします。実体顕微鏡でチャンネルに障害物がないか検査し、必要に応じて前の手順を繰り返します。次に、清掃したヘッドをヘッドホルダーに取り付け、コネクタをヘッドにねじ込みます。

パージされたキャピラリーを、ヘッドのチャネルビアとインターフェースする適切なマイクロ流体コネクタアダプターに挿入します。ヘッドホルダーをZステージにねじ込み、これはヘッドとセル単層との間のギャップ距離の制御に使用され、テキストプロトコルで説明されているエンドポイントキャリブレーションを実行します。MFPヘッドを細胞のないチャンバースライド上に持ってきて、5ミクロンステップでゆっくりと下降することにより、大まかなゼロギャップ距離を取得します。

プローブが基板に接触すると、ニュートンのリングが観察されます。これは大まかな見積もりです。正確な位置は、プローブの頂点と基板の共平面性を調整した後に取得する必要があります。

形成されたら、ニュートンのリングが対称であることを確認してください。プローブの頂点の同一平面性を確保するには、ヘッドとZステージのインターフェースでゴニオメーターを使用してヘッドの傾きを調整します。MFPヘッドを基板から20ミクロン離し、ゴニオメーターを使用して傾きを調整します。

ニュートンのリングが接触に対して対称になるまで、降下、ゼロ調整、および傾斜調整を繰り返します。傾きを調整した状態で、対称的なニュートンのリングを生成する Z 位置を 0 に設定します。次に、テキストプロトコールに記載されているように、インナーインジェクションチャネル用の処理液と、アウトターインジェクションに必要な抽出緩衝液を調製します。

ドレンラインを使用してシリンジポンプに接続し、残りの水をパージし、脱気した溶液をシリンジがいっぱいになるまで毎分40マイクロリットルで注入シリンジに吸引します。これにより、シリンジ、コネクター、キャピラリーの気泡のない充填が保証されます。チャンバースライド上に細胞単層を調製するには、標準的な細胞培養プロトコルを使用してTフラスコで細胞を消費します。

培養フラスコで細胞の合流点に達すると、細胞をトリプシン化して収集します。パターニングのために、2チャンバースライドのそれぞれに1平方センチメートルあたり20万個の細胞を播種します。細胞の増殖と生存率のコントロールとして、チャンバーの1つで細胞を使用して48時間にわたって細胞を培養します。

チャンバースライド上の細胞コンフルエンスに到達したら、無血清培地で調製した10マイクロモル濃度の500マイクロリットルのCell-Tracker色素溶液と細胞を45分間インキュベートします。これは、パターニング中の細胞の可視化のために行われます。標識した細胞をPBSで洗浄し、ピペットを使用して各チャンバーを静かに洗い流します。

その後、パターニング実験のために血清添加培地で細胞を培養します。流体力学的流れ閉じ込めは、処理液の同時注入と吸引を使用して液体を局在化します。階層的な閉じ込めでは、複数の処理液が閉じ込められ、外側のHFCがサンプルを内側の処理HFCから保護します。

MFPをセル単層上に移動し、スライドガラスから50ミクロンのギャップ距離にします。このギャップ距離により、階層的なHFCの接触が確保され、単層の表面と厚さの変動も考慮されます。I-twoを介して毎分6または8マイクロリットルで水酸化ナトリウムを注射します。

テキストプロトコルのフロールールを使用して、他の流量を評価します。注入シリンジを使用して注入流量QI-twoとQI-oneの比率を変更することにより、内部HFCのサイズを調整します。たとえば、毎分1.3マイクロリットルから毎分4マイクロリットルのQI-oneを使用し、QI-twoを毎分8マイクロリットルに固定すると、水酸化ナトリウムのフットプリントは150〜300セルになります。

MFPヘッドの最も外側の開口部から毎分20マイクロリットルの流量で完全な培地を注入し、hHFCの操作中の培地の蒸発と吸引を考慮します。細胞単層をパターン化するには、ステージソフトウェアを設定して、プローブヘッドを細胞単層上にユーザー定義のパターンでスキャンし、スキャン速度10ミクロン/秒、ギャップ距離50ミクロンでスキャンします。ネストされたhHFCが動作中で、単分子膜と接触している状態で、目的のパターンの軌道でMFPをスキャンして、パターン化された細胞の除去を行います。

最初の細胞タイプの除去後の共培養では、以前と同様に、ギャップを埋めるために別の細胞株を播種します。ライセートの下流分析のためにサンプリングステーションを準備します。ここに示されているのは、3Dプリントされた8ストリップPCRホルダーで構成されるサンプリングステーションの例です。

チューブホルダーは、用途に必要な厳しさに基づいて、70%エタノールまたはその他の表面汚染物質で拭きます。チューブホルダーの磁気クリップを使用して、基板ホルダーに取り付けます。サンプリングステーションを準備した後、MFPヘッドを単層から100ミクロンの位置に配置します。

50ミリモルの水酸化ナトリウム溶液をインナー注入チャネルの処理液として、QI-oneは1マイクロリットル/分、QI-twoは毎分6マイクロリットル、QA-oneはマイナス7マイクロリットル/分、QA-twoはマイナス17.5マイクロリットル/分の流量でhHFCを運転開始します。フローの閉じ込めが安定したら、プローブヘッドを50ミクロンのギャップ距離まで下降させ、hHFCを持つ細胞の選択した亜集団で水酸化ナトリウムベースの局所溶解を行います。亜集団の溶解が完了したら、ヘッドをサンプリングステーションのチューブに向けます。

収集したライセートをPCRチューブに直接排出します。テキストプロトコルに記載されているようにライセートを処理した後、装置のサプライヤーが設定した標準のqPCRワークフローにライセートをロードします。階層型HFC内の注入液の比率を制御することにより、細胞表面と接触するフットプリントのサイズが調整されます。

流速は、せん断ではなく化学的効果が細胞溶解の主要なメカニズムであるように選択されました。これは、計算流体力学を使用してせん断を決定することによって裏付けられました。ここに示されているのは、複合機で走査軌跡プログラミングを行うことによるセルアイランドのグリッドの生成です。

注入液比を使用してフットプリントサイズを調整することで、細胞除去の分解能を制御することができます。この方法は、複数の細胞集団の逐次共培養に使用できるため、細胞間相互作用の複雑なパターンを生成できます。処理液として水酸化ナトリウムを使用することで、ライセートは細胞のPCRベースの分析に適合します。

ここでは、DNA含量を5つおよび1つのフットプリントから定量化し、記載の方法を用いて溶解した。この手法を習得すると、30分以内に細胞に対して実行できます。この手順を試みるときは、HFCに悪影響を与える可能性があるため、チャネルとキャピラリーに気泡がないことを確認することを忘れないでください。

腐食性の化学溶液である水酸化ナトリウムの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に安全メガネや白衣などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。この手順に続いて、免疫染色またはMFP媒介溶解によるDNA-RNAシーケンシングによって細胞を局所的に解析し、細胞の幾何学的な閉じ込めによりどのタンパク質が過剰発現するかなどの追加の質問に答えることができます。この技術は、開発後、分子生物学の分野の研究者が組織の生成と変性における細胞間および細胞外のシグナル伝達を探求するための道を開くことができる。

このビデオを見れば、MFPでローカルプロセッシング用に設定された細胞単分子膜をサブトラクティブにパターン化する方法や、細胞の共培養の複雑な形状を作成する方法について十分に理解できるはずです。