ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定

この手順の全体的な目的は、生細胞内で標的に結合できる光親和性プローブを用いて、低分子化合物の結合タンパク質を同定し、それに続いて標的の単離および同定を行うことです。この手法は、薬物やその他の低分子化合物の分子的な作用機序を解明するために利用できます。この技術の主な利点は、標的タンパク質の結合と共有結合的な標識が生細胞内の天然の環境で行われるため、細胞溶解時に天然のタンパク質構造や結合条件が乱われるリスクを排除できることです。

まず、必要数分だけ滅菌済みの6 cmセルカルチャーププレートを準備します。通常、処理条件ごとに1枚のプレートを使用します。本デモンストレーションでは、「D」とラベルしたDMSOのみの陰性対照、「P」とラベルしたプローブ処理のみ、「C」とラベルしたプローブと競合剤の併用という、計3枚のプレートを準備します。各カルチャープレートに、4 mLの培地に懸濁させた3.5 million個のHEK 293 T細胞を添加します。

細胞をオーバーナイトでインキュベートします。細胞を処理する前に、必要な薬剤を1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに分注しておきます。競合剤による前処理については、2本のチューブにそれぞれ4 µLのDMSOを加え、さらに別の1本のチューブに4 µLの10 millimolar競合剤を加えます。

プローブ処理のため、1本のチューブに16 µLのDMSOを加え、2本のチューブそれぞれに15 µMの光親和性プローブを16 µLずつ加えます。あらかじめ分注した薬剤を添加するため、細胞培養ディッシュを細胞培養フード内に移動させます。競合処理用のディッシュから1 mLの培養培地を吸引し、あらかじめ分注した競合剤が入ったマイクロ遠心チューブに移し、培地中で薬剤を再懸濁させます。

培地と薬剤の混合液を、ディッシュにゆっくりと滴下して戻します。同様に、陰性対照ディッシュとプローブディッシュの両方にDMSOを加えます。ディッシュをインキュベーターに戻し、30分間静置します。

30分後、ディッシュをクリーンベンチに戻し、照明を落とします。ネガティブコントロールのディッシュには分注済みのDMSOを、プローブ用およびコンペティション用のディッシュにはプローブをそれぞれ添加します。その後、ディッシュをインキュベーターに戻し、1時間静置します。

1時間後、ディッシュを氷上に置きます。各ディッシュの細胞を5 mLの氷冷PBSで穏やかに洗浄し、過剰なプローブを取り除きます。その後、細胞を4 mLの氷冷PBSで再び満たします。

ランプによる加熱を最小限に抑えるため、アイスパックの上に細胞を入れたディッシュを置き、UVランプの3 cm下に中心がくるように配置して、3分間照射します。ディッシュを取り出し、氷上に置きます。このようにして、すべてのサンプルを照射します。

すべてのサンプルの照射後、細胞からPBSを吸引し、各ディッシュにプロテアーゼ阻害剤を含む氷冷PBSを200 microliters加えます。ゴム製スクレイパーを用いてディッシュから細胞を剥離させ、氷上に置いたラベル付きマイクロ遠心チューブに移します。各サンプルにSDSを加え、最終濃度を0.4%にします。懸濁液を10パルス超音波処理し、氷上で1分間静置した後、さらに10パルス超音波処理して細胞を溶解させます。

細胞溶解を完了させ、すべてのタンパク質を変性させるため、95 °Cに設定したヒートブロックでサンプルを5分間加熱します。テキストプロトコルに記載されている方法で各サンプルのタンパク質濃度を測定した後、必要に応じてPBS PH 8.5に0.4% SDSを加えた溶液を添加し、タンパク質濃度を2.5 mg/mLに調整します。この手順を開始するには、前のセグメントで調製した各細胞溶解液を40 µLずつ新しいマイクロ遠心チューブに分注します。

以下の試薬をこの順序で加える：0.2 µLのflour-azide、0.58 µLのTCEP、および3.38 µLのTBTA。ボルテックスで混合する。反応を開始させるために、1.14 µLの硫酸銅(II)五水和物を加える。

短時間ボルテックスし、室温の暗所で30分間インキュベートします。反応を停止させるため、2X SDSサンプルバッファーを50 µL加えます。サンプルをSDS-PAGEゲルで電気泳動し、染料前線がゲルの末端に到達した後、さらに5分間泳動を継続して、未反応の余剰なflour-azideが完全にゲルから排出されるようにします。

余分なflour-azideをすべて洗い流した後、ゲルをガラスプレートの上に置き、メーカーの指示に従って蛍光ゲルスキャナーでスキャンします。ビオチンタグの付加については、タンパク質の標準化後、すべてのサンプルの容量が等しくなるように、細胞ライセートを最大量使用してください。あらかじめ洗浄済みのhigh capacity streptavidin agarose beads 50 µLを入れた新しいチューブに各サンプルを加え、ライセートをプレクリアします。

回転させながら4 °Cで1時間インキュベートします。遠心分離によりビーズをペレット化します。上清を氷上の新しいマイクロセントリフュージチューブに移し、ビーズは廃棄します。

ライセート500 µLあたり、1.38 µLのビオチンアジ化物、5.5 µLのTCEP、および32.5 µLのTBTAを添加します。ボルテックスで混合します。さらに、ライセート500 µLあたり11 µLの硫酸銅五水和物を添加し、短時間ボルテックスします。

室温で30分間インキュベートします。20 °Cに冷却したアセトンを試料容量の4倍量加え、試料をボルテックスした後、80 °Cで一晩インキュベートし、タンパク質を完全に沈殿させ、未反応のビオチンアジドを除去します。翌日、試料を4 °C、17,000 x gで15分間遠心分離し、沈殿したタンパク質をペレット化します。

上清を完全に吸引し、各サンプルに150 µLのPBS pH 7.4および1% SDSを加え、超音波処理によってタンパク質を再可溶化させます。各サンプルに600 µLのPBSを加え、SDS濃度を0.2%に希釈します。その後、あらかじめ洗浄済みの高キャパシティストレプトアビジンアガロースビーズ 30 µLを含む新しいチューブにサンプルを移します。4 °Cで1時間、回転させてインキュベートします。

1時間後、1000 x gで3分間遠心分離し、ビーズをペレット化します。未結合のタンパク質を含む上清を吸引して除去します。ビーズに1 mLの洗浄バッファーを加え、室温で回転させながら5分間インキュベートします。

遠心分離して上清を捨て、洗浄バッファーで再度洗浄します。最後の洗浄後、ビーズから洗浄バッファーを完全に吸引し、2X SDSサンプルバッファーを30 µL加えます。95 °Cのヒートブロックで5分間インキュベートし、ビーズからタンパク質を溶出させます。

ビーズを室温、13000 x gで1分間遠心分離します。SDS-PAGE用に、タンパク質を含むサンプルバッファーをビーズから慎重にピペッティングして回収します。蛍光タグで標識した後のタンパク質の可視化を、この蛍光スキャンゲルで示します。

約35 kilodaltonsの主要な特異的結合タンパク質バンドは、プローブのレーンにのみ存在し、過剰量の親化合物によって競合的に消失します。ビオチン・プルダウン後の銀染色により、同じ35 kilodaltonのバンドが可視化され、その後、質量分析によって膜タンパク質VDAC1であることが同定されました。このタンパク質の同一性は、VDAC1特異的抗体を用いてさらに検証されました。

プローブレーンにシグナルが存在し、コンペティションレーンでは減少しています。インプット画分を含めることで、抗体が機能しており、目的タンパク質がライセート中で検出可能であることを確認します。プルダウンサンプルの分子量がわずかに増加しているのは、プローブが共有結合しているためです。

プロトコルの特定のステップを正しく行わなかった場合の結果が示されています。過剰なflour-azideの除去が不完全な場合、蛍光スキャンゲルの底部に大きな黒いスミアが生じます。一方で、ライセートの不十分なプリクリアリング、またはビーズの洗浄不足がある場合、銀染色ゲルのバックグラウンド染色が非常に高くなります。プルダウン実験は、開始から完了まで2〜3日かかります。

質量分析またはウェスタンブロッティングによって標的タンパク質が単離および同定された後、標的が薬剤誘導フェノタイプにどのように関与しているかを評価するために、さらに標的特異的な検証実験を行う必要があります。