ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定
September 20th, 2016
ここでは、光親和性標識を使用して低分子結合タンパク質を同定する方法を説明します。この技術の利点は、標的タンパク質の結合および共有結合標識が生細胞環境内で行われるため、細胞溶解時に天然タンパク質の構造および結合条件を破壊するリスクが排除されることです。
この手順の全体的な目標は、光親和性プローブを使用して低分子の結合タンパク質を同定し、生細胞でその標的に結合し、その後の標的の単離と同定を可能にすることです。この方法は、薬物やその他の小分子の作用の分子メカニズムを解明するために使用できます。この技術の主な利点は、標的タンパク質の結合および共有結合標識が天然の細胞環境内で行われるため、細胞溶解時に天然のタンパク質構造および結合条件を破壊するリスクが排除されることです。
この手順は、必要なサンプル数に対して、滅菌済みの6cm細胞培養皿を調製することから始めます。通常、治療条件ごとに1皿の細胞が使用されます。このデモンストレーションのために3つの細胞皿を用意し、DMSOのみ、標識D、プローブ処理のみ、標識P、およびプローブプラス競合薬による陰性対照を各培養皿 C.To 標識し、4ミリリットルの培地に350万HEK293T細胞を添加します。
細胞を一晩インキュベートします。細胞を治療する前に、必要な薬物を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに事前に分注します。競合他社の前処理では、2つのチューブのそれぞれに4マイクロリットルのDMSOを追加し、1つのチューブに4マイクロリットルの10ミリモルの競合他社を追加します。
プローブ処理には、1本のチューブに16マイクロリットルのDMSOを、2本のチューブのそれぞれに16マイクロリットルの15マイクロモル光親和性プローブを追加します。細胞培養皿を細胞培養フードに入れて、あらかじめ分注した薬剤を添加します。競技用処理皿から1ミリリットルの培地を吸引し、事前に分注した競合他社を含む微量遠心チューブに移し、薬剤を培地に再懸濁します。
培地と薬物の混合物を皿にゆっくりと滴下します。同様に、ネガティブコントロールディッシュとプローブディッシュの両方にDMSOを追加します。皿をインキュベーターに30分間戻します。
30分後、料理をカルチャーフードに戻し、照明を暗くします。事前に分注したDMSOをネガティブコントロールディッシュに加え、プローブとコンペティションディッシュにプローブします。皿をインキュベーターに1時間戻します。
1時間後、皿を氷の上に置きます。各皿の細胞を5ミリリットルの氷冷PBSで優しく洗い、余分なプローブを取り除きます。細胞を4ミリリットルの氷冷PBSで再度覆います。
ランプからの加熱を最小限に抑えるために、UVランプの下の3cmの中央にセルの皿を置き、ランプからの加熱を最小限に抑えます。皿を取り出して氷の上に置きます。このように、すべてのサンプルに照射します。
すべてのサンプルを照射した後、細胞からPBSを吸引し、プロテアーゼ阻害剤を含む200マイクロリットルの氷冷PBSを各皿に加えます。ゴムスクレーパーを使用して細胞を皿から分離し、氷上の標識済み微量遠心チューブに移します。各サンプルにSDSを最終濃度0.4%まで添加懸濁液を10パルス超音波処理し、氷上で1分間インキュベートした後、さらに10パルス超音波処理することにより、細胞を溶解します。
95°Cに設定したヒートブロックでサンプルを5分間煮沸して、細胞溶解を完了し、すべてのタンパク質を変性させます。各サンプル中のタンパク質濃度を測定した後、テキストプロトコルに記載されているように、PBS PH 8.5と必要に応じて0.4%SDSを添加することにより、タンパク質濃度を2.5ミリグラム/ミリリットルに正規化します。この手順を開始するには、前のセグメントで調製した各細胞溶解物の40マイクロリットルを新しい微量遠心チューブに移します。
0.2マイクロリットルのアジ化小麦粉、0.58マイクロリットルのTCEP、3.38マイクロリットルのTBTAの順に試薬を加えます。渦を混ぜます。1.14マイクロリットルの硫酸銅五水和物を加えて反応を開始します。
短時間ボルテックスし、暗所で室温で30分間インキュベートします。反応をクエンチするために、50マイクロリットルの2X SDSサンプルバッファーを添加します。SDS-PAGEゲル上でサンプルを泳動し、色素の前面がゲルの端に達したら、さらに5分間ゲルを泳動し続け、余分な未反応のアジド粉が完全にゲルから出たことを確認します。
余分なアジ化小麦粉をすべて洗い流した後、ゲルをガラスプレートに置き、製造元の指示に従って蛍光ゲルスキャナーを使用してゲルをスキャンします。ビオチンタグの結合には、タンパク質の標準化後に最大量の細胞ライセートを使用し、すべてのサンプルが同じ容量になるようにします。各サンプルを、50マイクロリットルの洗浄済み高容量ストレプトアビジンアガロースビーズを含む新しいチューブに追加して、ライセートを事前に透明
化します。回転させて摂氏4度で1時間インキュベートします。遠心分離によりビーズをペレット化します。上清を氷上の新しい微量遠心チューブに移し、ビーズを捨てます。
ライセート500マイクロリットルあたり、次の試薬、1.38マイクロリットルのビオチンアジド、5.5マイクロリットルのTCEP、および32.5マイクロリットルのTBTAを追加します。.渦を混ぜます。溶解物500マイクロリットルあたり11マイクロリットルの硫酸銅五水和物と渦を短時間加えます。
室温で30分間インキュベートします。4サンプル量のアセトンを加え、摂氏20度に冷却し、サンプルをボルテックスし、摂氏80度で一晩インキュベートして、タンパク質を完全に沈殿させ、未反応のビオチンアジドを除去します。翌日、サンプルを17, 000 x gで4°Cで15分間遠心分離し、沈殿したタンパク質をペレット化します。
上清を完全に吸引し、各サンプルに150マイクロリットルのPBS PH 7.4および1%SDSを加え、超音波処理によってタンパク質を再溶解します。各サンプルに600マイクロリットルのPBSを加えて、SDSの濃度を0.2%に希釈し、次に、30マイクロリットルの洗浄済み大容量ストレプトアビジンアガロースビーズを含む新しいチューブにサンプルを追加します。回転させて摂氏4度で1時間インキュベートします。
1時間後、ビーズを1000 x gで3分間遠心分離してペレット化します。未結合のタンパク質を含む上清を吸引して廃棄します。ビーズに1ミリリットルの洗浄緩衝液を加え、室温で5分間回転させてインキュベートします。
遠心分離機にかけ、上清を捨て、再度洗浄バッファーで洗浄します。最終洗浄後、ビーズから洗浄バッファーを完全に吸引し、30マイクロリットルの2X SDSサンプルバッファーを添加します。摂氏95度のヒートブロックで5分間インキュベートし、ビーズからタンパク質を遊離させます。
ビーズを13000 x gで室温で1分間遠心分離します。ビーズからタンパク質を含むサンプルバッファーを慎重にピペットで動かし、SDS-PAGEに使用します。蛍光タグで標識した後のタンパク質の可視化は、この蛍光スキャンゲルによって示されています。
主要な特異的結合タンパク質バンドは、約35キロダルトンで、プローブレーンにのみ存在し、過剰な親化合物によって競合します。同じ35キロダルトンのバンドは、ビオチンプルダウン後の銀染色によって視覚化され、その後、質量分析によって膜タンパク質VDAC1として同定されました。このタンパク質の同一性は、VDAC1に対する特異的抗体を用いてさらに検証されました。
信号はプローブレーンに存在し、コンペティションレーンでは減少します。インプット画分を含めることで、抗体が機能し、目的のタンパク質をライセートで検出できます。プルダウンサンプルの分子量のわずかな増加は、プローブが密着して付着しているためです。
プロトコルの特定の手順を正しく実行しなかった場合の結果が示されています。過剰なアジ化小麦粉の不完全な除去は、蛍光走査ゲルの底部に大きな黒い塗抹標本をもたらし、溶解物の不十分な事前清澄化および/またはビーズの洗浄は、非常に高いバックグラウンド染色を有する銀染色ゲルをもたらす。プルダウン実験は、開始から終了まで2〜3日かかります。
標的タンパク質を単離し、質量分析またはウェスタンブロッティングで同定した後、さらに標的特異的なバリデーション実験を実施して、標的と薬物誘発表現型との関連性を評価する必要があります。
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概要
この記事では、生細胞における光親和性ラベリングを用いた小分子結合タンパク質の同定方法について説明します。この技術により、標的タンパク質の自然構造を破壊することなく、共有結合によるラベリングが可能になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- 細胞生物学
背景
- 結合タンパク質の同定は薬物メカニズムの理解に不可欠です。
- 従来の方法ではタンパク質構造が破壊される可能性があります。
- 光親和性ラベリングにより、in situ分析が可能になります。
- 生細胞条件下ではタンパク質の自然な相互作用が維持されます。
研究目的
- 小分子結合タンパク質を同定すること。
- 薬物の分子作用メカニズムを解明すること。
- タンパク質結合研究の信頼性を向上させること。
使用した方法
- 無菌細胞培養皿の準備。
- 結合研究にHEK 293 T細胞の使用。
- 生細胞への光親和性プローブの適用。
- ラベリング後の標的タンパク質の分離と同定。
主な結果
- 生細胞における結合タンパク質の同定に成功。
- 異なる処理条件下での方法の有効性の実証。
- 対照実験による技術の検証。
- 小分子の分子間相互作用に関する洞察。
結論
- 光親和性ラベリングはタンパク質相互作用の研究に強力なツールです。
- この方法は自然な細胞環境を保持します。
- 薬物メカニズムの解明に信頼性の高いアプローチを提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Identifying small molecule targets in their native cellular context is critical for de-risking early-stage drug discovery programs. Live-cell photoaffinity labeling enables covalent capture of binding proteins without disrupting labile interactions, improving target confidence for membrane and transient complexes. This approach supports mechanistic understanding and portfolio triage by reducing false negatives in target identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing small molecule-protein interactions in live cells.
- Operational Value: Preserves native protein conformation and binding conditions, reducing artifacts from cell lysis.
- Predictive Value: Supports functional target validation and biological de-risking for downstream assay development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated protein targets for use in biochemical or cell-based assay design.
- Operational Value: Produces reproducible protein pulldowns compatible with downstream western blot or mass spectrometry workflows.
- Scalability: Enables parallel processing of multiple conditions (e.g., dose, competition) for target engagement profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links phenotypic screening hits to molecular targets in disease-relevant systems like HEK293T.
- Mechanistic De-risking: Confirms on-target activity through competition with parent compound, supporting go/no-go decisions.
- Biomarker Alignment: Enables detection of target engagement in native lysates, informing pharmacodynamic assay development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, connecting phenotypic screening to target identification and informing lead optimization through mechanistic insight.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by identifying direct binding partners of small molecules in native cellular environments.
- Screening: Generates target lists for assay triage and enables assessment of compound specificity via competition experiments.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as band intensity shifts in fluorescent gels and competition-dependent signal reduction.
- Translational Research: Validates targets identified in phenotypic screens through direct biochemical engagement in live cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for target de-risking across multiple small molecule programs and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target identification by preserving labile interactions and native protein complexes.
- Operational Value: Standardizes target engagement detection through covalent labeling and streptavidin-based pulldown.
- Strategic Value: Improves decision-making in lead identification by reducing mechanistic ambiguity and off-target noise.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated target engagement data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell handling, photoaffinity chemistry, and click chemistry conjugation.
- Depends on access to UV irradiation equipment, fluorescent gel scanners, and streptavidin bead-based purification systems.
- Necessitates standardized protocols for competitor treatment, washing, and quenching to minimize background and ensure specificity.
- Must account for probe permeability, cytotoxicity, and labeling efficiency across different cell lines and subcellular compartments.
- Limited by the need for optimization of probe concentration, irradiation time, and competitor potency to avoid nonspecific labeling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Preparation of Cultured Cells
1:23
Treatment of Cells and Photocrosslinking
4:34
Attachment of Fluorescent Tag by Click Chemistry for Visualization of Labeled Proteins
5:48
Attachment of Biotin Tag by Click Chemistry for Affinity Purification of Labeled Proteins
8:54
Results: Live-cell Photoaffinity Labeling Identifies a Major Itraconazole-binding Protein
10:14
Conclusion
