マイクロ流体プローブとのライブの細胞層の急速なサブトラクティブパターニング

本ビデオ記事で提示する手法の主な目的は、細胞間相互作用のin-situでの時空間解析を容易にするために、空間的に定義された細胞パターンを迅速に作成することです。提示した戦略では、マイクロ流体プローブ技術を利用しています。微細加工されたプローブヘッドを用いて、ナノリットル量の生化学物質を生物学的基質上の局所に配置し、細胞単層のパターンを形成します。

MFPを用いたパターニング技術の主な利点は、局所的な溶解によりほぼ瞬時に完了するため、生成されるパターンのリアルタイムな修正が可能である点です。この手法を考案したきっかけは、細胞パターンを生成する他の手法では、実際にパターンの成功を確認するまでに、時間がかかる多段階のプロトコルを必要とすることに気づいたことでした。細胞表面に流体的な流れの閉じ込めを用いて安定した実験を行うには、MFPのパラメータを最適化する必要があります。

この目的のためには、視覚的な実演が不可欠です。Aditya KashyapとJulien Corsが本手順を実演します。プラットフォームの動作モジュールは、電動シリンジ、電動ステージ、およびコントローラーで構成されています。

MFPはモーター駆動のZステージに接続されており、ヘッドと基板の間のギャップ距離を制御します。また、基板ホルダーはスキャンシステムを構成するXおよびYのモーター駆動ステージに取り付けられています。MFPヘッドには、ポンピングステーションに接続するための流体ビア、ヘッドをZステージに固定するための取付穴、および研磨された頂点（アペックス）から出るチャネルが備わっています。この頂点は、細胞培養基板と同一平面になるように設定されます。

ポンプステーションおよび液体操作装置を準備するため、生細胞実験の前後に、シリンジとシリンジプランジャーを超純水中の0.5%漂白剤溶液で超音波洗浄します。その後、水で十分にすすいでください。シリンジの先端をウォーターバスに完全に浸し、プランジャーを用いて吸引することで、シリンジに水を満たします。

シリンジの出口にあるシールにシリンジシャフトを接触させた状態で、ウォーターバス内で液体をパージします。シリンジのコラム内に気泡が見えなくなるまで、吸引とパージを繰り返します。充填済みのシリンジを、ロワーロックコネクタを用いてシリンジポンプに接続します。

ポンプに取り付けられた切替バルブを使用して、シリンジからの液体を、MFPヘッドまたは液体リザーバーのいずれかに導く2本のキャピラリーのどちらか一方に方向付けます。シリンジのサイズに応じて、約10〜50 µL/minの流速で、シリンジに約10 µLの水が残るまで、両方のキャピラリーを水でパージします。標準的な洗浄にはガラス器具用洗剤を、厳格な洗浄には0.5%次亜塩素酸ナトリウムを用い、5分間超音波処理してMFPヘッドを洗浄します。

先端を水に浸し、ビアに真空をかけることで、チャネル内を水で洗浄します。実体顕微鏡下でチャネルに詰まりがないか確認し、必要に応じて前の手順を繰り返します。次に、洗浄済みのヘッドをヘッドホルダーに取り付け、コネクタをヘッドにねじ込みます。

パージ済みのキャピラリーを、ヘッドのチャンネルビアと接続する適切なマイクロ流体コネクタアダプタに挿入します。テキストプロトコルに記載されているエンドポイント校正を行う前に、ヘッドと細胞単層間のギャップ距離を制御するためのZステージにヘッドホルダーをネジで固定します。細胞のないチャンバースライドの上にMFPヘッドを配置し、5 µmステップでゆっくりと下降させ、おおよそのゼロギャップ距離を決定します。

プローブを基板に接触させた際、ニュートンの環が観察されるはずです。これは概算の推定です。プローブ先端と基板の共面性を調整した後、正確な位置を決定します。

ニュートンリングが形成された際、それが対称であることを確認してください。プローブ先端の共面性を確保するため、ヘッドとZステージのインターフェースにあるゴニオメーターを使用して、ヘッドの傾きを調整します。MFPヘッドを基板から20 microns離し、ゴニオメーターを用いて傾きを調整してください。

ニュートンリングが接点において対称になるまで、降下、ゼロ点合わせ、および傾斜調整を繰り返します。傾斜が調整され、ニュートンリングが対称になった状態で、Z位置をゼロに設定します。次に、テキストプロトコルに従い、内部注入チャンネル用の処理液と外部注入に必要な抽出緩衝液を準備します。

ドレインラインをシリンジポンプに接続し、残った水をパージした後、脱気した溶液を40 µL/minの速度で注入用シリンジに、満杯になるまで吸引します。これにより、シリンジ、コネクタ、およびキャピラリー内に気泡が入らずに充填されます。チャンバースライド上の細胞単層を調製するために、標準的な細胞培養プロトコルを用いてTフラスコ内で細胞を増殖させます。

培養フラスコ内で細胞がコンフルエントに達したら、トリプシン処理して細胞を回収します。パターニング用に、2チャンバースライドの各チャンバーに1cm²あたり0.2 million cellsで播種します。48時間培養し、一方のチャンバーの細胞を細胞増殖および生存率のコントロールとして使用します。

チャンバースライド上の細胞がコンフルエンスに達したら、無血清培地で調製した10 µM濃度のセルトラッカー染料溶液500 µLを加え、45分間インキュベートします。これは、パターニング中の細胞可視化のために行います。ピペットを用いて各チャンバーを穏やかに洗浄し、ラベル化した細胞をPBSで洗浄します。

続いて、パターニング実験のために、血清添加培地で細胞を培養します。流体的な流れによる閉じ込め（hydrodynamic flow confinement）は、処理液の同時注入と吸引によって液体を局在化させます。階層的閉じ込めでは、複数の処理液が閉じ込められ、外側のHFCが内側の処理HFCからサンプルを保護します。

MFPを細胞単層の上に移動させ、ガラススライドから50 µmの隙間距離に設定します。この隙間距離により、階層的HFCの接触が確保され、単層の表面および厚みの変動にも対応できます。I-2を通じて、水酸化ナトリウムを6または8 µL/minで注入します。

テキストプロトコルの流量規定に従い、他の流量で評価してください。注入用シリンジを用いて注入流量 QI-two と QI-one の比率を変更し、内部 HFC のサイズを調整します。例えば、QI-two を 8 µL/min に固定し、QI-one を 1.3 µL/min から 4 µL/min の間で調整することで、水酸化ナトリウムのフットプリントを 150 から 300 個の細胞分にします。

培地の蒸発およびhHFCの動作中の吸引を補うため、MFPヘッドの最も外側の開口部から完全培地を20 microliters per minuteの流量で注入します。細胞単層をパターニングするために、ステージソフトウェアを設定し、スキャン速度10 microns per second、ギャップ距離50 micronsで、ユーザー定義のパターンに従ってプローブヘッドを細胞単層上でスキャンさせます。ネストされたhHFCを動作させ、単層に接触させた状態で、所望のパターンの軌道に沿ってMFPをスキャンし、パターニングされた細胞除去を行います。

最初の細胞種の除去後の共培養では、前述と同様に、隙間を埋めるために別の細胞株を播種します。ライセートの下流分析に向けてサンプリングステーションを準備します。ここでは、3Dプリンターで作成した8連PCRホルダーで構成されるサンプリングステーションの例を示します。

用途に応じて必要な厳格さに合わせ、チューブホルダーを70% ethanolまたはその他の表面除染剤で拭きます。チューブホルダーにあるマグネットクリップを使用して、基板ホルダーに固定します。サンプリングステーションの準備が完了したら、MFPヘッドを単層から100 micronsの位置に配置します。

hHFCの操作を開始します。内部注入チャネルの処理液として50 millimolar 水酸化ナトリウム溶液を用い、流量をQI-oneで1 µL/min、QI-twoで6 µL/min、QA-oneで-7 µL/min、QA-twoで-17.5 µL/minに設定します。流体閉じ込めが安定したら、プローブヘッドをギャップ距離50 µmまで降ろし、hHFCを用いて選択した細胞サブポピュレーションに対して水酸化ナトリウムによる局所溶菌を行います。サブポピュレーションの溶菌が完了した後、ヘッドをサンプリングステーションのチューブへと移動させます。

回収したライセートをPCRチューブに直接排出します。本文のプロトコルに従ってライセートを処理した後、装置メーカーが指定する標準的なqPCRワークフローにライセートを投入します。階層的HFCにおける注入液の比率を制御することで、細胞表面に接触するフットプリントのサイズを調節できます。

せん断力ではなく化学的効果が細胞溶解の支配的なメカニズムとなるよう、流速を選択しました。これは、数値流体力学を用いてせん断力を決定することで裏付けられました。ここでは、MFPの走査軌道プログラミングによる細胞アイランドのグリッド生成を示します。

注入液の比率を用いてフットプリントサイズを調節することで、細胞除去の解像度を制御することが可能です。この手法は、複数の細胞集団を順次共培養させるために利用でき、それにより細胞間相互作用の複雑なパターンを構築できます。処理液として水酸化ナトリウムを使用することで、ライセートをPCRベースの細胞解析に適応させることができます。

ここでは、上述の方法を用いて溶解した5つのフットプリントと1つのフットプリントからDNA含量を定量しました。この手法を習得すれば、30分以内に細胞の処理を行うことが可能です。本手順を実施する際は、チャネルおよびキャピラリーに気泡がないことを確認することが重要です。気泡があると、HFCに悪影響を及ぼす可能性があります。

腐食性化学溶液である水酸化ナトリウムを取り扱う際は非常に危険であるため、本手順の実施中は常に安全ゴーグルや白衣などの予防策を講じることを忘れないでください。本手順の後、免疫染色による細胞の局所分析や、MFP介在性溶解によるDNA-RNAシーケンシングを行うことで、細胞の幾何学的閉じ込めによってどのタンパク質が過剰発現しているかなど、さらなる疑問に対する解析が可能です。本手法の開発により、分子生物学分野の研究者が組織の生成および退行時における細胞内および細胞外シグナル伝達を探索するための道が開かれることが期待されます。

このビデオを視聴することで、局所的な処理のためにMFPで構築した細胞単層を減算的にパターニングし、細胞共培養の複雑な幾何学的構造を作成する方法について十分に理解することができます。