Name: マイクロ流体プローブとのライブの細胞層の急速なサブトラクティブパターニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学ぶマイクロ流体プローブを用いた細胞単層の減算パターニング法。局所的な細胞溶解によりリアルタイムでパターンを修正し、細胞間相互作用の時空間解析を可能にする革新的な技術です。

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この作業は、第7次フレームワークプログラム（プロジェクト番号311122、BioProbe）の下で、欧州研究会議（ERC）のスターティンググラントの支援を受けました。私たちは、プロトコルとプラットフォームの開発中に技術支援と議論をしてくれたJulien Autebert博士とMarcel Buergeに感謝します。Petra Dittrich教授(ETHチューリッヒ)、Bradley Nelson教授(ETHチューリッヒ)、Bruno Michel博士、Walter Riess博士の継続的な支援が認められています。

1. MFPヘッドとプラットフォームのクリーニングと準備注：このプロトコルは、MFPが15,16ヘッド縦型シリコン・ガラスハイブリッドを使用しています。ヘッドのシリコン成分は、100μmの深さまでエッチングされたマイクロチャネルを、含まれています。エッチングされたシリコンを陽極接合を用いてガラスに接合されています。チャネルの設計は、液浸液（ 図1）を注入するための6チャネル、注入及び吸引用の2つのそれぞれ、および2つからなるパターンを含みます。浸漬液を注入するために使用されるチャネルは、このように吸引し、蒸発による損失を回避し、生物学的サンプルを周囲の媒体を補充します。内側チャンネルと現在の仕事で使用される外側のチャンネルは100×100μmでそれぞれ200×100μmです。ポスト製造および処理、クリアなチャネルと洗練頂点とMFPヘッドが得られます。 <ol><li> ポンプステーションと流体ハンドリングの調製装置<ol><li>注射器に接続されているすべてのチューブのための1/16 &#39;&#39;（1.59ミリメートル）の外径および0.02 &#39;&#39;（0.51ミリメートル）内径の毛細管を使用してください。アプリケーションに基づいて、毛細管サイズを変更し、注射器でMFPヘッドをインターフェースするために適切なコネクタおよび付属品を得ます。希釈が必要で、どこにいても、超純水を使用してください。 </li><li>超純水の前対と後生細胞実験では0.5％の漂白剤溶液中で超音波処理により - （500μlの容量250）とシリンジプランジャクリーンシリンジ。水でそれらを徹底的に洗浄します。水浴中で完全にその先端を浸漬し、プランジャーを使用して吸引することにより、水でそれらを埋めます。一方、注射器の出口にシールを接触させ、シリンジ軸と水浴内の液体をパージします。空気の泡がシリンジ列に見られなくなるまで吸引パージを繰り返します。 </li><li>ルアーロックコネクタを使用して、シリンジポンプに充填された注射器を接続します。搭載された切替弁を使用してくださいMFPヘッドにまたは液体貯蔵槽（ 図6）のいずれかをリードする2つの毛管のいずれかに注射器から液体を方向付けるためのポンプ。 （何の切替弁が利用できない場合はセクション1.4.4を参照してください）​​。水の約10μlのがシリンジ内に残されるまで、シリンジのサイズに応じて、50μL/分 - 約10の流速で注射器から水と毛細血管の両方を消去します。 </li><li> （ -資料を参照してください。 例えば、M1コネクタ）ヘッドのチャネルのビアとのインタフェースを適切なマイクロ流体コネクタ/アダプタにパージ毛細血管を事前に挿入します。 </li></ol></li><li> MFPヘッドの準備 <ol><li> 5分間、厳しい洗浄のための標準的な洗浄または0.5％の漂白剤用ガラス製品の洗剤を使用して超音波処理によるMFPヘッドを清掃してください。水に頂点を浸漬し、ビアに真空を適用することにより、水とチャンネルをパージします。 </li><li>潜在的な障害物（目詰まり）と再用実体顕微鏡下でチャンネルを点検必要に応じて、前のステップを泥炭。 </li><li>ヘッドホルダにクリーンヘッドをマウントして、頭の上に事前に挿入され、パージチューブとコネクタをネジ止めします。頭部および細胞単層との間のギャップ距離を制御するために使用されるZステージにヘッドホルダねじ。 </li></ol></li><li> MFPプラットフォームの走査ステージを校正 <ol><li>適切なソフトウェアインターフェースを備えた製造業者のプロトコルに従って、プラットフォームにヘッドを接続する前に、X軸、Y軸およびZ-ステージのエンドポイントキャリブレーションを実行します。キャリブレーションされたステージは、MFPヘッドの位置決め精度を確保します。 </li><li>細胞を含まないチャンバースライド上でMFPヘッドをもたらし、ゆっくりと5μmのステップで下降することにより、粗ゼロギャップ距離（ゼロ）を取得します。基板とプローブ接触すると、ニュートンリングが観察されるはずです。これは、粗推定値です。正確な位置はsubstratにプローブ頂部のコプラナリティを調整した後に得られるべきです電子。 </li><li>プローブ頂点のコプラナリティを確保するために、（頭のインタフェースおよびZステージで）ゴニオメーターを使用して、ヘッドの傾きを調整します。形成されたときにニュートンリングが対称（ 図1）であることを確認してください。 20μmの基板から離れMFPヘッドを移動し、ゴニオメータを使用して傾きを調整します。繰り返し下降、ニュートンリングが接触して対称になるまでゼロとチルト調整。チルト調整では、ゼロとして対称ニュートンリングを生成zの位置を設定します。 注：XYステージは、基板（ 図2）の走査を制御する一方、Zステージは、ヘッドと基板の距離を制御します。詳細な説明は、私たちの以前の研究14で見つけることができます。 </li></ol></li><li> 細胞層の局所的な除去のための化学的製剤 注意：必要に応じて、用意されている化学物質のために（ 例えば 、ニトリル手袋、安全眼鏡を）安全装置を使用しています。ヒュームHOOを使用します必要に応じて溶液を調製するためのDは希釈剤として超純水ですべての化学物質およびバッファを準備します。 <ol><li>内側の注入チャンネル（ 図1のフローQ I2とI2）のための処理液として50mMのNaOH溶液を準備します。 </li><li> 50 mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンで抽出バッファを1mMからなる外注射のために必要な溶液（ 図1の流量Q I1とI1）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、0.5％のツイーン20、及び10μMのローダミンBを準備パージのためのpH 8.、吸引注射器で水を使用しています。 </li><li> 0.2μmシリンジフィルターを使用して、すべてのソリューションをフィルタリングします。ドガは、すべての面にバブリング溶存空気停止するまでデシケーターを使用してソリューションを濾過しました。 </li><li>シリンジポンプに接続されたドレイン線を使用して、残余の水をパージし、シリンジ（250または500μl）をいっぱいになるまでの40μl/分で注入シリンジに脱気ソリューションを吸引。これは、気泡のない注射器の充填、コネクタ、および毛細血管を保証します。注射器スイッチバルブ-2-キャピラリーシステムは、注射器の半ば実験の充填を可能にします。このような切替弁が存在しない場合には、ヘッドからの毛細血管を切断し、頭部にそれらを再接続する前に脱気したソリューションを吸引することにより、毛細血管および注射器を埋めます。 </li><li>毛細血管を介して処理し、シールドの液体を吸引すると、動作中に、小容量の使用を可能にします。化学物質が大量に調製することができる場合は、直接、必要な溶液で注射器を充填します。例えば、水を含む吸引注射器は、このアプローチを使用して充填することができます。 </li><li> 1.4.1と1.4.2で定義されているように、各チャネルのために割り当てられた液体とMFPヘッドにキャピラリをパージします。 注：抽出緩衝液は、内側閉じ込め中​​のNaOHを遮蔽し、緩衝液中のローダミン成分は番目の可視化を容易にします動作中の電子hHFC。 </li><li>細胞は、細胞凝集体が培養表面に現れると、過剰コンフルエントである場合は、10％のプロテイナーゼKで抽出緩衝液を補足これは、溶解物を吸引チャンネルに入るように変性したタンパク質を溶解することによってこれらの凝集体でのNaOHの作用を補足します。これは、動作中のチャネルの目詰まりを防ぐことができます。 </li></ol></li><li> チャンバースライド上の細胞単層の調製 注意：細胞を培養するための細胞培養フードを使用して、実験室でのバイオセーフティ担当者によって設定された規則に従って機器を扱います。特定の細胞株の特別な要件に注意し、それに応じてプロトコルや機器を適応させます。 <ol><li>文化や細胞の拡大のために使用する細胞培養インキュベーター（5％CO 2で、37ºCで）がパターン化されます。 Tフラスコ内で標準的な細胞培養プロトコル17,18を使用して拡張を行います。特定のセルの要件に応じて培養培地を使用してくださいリットルライン（ 例えば 、血清および抗生物質は、MCF7とMDAMB 231を培養するためのDMEMを補足します）。 </li><li>培養フラスコに細胞コンフルエンスに達すると、トリプシン処理し、48時間かけてパターニングと文化のための2チャンバースライドの各セルとシード2×10 5細胞/ cm 2を収集します。細胞の増殖および生存のためにコントロールとしての室のいずれかで細胞を使用してください。 </li><li>無血清培地中で調製10μMの濃度で、チャンバースライド上の細胞コンフルエンスに達すると、500μlの細胞トラッカー色素溶液（CMRA - - CMFDAまたはオレンジ例えば 、緑色）で45分間、細胞をインキュベートします。これは、パターニングの際に、細胞の可視化のために行われています。静かにパターニング実験のために血清を補充した培地中で細胞をピペットを用いて、その後、文化の各チャンバーを洗浄することによりPBSで標識された細胞を洗浄。 </li><li>細胞計数のために、細胞トラッカー染色された細胞表面の基準画像を取得します。これは保証するために行われています細胞層の密集。また、サンプルの回収およびDNA分析が目的であれば定量化実験のための助剤として機能します。 注：細胞生存率は、パターニング時に評価されるべきである場合には、細胞は、製造者の指示に応じて、生/死細胞毒性キットを用いて染色することができます。 </li></ol></li></ol> 2.作成階層的流体力学的流動閉じ込め（hHFC） <ol><li>ガラススライドから50μmのギャップ距離に細胞単層上でMFPを移動します。 hHFCの接触を確保しつつ、このギャップ距離は、また、単層の表面と厚さの変化を占めます。 </li><li> i2を介して6または8μL/ minでのNaOHを注入します。 図3のフロールールを使用して、他の流量（ すなわち、Q I1、Q A1とQ A2）を評価します。 </li><li>注射器を使用してQ I2 / I1 Qの比を変化させることにより、内側HFCの大きさを調節します。300細胞（100 - - 200μmの2 /セル）（Q I2が 150のNaOHのフットプリントをもたらす8μL/分に固定して、例えば、1.3μL/分および4μL/分の間Q I1を使用図3D）。 </li><li> hHFCの動作中に媒体と吸引の蒸発を考慮して20μL/分の流速でMFPヘッド上の最も外側の開口部から完全培地を注入します。 </li></ol> hHFCを使用した3パターニング細胞単層注：スキャンパターンは、特定の生物学的な質問を研究するために、残りの細胞を残して、細胞が抽出された細胞単層（サブトラクティブパターニング）の領域を決定します。このパターンは、例えば、直線又はスポットのアレイとすることができます。複雑なパターンは、適切な走査軌跡の設計を必要とします。例えば、市松走査軌跡は、 図4（a）の例に示す細胞領域（のグリッドを提供します</stronグラム&gt;）、近接しながら別の正方形のセルに異なる刺激の効果を研究する有効であろう。これらのパターンは、制御ソフトウェアは、細胞単層上でMFPヘッドのスキャン軌道のスクリプトを可能にするプラットフォームのXYステージの制御を使用して作成することができます。 <ol><li> 50μmのギャップ距離で10ミクロン/秒のスキャン速度で（X、YおよびZ座標を設定することにより）ユーザ定義パターンで細胞単層を介してプローブヘッドをスキャンする段階ソフトウェアを設定します。 </li><li>ネストされたhHFC操作で単層に接触すると、パターン化された細胞の除去を達成するために、所望のパターンの軌道でMFPをスキャンします。 </li><li>第1の細胞型を除去した後、共培養のために、セクション1.5に記載の方法を用いて、ギャップを埋めるために、異なる細胞株をシード。細胞の除去を制御する（例えば、ギャップ距離を増加させることによって）、ネストされたとピンチモードの間で移動します。 注：スキャン速度はinvestiしなければならないことがあります他の細胞株のためのゲーティング。使用した細胞株のためにスキャンされた領域上に、このデモの影響完全な細胞の除去に使用される走査速度。 </li></ol>サンプリングとDNA増幅のための4ダウンストリーム処理<ol><li>溶解物の下流の分析のためのサンプリングステーションを準備します。サンプリングステーションの場合、3Dは8ストリップPCRチューブホルダーを印刷してください。代替的に、基板の外部ヘッドの走査範囲内に装着されることができる、このアダプタとして機能するために適切なチューブホルダーを選択します。 70％エタノールまたは用途に所望のストリンジェンシーに基づいて、他の表面除染とチューブホルダを拭いてください。基板ホルダー上にそれを接続するチューブホルダーに磁気クリップを使用してください。 </li><li>サンプリングステーションを準備した後、単層から複合機ヘッドは100μmを置きます。 1の流量で内部注入チャンネル用の処理液として50mMのNaOH溶液でhHFCの動作を開始6それぞれQ I1、Q I2、Q A1とQ A2ため、-7および-17.5μL/分。 <ol><li>フロー閉じ込めが（約10秒で）安定した後、hHFCによる細胞の選択された亜集団のNaOHをベースのローカル溶解を実行するために50μmのギャップ距離にプローブヘッドを下降。亜集団の溶解が（設置面積あたり約30秒）完了すると、サンプリングステーションでチューブに向かって頭を向けます。 （ 図6）を直接PCRチューブに回収し、溶解物を取り出します。 </li></ol></li><li>溶解物の下流処理のために、第一のトリス緩衝液（1：1）を用いて溶解物を混合することによって溶液のpHを中和します。中和した後、30分間、95ºCに溶解物を加熱します。機器のサプライヤーによって設定されるように、直接、標準のqPCRワークフローにライセートをロードします。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

我々は、空間的に規定されたセルパターンの迅速な生成を可能にする細胞単層のサブトラクティブパターニングのための汎用的なプロトコルを提示します。細胞単層の選択的な溶解はhHFCにおける処理液として水酸化ナトリウムを用いて行われます。 NaOHを瞬時に細胞膜に含まれるタンパク質を変性させます。私たちは、溶解物の下流の処理を確実にするためのNaOHの50 mMの濃度を使用することをお勧めします。この濃度は、提供ライセート下流の処理が目的ではない、より迅速な細胞を除去するために増加させることができます。 hHFCは、細胞単層の未処理の周辺地域には影響されないままとパターンを拡大または細胞の他の特性をプロービングのいずれかのために利用可能であることを保証します。 細胞除去の速度は、流れによって提示化学および剪断の両方の関数です。私たちは、化学支配的な細胞除去を持つように流量の動作範囲を選択します。 20＆＃ - 10のスキャン速度181; M /秒6のNaOHを注入流量用い - 8μL/分を「迅速」サブトラクティブパターニングを容易にするために使用されます。細胞除去の急速な速度は、表面印刷によるパターニングが直面するいくつかの課題が20,21に近づく対処します。これらの方法は、マイクロコンタクト印刷及びパターンを得るために、細胞のその後の播種を介して細胞接着タンパク質の選択的堆積によって、例えば、空間的に定義された領域内の細胞の成長を制限するためのメカニズムを必要とします。彼らは低いスループットによって制限され、パターン生成のためのいくつかの連続した​​工程と同様に、各パターンのための新しいステンシル/スタンプを必要としています。記載された方法は、定義された領域上の細胞の選択的増殖を必要とし、細胞培養用基板の任意の追加の処理を必要としないが、印刷とは対照的に、サブトラクティブパターニングを行うことにより、いくつかの制限を克服しません。 本稿で概​​説したプロトコル、パターニング細胞単層のスループットを持ちます生成されたパターンの即時の視覚的なフィードバックを得ながら、増加されます。これは、パターンのリアルタイムの変更を容易にします。このような制御は、所定の表面上の細胞生存率が均一でないであるシナリオにおいて非常に重要であるかもしれません。この方法の別の利点は、同じヘッドと化学それによりパターン化細胞単層を生成する手順の数を減少させる、複数のパターンを生成するために使用することができることです。 頭の中のチャネルとヘッドの形状の寸法は、このようにパターニングの解像度を制御することができ、アプリケーションの要件に応じてスケーリングすることができます。現在作業中のすべての実験は、200×100μmと100×100ミクロンと外側の開口部で、内側の開口部と特異的に、固定された開口寸法を有するMFPヘッドを用いて行きました。大きな外開口を有するこの設計は、によって開口部の目詰まりせずhHFCの連続稼働を保証するために選ばれました浮遊細胞の破片。我々は、細胞除去で成功した結果と、内側の開口寸法50×50μmで、それらの間の50μmの間隔で頭をテストしました。ダウン10×​​10〜10μmで間隔が小さい開口部の使用は、このようにパターニングで高い解像度を可能にする、より小さなフットプリントのサイズ（〜30×30ミクロン）にスケーリングを可能にするであろう。我々は、微粒子からの目詰まりによる10ミクロンよりも小さいサイズの開口部と操作上の問題を観察しました。そのため、このような運用の難しさを、100μmの解像度の電流制限と記載された技術のこのような制限はあります。しかし、我々はhHFCの液体シェーピング機能を使用してこの問題に対処することができます。我々は、細胞除去の解像度がQ I2 / Q I1（ 図4b）と頂点と基板の隙間10,14を制御することにより、開口部の大きさの所与のセットのために調整することができることを実証しました。現在の研究で使用されるステージは、100nmの最小ステップサイズを有します。これらの制御パラメータの組み合わせは、フットプリントのサイズと走査距離の点で細胞除去の空間分解能を向上させることができます。 パターン化共培養は、異なる細胞型の間の特異的な細胞 - 細胞相互作用を研究するために所望される場合、シーケンシャル播種およびパターニング記載のプロトコルを用いて行うことができます。最後に、高品質の増幅DNAは、DNA内の単一のピークであることから明らかなように、溶解物から得ることができる（ 図7を参照）曲線を溶かします。私たちは、理論上の期待値（6-8 PG /セル）に近い定量PCRを使用して、単一のフットプリント（約300細胞）から周りの1.6 ngののDNA量を評価しました。これは、任意のDNA単離法の使用を回避しながら、いくつかの下流のプロセスに適した抽出されたDNAの量を示します。これは、DNA分析に基づく培養細胞のプロービングローカルのための道を開きます。液体を形成するhHFCの能力はまた、ACの生細胞およびタンパク質を堆積させるために使用することができますサブトラクティブパターニングとの組み合わせと共培養シーケンシャルにこのプロトコルで提示tivated表面は、培養基板上に複雑な細胞および細胞 - マトリックスパターンの作成が可能になります。汎用性とhHFCベースのサブトラクティブ細胞単層のパターニングおよび抽出した細胞にDNA分析を行うことの可能性によって提供される制御は、細胞間相互作用に関与する空間分解の研究を行うために生物学者に設定強力な新しいツールを提供します。

彼らのネイティブ環境では、生物学的組織中の細胞は、それらの成長、組織、および開発を指向する生化学的および物理的な手がかりの範囲を知覚します。これらの手がかりを理解することは、細胞 - 細胞および細胞 - マトリックス相互作用の選択的な調査が必要。これは、細胞単層をパターニングするための方法の開発を必要とします。メソッド文化（パターニング）で幾何学的に別個の異なる細胞型への細胞生物学における物理的および化学的手がかりの広範な研究を可能にします。パターニング細胞層のための現在のアプローチのほとんどは、1から4 は、表面に細胞接着タンパク質を付着させるか、基板上の選択成長のための微細加工ステンシルを使用してによって異なります。これとは対照的に、ここでは、単層の選択された領域内の細胞を除去することにより、培養液中のすなわち 、細胞、 その場で急速にパターンの細胞単層への方法を提示します。 9 usua -そのようなサブトラクティブパターニング5を実行する方法LLY不注意生細胞に影響を与え、レーザーを使用して、特殊な基板、表面処理、複雑な操作、物理的な接触または切除を必要とします。ここでは、マイクロ流体プローブ（MFP）10,11、流体力学的に基板上に液体を閉じ込める非接触スキャンマイクロ流体技術を使用しています。 MFPの一つの重要な構成要素は、マイクロチャネルを含む微細加工ヘッド（ 図1）です。関連するプラットフォームは、液体制御のためのシリンジポンプ、制御と可視化とフィードバックのための倒立顕微鏡（ 図2）をスキャンするためのステージで構成されています。その基本的な構成では、MFPヘッドが頂点に開口部を有する2つのマイクロチャネル、いくつかの液浸液（ 図3A）と一緒に注射し、処理液を吸引するための処理液やその他の注入のための1つを含みます。 MFPの動作中に、頂部基板から一定の距離にあります。吸引流量（Qaが）sufficieある場合噴射流量（Q i）をよりntly高い、 すなわち 、Q：Q I≥2.5、処理液を基板上に閉じ込められます。これは、流体力学的流動閉じ込め（HFC）になります。処理液が基板と直接接触している領域は、フットプリントと呼ばれます。典型的な動作条件のために、HFC内の処理液の流れは、（≈10 -2 Re）は低レイノルズ数と高いペクレ数（Peを≈10 2）によって特徴付けられます。これは、対流が化学種の物質移動の主要なモードであると層状の領域で液体の流れを意味します。 14 -フロー閉じ込めの数値や分析モデルは、他の場所12に記載されています。 本稿では、同時に階層HFC（hHFC）14と呼ばれる複数の処理液を、閉じ込めのアプローチを使用しています。 MFPでhHFCを実装するには、2 additionaリットルの開口部は、注入および吸引の二次ソースを提供するために必要とされます。これは、第二の液体内の1つの液体を閉じ込めるために私たちを可能にします。内側（処理）液の利点は、外側（シールド）液体により基板上に浮遊破片から遮蔽されています。また、hHFCは、2つのモードで動作が可能になります：内側の液体が接触を失っている（I）、ネストされたモード、内部HFC接点での処理液面（ 図3B）、及び（ii）ピンチモード、唯一の外側の液体は、基板（ 図3C）と接触しています。二つのモードの切り替えは、ユーザーが影響を与えるか、基板の処理を停止することを可能にし、頭に表面のギャップを制御することによって、または注射・フロー（Q I2 / Q i1の）との比率を変更することによって達成されます。与えられたチャネルの形状については、基板上の処理液のフットプリントは、流れ条件（ 図3D）を調節することによって制御することができます。ナトリウムhydr酸化物（水酸化ナトリウム）細胞を溶解するために内部の処理液として使用され、そして溶解物を連続的に表面から吸引されます。処理液の化学的作用は、内側HFCフットプリントに局在化しているため、隣接する細胞は、細胞 - 細胞相互作用の時空間の研究を可能にする、非摂動残ります。 MFPのスキャン機能は、セルパターン（ 図4）のユーザー定義のジオメトリの作成 ​​を可能にします。また、処理液としてのNaOHの選択は、下流のDNA分析（ 図7）を収容します。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>マイクロ流体プローブ(MFP)</td><td></td><td></td><td>シリコンでパターン化されたチャネルを備えたシリコン/ガラスハイブリッドプローブヘッド。製造はIBM Researchで社内で行われました-Z&uuml;豊富な</td></tr><tr><td>Lab Tek IIチャンバースライド、2チャンバー付き</td><td>ThermoFisher scientific、米国</td><td>154461</td><td>細胞培養用の2チャンバーチャンバースライドで、各チャンバーは4cm2の領域を提供し、最大3mlの培地容量</td></tr><tr>を保持できます<td colspan="4">Chemicalsおよびcell lines</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、 Tris-Cl、エチレンジアミン四酢酸、ローダミンB</td><td>SigmaAldrich化学、米国</td><td>S5881、252859、&nbsp;E9884、R6626</td><td>液体の処理とシールドに使用される化学薬品</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>Qiagen、ドイツ</td><td>19131</td><td>脱毛タンパク質を消化するためのプロテアーゼ</td></tr><tr><td>Deconex 16 Plus</td><td>Bohrer Chemie、スイス</td><td></td><td>洗浄消耗品用のユニバーサル洗浄剤。厳密でないクリーニングに使用されます。</td></tr><tr><td>DNA離れて&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国</td><td>7010</td><td>DNAおよびDNAaseを変性させる表面除染剤。</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、GLUTAMAXサプリメント</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>10566-016</td><td>上皮細胞の培養培地.</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA dye</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>C7025</td><td>Membrane permeant live cell labeling dye.染料は72時間活性があります。</td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMRA色素</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-actin genomic primers for qPCR</td><td>Integrated DNA technologies, USA</td><td></td><td>DNA品質検証とqPCRに使用されるカスタムオリゴ。</td></tr><tr><td>MCF7乳がん細胞</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC HTB-22</td><td>共培養物の作製に使用した細胞株。</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 乳がん細胞</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC HTB-26</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment and fluidic connections</td></tr><tr><td>電動高精度ステージ</td><td>カスタム加工部品。&nbsp;LANG GmBH、ドイツからのリニア軸モーターLT</td>シリーズ3 &times<td>からのカスタマイズされたリニア軸ステージ</td><td>。3軸用のLT。RS 232ポートを介してステージとPCをインターフェースするために使用されるLSTEPコントローラー。</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>ハミルトン、スイス</td><td>1700 TLLXシリーズ</td><td>250-500 & マイクロを備えた他のメーカーが提供するシリンジと交換可能。lの範囲。</td></tr><tr><td>Nemesys低圧シリンジポンプ</td><td>cetoni GmbH、ドイツ</td><td></td>ポンプ<td>ステーションのコンポーネント。</td></tr><tr><td>丸型M1コネクタ</td><td>ドロマイトマイクロ流体工学、英国&nbsp;</td><td>3000051</td><td>MFPヘッドとチューブのビア間のインターフェース</td></tr><tr><td>チルト/回転ステージ ゴニオメーター</td><td>OptoSigma, USA</td><td>KKD-25C</td><td>MFPアペックスのコプラナリティを調整するためのゴニオメーター</td></tr><tr><td>DS Fi2 HDカラーカメラ(CCD)&nbsp;</td><td>ニコン、スイス</td><td></td><td>DS-U3コントローラーユニット</td></tr><tr>を使用して制御<td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Win - Commander</td><td>LANG GmBH、ドイツ</td><td></td><td>ステージ制御ソフトウェア。</td></tr><tr><td>Qmix Elements</td><td>cetoni GmbH、ドイツ</td><td></td><td>ポンプ制御ソフトウェア。</td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>ニコン、スイス</td><td></td><td>画像取得と分析のための基礎研究モジュール。</td></tr></tbody></table>

マイクロ流体プローブとのライブの細胞層の急速なサブトラクティブパターニング

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

マイクロ流体プローブ（MFP）は、液体のナノリットルの容積を閉じ込めることによって、生物学的基材上にローカル化学反応を行うことが容易になります。 MFPの特定の一実装を使用して、階層的な流体力学的流れ閉じ込め（hHFC）、複数の液体を同時に基板に接触しています。 hHFCを用いて局所的な化学的作用と液体成形は、局所的に溶解細胞を除去することによって、細胞パターンを作成するために利用されます。 MFPのスキャン機能を利用することにより、細胞単層のユーザ定義されたパターンが生成されます。このプロトコルは、迅速な、リアルタイムおよび選択的な細胞 - 細胞および細胞 - マトリックス相互作用の研究を可能にすることができる空間的に制御された細胞のパターニングを可能にします。

細胞単層の急速なサブトラクティブパターニングに記載されるプロトコルは、（ 図1および2）多成分複合機プラットフォームを使用して実証されています。局所的に治療し、処理液としてNaOHを用いて、細胞単層から細胞を除去するために、（ 図3 hHFC）プロトコルは、階層的な流体力学的流動の閉じ込めを採用しています。 hHFC構成は、内側HFCと外側のHFCを含みます。インナーhHFC内に閉じ込められNaOHが接触している細胞に化学的作用とせん断を導入しています。このフットプリント内では、細胞が均一に内と閉じ込め外側の領域に無視できる程度の拡散と対流駆動の物質移動のために、水酸化ナトリウムの化学的作用にさらされています。一方、細胞のせん断を、水酸化ナトリウムの流量を変えることによって変更することができます。動作パラメータを簡単にするために、我々は、化学的作用を行うために、剪断と比較して細胞除去の主要なメカニズムを選択しました。に表面にhHFCによって適用されるせん断力を推定し、有限要素モデルは、COMSOL Multiphysicsの5.0を使用して構築されました。シミュレーションは、層流のためのCFDモジュールを使用して実行しました。注射ジオメトリの開口と吸引開口部に2つの出口の境界条件（ 図5）の2つの入口の境界条件は、現在の実証に使用される流量と開口寸法の範囲に適用しました。流量は、表面上の剪断力の大きさを定義したのに対し、得られたモデルでは、フロールールは、剪断プロファイルを決定しました。具体的には、両方の組み合わせは、hHFC接点あれば表面を決定します。心の中でこれらの要因を維持、我々は化学的に支配的な細胞除去を得るために、操作のための流量の範囲を見つけるために着手しました。 hHFCを作成するには、3.5の注入流量比に総吸引のフロールールを使用しています。使用される他のフロールールを吸引チャンネル内で目詰まりを最小限にするために定義されていました、これは、チャネル表面に付着変性タンパク質により引き起こされ得ます。開発されたモデルを使用して、我々は、5〜10マイクロリットル/分の流量を1と3 N / m 2の間の剪断応力に変換を発見しました。 NaOHの化学的影響を与えることなく、抽出緩衝液の場合には、例えば、せん断応力は、セル19を除去するのに十分な高さではないでしょう。観測された範囲内で、我々はより高い流量での作動が原因でチャネルにおける細胞の破片に低い吸引流量で流路（ すなわち 、Q I2 &lt;4μL/分）における摂動により、より実用的であることに注意します。 図3に示すフロールールに従ってパターニング実験およびQ I1、Q A1とQ A2のために使用されている6,8μL/分の検討剪断プロファイル及び実用的な考慮事項、NaOHの流量（Q I2）を考慮した比がインジェクション・フロー（Q I2 / QのI1）のuのを可能にしますsがさらにAutebert ら 14によって精緻化基本原理で、hHFCフットプリント（ 図3Dおよび図4B）の大きさを調節します。 MFPプラットフォームの高分解能走査能力と相まってhHFCの液体成形能力を用いて、複数のスケールでの生細胞系統の生成を実証し、さらに共培養（ 図4C）を開発中で与えられたプロトコルの適用を示します。 プラットフォームはまた、私たちは、下流の分析のためのサンプル溶解液の検索を行うことができます。得られた溶解産物の品質を示すために、我々は、局所的に溶解物（ 図7）から得られたDNAの量の変化を示す、2つの独立した実験において1〜5足跡から細胞を溶解したサンプリングされます。 GGATGCAGAAGGAGATCACTおよびリバース：ここでは、DNAフォワード（βアクチンプライマーを用いて溶解液に含まれる増幅さCGATCCACACGGAGTACTTG<html> ）各PCR反応で中和された溶解物を4μLを使用して。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig1.jpg" /> MFPプラットフォームとヘッドの 図1. モジュール。（A） は 、プラットフォームの運用モジュールは電動注射器、電動ステージとコントローラを備えます。 MFPは、ヘッドと基板との間のギャップ距離を制御するための電動式Zステージに接続され、基板ホルダーをX方向及び走査システムを構成するY-電動ステージに取り付けられています。 （B）MFPヘッドを研磨頂点を出るポンプステーションを接続するための流体ビア、Zステージ上にヘッドを取り付けるための取り付け穴、およびチャネルを持っています。頂点は、細胞培養基板に同一平面上に設定されています。頂部及び基板が同一平面と接触している場合、対称ニュートンリングを観察することができます。<html> p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig2.jpg" /> 図2 MFPプラットフォームは高分解能走査プラットフォームは、機械加工ヘッドホルダは、高精度の電動Zステージとのインタフェースを備えています。基板ホルダは、走査のためにXYステージに接続されています。下流の分析のための溶解物の回収のために、3Dプリントサンプリングステーションは、（挿入図に示されている）基板ホルダの側に磁気的にクリップされます。シリンジポンプ、倒立顕微鏡、コントローラおよびディスプレイは、プラットフォームの周りに配置されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 3 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54447 / 54447fig3.jpg &quot;/&gt; 細胞除去の空間的および時間的制御図3.階層流体力学的流動閉じ込め（hHFC）。（A）単一HFCの概略。 （B）hHFC操作のネストされたと（C）挟まモード。 （D）は、2つの異なる注入/吸引流量比のためのフットプリントのイメージ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig4.jpg" /> 図MFPを使用して細胞単層の4パターン（A）細胞グリッド生成MDA-MB-231細胞単層上のMFPのプログラムされた走査による。細胞は緑色細胞追跡色素で染色しました。 （B）n個の異なる注射比についてフットプリント（）MCF7細胞単層上。概略的には、n個の変化に伴う内部HFCの形状で予想される変化を示しています。減算地域でMDA-MB-231細胞を播種することによって、その後MCF7単層のサブトラクティブパターニングにより共培養（C）パターン化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig5.jpg" /> 表面上の図5.せん断応力hHFC。直線、内噴射流量と表面で増加したせん断応力を適用します 。最も高いせん断点は2つの内部処理液が閉じ込められている開口部（右下挿入図）、（赤フローライン、左上の挿入図）との間で発見されました。有限要素モデルで使用される開口部の寸法は、I1、I2、200、100、100及び200μmであり、A1及びa2、それぞれ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig6.jpg" /> MFPプラットフォームの図6.動作モードは、細胞除去およびパターニングを行い 、細胞溶解によるサブトラクティブパターニングのための流路（A）は概略します 。簡単にするために、それぞれの注入および吸引流路の一方のみが示されています。シリンジポンプで排水弁を用いて充填されています。 I1およびI2は、それぞれ、抽出緩衝液およびNaOHを注入するために使用されます。 （B）溶解物を回収するための流路の概略図。この流路は、（A）内の流路を使用して、分析のために、細胞溶解物の回収後に活性化される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig6large.jpg" target="_blank">CLICください</a>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをk個。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig7.jpg" /> 定量PCRを用いて、細胞溶解物からのDNAの図7.ダウンストリーム分析。5フットプリント（5 FP）と1フットプリント（1 FP）から抽出された溶解物中のDNAの（A）の増幅プロット。コントロールは両方のケースのために、溶解物の回収後に抽出しました。 （B）は、抽出されたDNAの質を示す溶解物から増幅されたDNAの曲線メルト。定量PCRを実施し（N = 2、n = 3） が βアクチン遺伝子を増幅した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図S" src="/files/ftp_upload/54447/54447figS.jpg" /> 図S1。 6チャンネルMFPヘッド用のチャネル設計のスケーリングされた画像パターニング実験に用いた。hHFCを行うチャンネル200、100、100、200ミクロン、幅、深さは100μmです。液浸液を補充する最も外側の2つのチャネルは、幅500μmから100μmの深さ。同じデザインのためのGDSファイルには、この記事への補足として提供されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447figSlarge.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

私たちは、表面上の生細胞単層の減法的なパターニングを行うためのプロトコルを提示します。これは、マイクロ流体プローブ(MFP)を使用して接着細胞を局所的かつ選択的に溶解することによって達成されます。局所領域から回収した細胞ライセートは、ダウンストリーム解析に用いることができ、分子プロファイリング研究が可能です。

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

本ビデオ記事で提示する手法の主な目的は、細胞間相互作用のin-situでの時空間解析を容易にするために、空間的に定義された細胞パターンを迅速に作成することです。提示した戦略では、マイクロ流体プローブ技術を利用しています。微細加工されたプローブヘッドを用いて、ナノリットル量の生化学物質を生物学的基質上の局所に配置し、細胞単層のパターンを形成します。MFPを用いたパターニング技術の主な利点は、局所的な溶解によりほぼ瞬時に完了するため、生成されるパターンのリアルタイムな修正が可能である点です。この手法を考案したきっかけは、細胞パターンを生成する他の手法では、実際にパターンの成功を確認するまでに、時間がかかる多段階のプロトコルを必要とすることに気づいたことでした。細胞表面に流体的な流れの閉じ込めを用いて安定した実験を行うには、MFPのパラメータを最適化する必要があります。この目的のためには、視覚的な実演が不可欠です。Aditya KashyapとJulien Corsが本手順を実演します。プラットフォームの動作モジュールは、電動シリンジ、電動ステージ、およびコントローラーで構成されています。MFPはモーター駆動のZステージに接続されており、ヘッドと基板の間のギャップ距離を制御します。また、基板ホルダーはスキャンシステムを構成するXおよびYのモーター駆動ステージに取り付けられています。MFPヘッドには、ポンピングステーションに接続するための流体ビア、ヘッドをZステージに固定するための取付穴、および研磨された頂点（アペックス）から出るチャネルが備わっています。この頂点は、細胞培養基板と同一平面になるように設定されます。ポンプステーションおよび液体操作装置を準備するため、生細胞実験の前後に、シリンジとシリンジプランジャーを超純水中の0.5%漂白剤溶液で超音波洗浄します。その後、水で十分にすすいでください。シリンジの先端をウォーターバスに完全に浸し、プランジャーを用いて吸引することで、シリンジに水を満たします。シリンジの出口にあるシールにシリンジシャフトを接触させた状態で、ウォーターバス内で液体をパージします。シリンジのコラム内に気泡が見えなくなるまで、吸引とパージを繰り返します。充填済みのシリンジを、ロワーロックコネクタを用いてシリンジポンプに接続します。ポンプに取り付けられた切替バルブを使用して、シリンジからの液体を、MFPヘッドまたは液体リザーバーのいずれかに導く2本のキャピラリーのどちらか一方に方向付けます。シリンジのサイズに応じて、約10〜50 µL/minの流速で、シリンジに約10 µLの水が残るまで、両方のキャピラリーを水でパージします。標準的な洗浄にはガラス器具用洗剤を、厳格な洗浄には0.5%次亜塩素酸ナトリウムを用い、5分間超音波処理してMFPヘッドを洗浄します。先端を水に浸し、ビアに真空をかけることで、チャネル内を水で洗浄します。実体顕微鏡下でチャネルに詰まりがないか確認し、必要に応じて前の手順を繰り返します。次に、洗浄済みのヘッドをヘッドホルダーに取り付け、コネクタをヘッドにねじ込みます。パージ済みのキャピラリーを、ヘッドのチャンネルビアと接続する適切なマイクロ流体コネクタアダプタに挿入します。テキストプロトコルに記載されているエンドポイント校正を行う前に、ヘッドと細胞単層間のギャップ距離を制御するためのZステージにヘッドホルダーをネジで固定します。細胞のないチャンバースライドの上にMFPヘッドを配置し、5 µmステップでゆっくりと下降させ、おおよそのゼロギャップ距離を決定します。プローブを基板に接触させた際、ニュートンの環が観察されるはずです。これは概算の推定です。プローブ先端と基板の共面性を調整した後、正確な位置を決定します。ニュートンリングが形成された際、それが対称であることを確認してください。プローブ先端の共面性を確保するため、ヘッドとZステージのインターフェースにあるゴニオメーターを使用して、ヘッドの傾きを調整します。MFPヘッドを基板から20 microns離し、ゴニオメーターを用いて傾きを調整してください。ニュートンリングが接点において対称になるまで、降下、ゼロ点合わせ、および傾斜調整を繰り返します。傾斜が調整され、ニュートンリングが対称になった状態で、Z位置をゼロに設定します。次に、テキストプロトコルに従い、内部注入チャンネル用の処理液と外部注入に必要な抽出緩衝液を準備します。ドレインラインをシリンジポンプに接続し、残った水をパージした後、脱気した溶液を40 µL/minの速度で注入用シリンジに、満杯になるまで吸引します。これにより、シリンジ、コネクタ、およびキャピラリー内に気泡が入らずに充填されます。チャンバースライド上の細胞単層を調製するために、標準的な細胞培養プロトコルを用いてTフラスコ内で細胞を増殖させます。培養フラスコ内で細胞がコンフルエントに達したら、トリプシン処理して細胞を回収します。パターニング用に、2チャンバースライドの各チャンバーに1cm²あたり0.2 million cellsで播種します。48時間培養し、一方のチャンバーの細胞を細胞増殖および生存率のコントロールとして使用します。チャンバースライド上の細胞がコンフルエンスに達したら、無血清培地で調製した10 µM濃度のセルトラッカー染料溶液500 µLを加え、45分間インキュベートします。これは、パターニング中の細胞可視化のために行います。ピペットを用いて各チャンバーを穏やかに洗浄し、ラベル化した細胞をPBSで洗浄します。続いて、パターニング実験のために、血清添加培地で細胞を培養します。流体的な流れによる閉じ込め（hydrodynamic flow confinement）は、処理液の同時注入と吸引によって液体を局在化させます。階層的閉じ込めでは、複数の処理液が閉じ込められ、外側のHFCが内側の処理HFCからサンプルを保護します。MFPを細胞単層の上に移動させ、ガラススライドから50 µmの隙間距離に設定します。この隙間距離により、階層的HFCの接触が確保され、単層の表面および厚みの変動にも対応できます。I-2を通じて、水酸化ナトリウムを6または8 µL/minで注入します。テキストプロトコルの流量規定に従い、他の流量で評価してください。注入用シリンジを用いて注入流量 QI-two と QI-one の比率を変更し、内部 HFC のサイズを調整します。例えば、QI-two を 8 µL/min に固定し、QI-one を 1.3 µL/min から 4 µL/min の間で調整することで、水酸化ナトリウムのフットプリントを 150 から 300 個の細胞分にします。培地の蒸発およびhHFCの動作中の吸引を補うため、MFPヘッドの最も外側の開口部から完全培地を20 microliters per minuteの流量で注入します。細胞単層をパターニングするために、ステージソフトウェアを設定し、スキャン速度10 microns per second、ギャップ距離50 micronsで、ユーザー定義のパターンに従ってプローブヘッドを細胞単層上でスキャンさせます。ネストされたhHFCを動作させ、単層に接触させた状態で、所望のパターンの軌道に沿ってMFPをスキャンし、パターニングされた細胞除去を行います。最初の細胞種の除去後の共培養では、前述と同様に、隙間を埋めるために別の細胞株を播種します。ライセートの下流分析に向けてサンプリングステーションを準備します。ここでは、3Dプリンターで作成した8連PCRホルダーで構成されるサンプリングステーションの例を示します。用途に応じて必要な厳格さに合わせ、チューブホルダーを70% ethanolまたはその他の表面除染剤で拭きます。チューブホルダーにあるマグネットクリップを使用して、基板ホルダーに固定します。サンプリングステーションの準備が完了したら、MFPヘッドを単層から100 micronsの位置に配置します。hHFCの操作を開始します。内部注入チャネルの処理液として50 millimolar 水酸化ナトリウム溶液を用い、流量をQI-oneで1 µL/min、QI-twoで6 µL/min、QA-oneで-7 µL/min、QA-twoで-17.5 µL/minに設定します。流体閉じ込めが安定したら、プローブヘッドをギャップ距離50 µmまで降ろし、hHFCを用いて選択した細胞サブポピュレーションに対して水酸化ナトリウムによる局所溶菌を行います。サブポピュレーションの溶菌が完了した後、ヘッドをサンプリングステーションのチューブへと移動させます。回収したライセートをPCRチューブに直接排出します。本文のプロトコルに従ってライセートを処理した後、装置メーカーが指定する標準的なqPCRワークフローにライセートを投入します。階層的HFCにおける注入液の比率を制御することで、細胞表面に接触するフットプリントのサイズを調節できます。せん断力ではなく化学的効果が細胞溶解の支配的なメカニズムとなるよう、流速を選択しました。これは、数値流体力学を用いてせん断力を決定することで裏付けられました。ここでは、MFPの走査軌道プログラミングによる細胞アイランドのグリッド生成を示します。注入液の比率を用いてフットプリントサイズを調節することで、細胞除去の解像度を制御することが可能です。この手法は、複数の細胞集団を順次共培養させるために利用でき、それにより細胞間相互作用の複雑なパターンを構築できます。処理液として水酸化ナトリウムを使用することで、ライセートをPCRベースの細胞解析に適応させることができます。ここでは、上述の方法を用いて溶解した5つのフットプリントと1つのフットプリントからDNA含量を定量しました。この手法を習得すれば、30分以内に細胞の処理を行うことが可能です。本手順を実施する際は、チャネルおよびキャピラリーに気泡がないことを確認することが重要です。気泡があると、HFCに悪影響を及ぼす可能性があります。腐食性化学溶液である水酸化ナトリウムを取り扱う際は非常に危険であるため、本手順の実施中は常に安全ゴーグルや白衣などの予防策を講じることを忘れないでください。本手順の後、免疫染色による細胞の局所分析や、MFP介在性溶解によるDNA-RNAシーケンシングを行うことで、細胞の幾何学的閉じ込めによってどのタンパク質が過剰発現しているかなど、さらなる疑問に対する解析が可能です。本手法の開発により、分子生物学分野の研究者が組織の生成および退行時における細胞内および細胞外シグナル伝達を探索するための道が開かれることが期待されます。このビデオを視聴することで、局所的な処理のためにMFPで構築した細胞単層を減算的にパターニングし、細胞共培養の複雑な幾何学的構造を作成する方法について十分に理解することができます。

rapid-subtractive-patterning-live-cell-layers-with-microfluidic

Research

JoVE Journal

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