ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定

この手順の全体的な目標は、光親和性プローブを使用して低分子の結合タンパク質を同定し、生細胞でその標的に結合し、その後の標的の単離と同定を可能にすることです。この方法は、薬物やその他の小分子の作用の分子メカニズムを解明するために使用できます。この技術の主な利点は、標的タンパク質の結合および共有結合標識が天然の細胞環境内で行われるため、細胞溶解時に天然のタンパク質構造および結合条件を破壊するリスクが排除されることです。

この手順は、必要なサンプル数に対して、滅菌済みの6cm細胞培養皿を調製することから始めます。通常、治療条件ごとに1皿の細胞が使用されます。このデモンストレーションのために3つの細胞皿を用意し、DMSOのみ、標識D、プローブ処理のみ、標識P、およびプローブプラス競合薬による陰性対照を各培養皿 C.To 標識し、4ミリリットルの培地に350万HEK293T細胞を添加します。

細胞を一晩インキュベートします。細胞を治療する前に、必要な薬物を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに事前に分注します。競合他社の前処理では、2つのチューブのそれぞれに4マイクロリットルのDMSOを追加し、1つのチューブに4マイクロリットルの10ミリモルの競合他社を追加します。

プローブ処理には、1本のチューブに16マイクロリットルのDMSOを、2本のチューブのそれぞれに16マイクロリットルの15マイクロモル光親和性プローブを追加します。細胞培養皿を細胞培養フードに入れて、あらかじめ分注した薬剤を添加します。競技用処理皿から1ミリリットルの培地を吸引し、事前に分注した競合他社を含む微量遠心チューブに移し、薬剤を培地に再懸濁します。

培地と薬物の混合物を皿にゆっくりと滴下します。同様に、ネガティブコントロールディッシュとプローブディッシュの両方にDMSOを追加します。皿をインキュベーターに30分間戻します。

30分後、料理をカルチャーフードに戻し、照明を暗くします。事前に分注したDMSOをネガティブコントロールディッシュに加え、プローブとコンペティションディッシュにプローブします。皿をインキュベーターに1時間戻します。

1時間後、皿を氷の上に置きます。各皿の細胞を5ミリリットルの氷冷PBSで優しく洗い、余分なプローブを取り除きます。細胞を4ミリリットルの氷冷PBSで再度覆います。

ランプからの加熱を最小限に抑えるために、UVランプの下の3cmの中央にセルの皿を置き、ランプからの加熱を最小限に抑えます。皿を取り出して氷の上に置きます。このように、すべてのサンプルに照射します。

すべてのサンプルを照射した後、細胞からPBSを吸引し、プロテアーゼ阻害剤を含む200マイクロリットルの氷冷PBSを各皿に加えます。ゴムスクレーパーを使用して細胞を皿から分離し、氷上の標識済み微量遠心チューブに移します。各サンプルにSDSを最終濃度0.4%まで添加懸濁液を10パルス超音波処理し、氷上で1分間インキュベートした後、さらに10パルス超音波処理することにより、細胞を溶解します。

95°Cに設定したヒートブロックでサンプルを5分間煮沸して、細胞溶解を完了し、すべてのタンパク質を変性させます。各サンプル中のタンパク質濃度を測定した後、テキストプロトコルに記載されているように、PBS PH 8.5と必要に応じて0.4%SDSを添加することにより、タンパク質濃度を2.5ミリグラム/ミリリットルに正規化します。この手順を開始するには、前のセグメントで調製した各細胞溶解物の40マイクロリットルを新しい微量遠心チューブに移します。

0.2マイクロリットルのアジ化小麦粉、0.58マイクロリットルのTCEP、3.38マイクロリットルのTBTAの順に試薬を加えます。渦を混ぜます。1.14マイクロリットルの硫酸銅五水和物を加えて反応を開始します。

短時間ボルテックスし、暗所で室温で30分間インキュベートします。反応をクエンチするために、50マイクロリットルの2X SDSサンプルバッファーを添加します。SDS-PAGEゲル上でサンプルを泳動し、色素の前面がゲルの端に達したら、さらに5分間ゲルを泳動し続け、余分な未反応のアジド粉が完全にゲルから出たことを確認します。

余分なアジ化小麦粉をすべて洗い流した後、ゲルをガラスプレートに置き、製造元の指示に従って蛍光ゲルスキャナーを使用してゲルをスキャンします。ビオチンタグの結合には、タンパク質の標準化後に最大量の細胞ライセートを使用し、すべてのサンプルが同じ容量になるようにします。各サンプルを、50マイクロリットルの洗浄済み高容量ストレプトアビジンアガロースビーズを含む新しいチューブに追加して、ライセートを事前に透明

回転させて摂氏4度で1時間インキュベートします。遠心分離によりビーズをペレット化します。上清を氷上の新しい微量遠心チューブに移し、ビーズを捨てます。

ライセート500マイクロリットルあたり、次の試薬、1.38マイクロリットルのビオチンアジド、5.5マイクロリットルのTCEP、および32.5マイクロリットルのTBTAを追加します。.渦を混ぜます。溶解物500マイクロリットルあたり11マイクロリットルの硫酸銅五水和物と渦を短時間加えます。

室温で30分間インキュベートします。4サンプル量のアセトンを加え、摂氏20度に冷却し、サンプルをボルテックスし、摂氏80度で一晩インキュベートして、タンパク質を完全に沈殿させ、未反応のビオチンアジドを除去します。翌日、サンプルを17, 000 x gで4°Cで15分間遠心分離し、沈殿したタンパク質をペレット化します。

上清を完全に吸引し、各サンプルに150マイクロリットルのPBS PH 7.4および1%SDSを加え、超音波処理によってタンパク質を再溶解します。各サンプルに600マイクロリットルのPBSを加えて、SDSの濃度を0.2%に希釈し、次に、30マイクロリットルの洗浄済み大容量ストレプトアビジンアガロースビーズを含む新しいチューブにサンプルを追加します。回転させて摂氏4度で1時間インキュベートします。

1時間後、ビーズを1000 x gで3分間遠心分離してペレット化します。未結合のタンパク質を含む上清を吸引して廃棄します。ビーズに1ミリリットルの洗浄緩衝液を加え、室温で5分間回転させてインキュベートします。

遠心分離機にかけ、上清を捨て、再度洗浄バッファーで洗浄します。最終洗浄後、ビーズから洗浄バッファーを完全に吸引し、30マイクロリットルの2X SDSサンプルバッファーを添加します。摂氏95度のヒートブロックで5分間インキュベートし、ビーズからタンパク質を遊離させます。

ビーズを13000 x gで室温で1分間遠心分離します。ビーズからタンパク質を含むサンプルバッファーを慎重にピペットで動かし、SDS-PAGEに使用します。蛍光タグで標識した後のタンパク質の可視化は、この蛍光スキャンゲルによって示されています。

主要な特異的結合タンパク質バンドは、約35キロダルトンで、プローブレーンにのみ存在し、過剰な親化合物によって競合します。同じ35キロダルトンのバンドは、ビオチンプルダウン後の銀染色によって視覚化され、その後、質量分析によって膜タンパク質VDAC1として同定されました。このタンパク質の同一性は、VDAC1に対する特異的抗体を用いてさらに検証されました。

信号はプローブレーンに存在し、コンペティションレーンでは減少します。インプット画分を含めることで、抗体が機能し、目的のタンパク質をライセートで検出できます。プルダウンサンプルの分子量のわずかな増加は、プローブが密着して付着しているためです。

プロトコルの特定の手順を正しく実行しなかった場合の結果が示されています。過剰なアジ化小麦粉の不完全な除去は、蛍光走査ゲルの底部に大きな黒い塗抹標本をもたらし、溶解物の不十分な事前清澄化および/またはビーズの洗浄は、非常に高いバックグラウンド染色を有する銀染色ゲルをもたらす。プルダウン実験は、開始から終了まで2〜3日かかります。

標的タンパク質を単離し、質量分析またはウェスタンブロッティングで同定した後、さらに標的特異的なバリデーション実験を実施して、標的と薬物誘発表現型との関連性を評価する必要があります。