好気性グラニュール汚泥からの構造細胞外高分子物質の抽出

本実験の全体的な目的は、バイオフォーム、特に好気性粒状汚泥から、構造的な細胞外ポリマー物質（EPS）を得るための抽出法を示すことです。この手法は、粒状化プロセスの理解やEPS組成の分析など、粒状汚泥分野における重要な課題を解決するのに役立ちます。

この手法の主な利点は、EPS中のゲル形成ポリマーの存在を短時間で確認できることです。粒状汚泥を4,000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離し、上澄み液をデカンテーションします。抽出用にペレット中の粒状汚泥を回収します。

1,000 mLのガラスビーカーに150 mLの水道水を入れ、マグネチックスターラーで80 °Cまで予熱します。250 mLのバッフル付きフラスコに3 gの顆粒を移し、脱イオン水を加えて50 mLまで満たします。さらに、0.5% w/vの炭酸ナトリウム濃度にするため、0.67 gの炭酸ナトリウム十水和物をフラスコに加えます。

混合物が入ったフラスコをウォーターバスに入れます。蒸発を防ぐため、フラスコとビーカーのガラス部分をそれぞれアルミホイルで覆います。400 RPM、80 °Cで35分間、混合物を撹拌します。

混合物を50 mL遠心チューブに移します。混合物を含むチューブを4,000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。上清を回収し、ペレットは廃棄します。

好気性粒状汚泥から構造的EPSを得るための透析工程は任意です。しかし、本プロトコルに記載されているように、いくつかの利点があります。上清を分画分子量3,500 daltonsの透析袋にピペットで移し、1000mlの超純水に対して24時間透析させます。

透析の効果を高めるために、12時間後に透析水と交換します。透析後の抽出液を250mlのガラスビーカーに移し、室温、100 rpmでゆっくりと攪拌します。pH電極でpHの変化を継続的にモニターしながら、1 molar 塩酸を加え、最終的なpHを2.2 05に調整して、酸性形態の抽出液を得ます。

pHを2.2に調整した後、抽出液を50ml遠心分離チューブに移し、4000 ×g、4℃で20分間遠心分離します。上清を捨て、ゲル状のペレットを回収します。このゲル状ペレットが酸性形態のaleです。

アルギン酸のナトリウム塩を得るために、ガラス棒でゲルをゆっくりと混ぜながら、pH 8.5に達するまで0.5 Mの水酸化ナトリウムをゆっくりと加えます。パステールピペットを用いて、アルギン酸ナトリウム抽出液を塩化カルシウム溶液中にゆっくりと滴下します。抽出されたEPSにイオン性ハイドロゲル形成能がある場合、滴状の球状ビーズが形成されます。

あるいは、抽出したEPSにイオン性ハイドロゲル形成能がない場合は、抽出物が塩化カルシウム溶液中に分散します。ハイドロゲルビーズを塩化カルシウム溶液中で30分間保持します。スプーンを用いて、ハイドロゲルビーズを塩化カルシウム溶液から取り出し、EDTA溶液に移します。

ハイドロゲルビーズを10mlのEDTA溶液に入れ、4°Cで3時間保存します。この試験は、プロトコルに記載されている安定性試験の一例を示したものです。保存中にビーズに目に見える崩壊がないかを確認し、ビーズがこれらの条件に耐えられるかを評価します。

抽出が成功した場合、アルカリ抽出後、好気性粒状汚泥が可溶化され、抽出されたEPSを酸性にし遠心分離することでペレットが得られます。抽出されたEPSが構造的EPSであり、カルシウムイオンとともにハイドロゲルを形成する能力がある場合、抽出したEPSをカルシウム溶液に滴下するとゲルビーズが形成されます。このゲル形成能を持たないEPSが抽出された場合は、EPS溶液はカルシウム溶液中で分散します。

このビデオを視聴後、好気性粒状汚泥から構造的EPSを抽出できるようになります。また、得られたEPSのカルシウムイオンによるゲル形成能を試験できるようになります。好気性粒状汚泥から得られるEPSに対する抽出手法の影響を説明するため、この抽出方法を紹介することにしました。

それに加えて、EPSの抽出法に普遍的に適用可能な手法は存在しないことを示したいと考えました。