マウスから一次膵島および一次膵臓細胞を同時に分離するための簡単かつ迅速な方法

本研究は、マウス膵臓から機能的な一次膵島および腺皮細胞を効率的に抽出する簡略化された方法を開発し、急性膵炎誘発性糖尿病PPDMAの病因における細胞内コミュニケーションの研究に貴重なツールを提供しました。マウスから一次アイレットを分離する現在の方法は主に胆管カノレーションに依存しています。この技術は、胆管の正確な局所化とカニュレーションを行い、その後膵臓実質コラーゼP溶液のin vivo灌流を行います。

専門的な訓練なしには非常に困難であり、効果的かつ効率的な膵灌流を達成することは非常に困難です。このビデオは、灌流経験のない研究者に適した一次マウントアイレットを単純かつ迅速に分離する方法を妨げています。また、この方法は一次膵腺腺細胞の同時取得を可能にし、高品質な膵島や腺皮細胞を十分な量に獲得します。

これにより、研究者は同じ病理学的および生理学的文脈で実験を行うことができ、島と細胞間の相互作用メカニズムの詳細な解析を促進します。膵島および膵腺細胞PACの分離。ハンクのバランス塩溶液とコラーゲナーゼP溶液を12ウェルプレートに加え、50ミリリットルの遠心分離管に3ミリリットルのコラーゲナーゼP溶液を加えて消化します。

手術前に1.25%トリブロモエタノールで麻酔し、その後安楽死を行います。腹部にV字型の切開を入れて、マウスの腹腔を開けます。左心気症領域にある濃赤色のリンパ器官は脾臓であり、脾臓に付随する白色器官は膵臓です。

胃の下縁と膵十二指腸の接合部に沿って、膵臓を鈍く解剖します。隔離された膵組織をハンクのバランス塩溶液で洗浄し、残留した腸系膜の付着物、脾臓、膵臓周囲脂肪組織を除去します。前処理済み膵臓を12ウェルプレートに移し、2ミリリットルのコラーゲナーゼP溶液をあらかじめ加えて設置します。

左手でピンセットで膵臓を固定し、右手で1ミリリットルの注射器を使ってコラーゲンゼP溶液を膵実質に注入し、膵組織が半透明で浮腫するまで続けます。膵臓を1〜2ミリメートルに切り分け、外科用ハサミで組織片を素早く切り取る。1ミリリットルのピペット先端の遠位1〜1.5センチメートルを切り取り、開口部を拡大し、この改造された先端を使って膵臓組織の断片を2ミリリットルのコラーゲナーゼP溶液と共に、3ミリリットルのコラーゲナーゼP溶液をあらかじめ充填した50ミリリットルの遠心分離機チューブに移します。

遠心分離機チューブを37度の水浴で12分間孵化し、この間は5〜6分ごとに優しく揺らします。コラーゲナーゼP溶液の消化効果を終わらせるために、RPMI 1640完全培地を10ミリリットル追加します。ペレットを5ミリリットルのパスツールピペットで繰り返し、上下に15〜20回のストロークを行い、明らかな大きな組織の塊が残らないまで続けます。

RPMI 1640の完全メディウムを10ミリリットル加えます。次に180×Gで遠心分離機を4度Cで2分間加熱します。そして上清液は捨て、ペレットを20ミリリットルのRPMI 1640完全培地で再懸浮させます。

サスペンションを40メッシュのふるいでろ過してください。次に180×Gで遠心分離機を4度Cで2分間加熱します。上澄液は優しく捨てます。

ペレットを再懸浮させるためにフィコル溶液を20ミリリットル加えます。次に、RPMI 1640のコンプリートメディウムを15ミリリットルゆっくり加えます。この時点で透明な液体界面が観察されます。

640倍Gで25度Cで20分間、優しく遠心分離機にします。遠心分離機チューブを慎重に取り外し、5ミリリットルのパスツールピペットで上部の赤色培地層を吸引します。次に、液体層界面で液体を含むアイレットを慎重に吸引し、新しい50ミリリットルの遠心分離機管に移します。

RPMI 1640コンプリートメディウムを20ミリリットル加えます。180×Gで4度摂氏の2分間遠心分離し、上澄液を捨てる。ペレットを20ミリリットルのRPMI 1640完全培地で再懸浮させます。

180×Gで4度摂氏の2分間遠心分離し、上澄液を捨てる。ペレットを10ミリリットルのRPMI 1640完全培地で再懸浮させます。そして60ミリの細胞培養皿に移します。

逆立生物顕微鏡(倍率100倍)で、20マイクロリットルのピペットを使って手動でアイレットを選びます。選定されたアイスレットを、1ウェルあたり500マイクロリットルのRPMI 1640完全培地をあらかじめ充填した24ウェルの培養皿に移します。フィコル解層を破棄します。

ペレットを10ミリリットルのDMEM完全培地で再懸浮させます。100マイクロメートルのセルストレーナーでろ過します。遠心分離機は180 × Gで2分間、4度の摂氏で。

そして上清液は捨ててください。ペレットを10ミリリットルのDMEM完全培地で再懸浮させます。180度のGで遠心分離機を2分間、4度摂氏で処理し、上清液を廃棄します。

その後、5ミリリットルのDMEM完全培地でペレットを再懸浮させ、次の実験に備えます。フィコル溶液密度勾配遠心分離後、透明な無色液体層と培質の界面付近にアイスレットが観察され、チューブ底部に堆積物としてパックが存在しました。島は通常、丸い楕円形で黄金色の茶色で、1匹あたり120個±5個の安定した収量を持っていました(図Aおよび図B参照)。新たに分離されたPACは球状でクラスター状でした。

アシナー細胞は先端がより濃く、視認可能なザイモゲン顆粒があり、マウスあたりの収率は1.6〜1.95×10の7の倍セルでした(図Cおよび図D。島およびアシナー細胞クラセインPI染色では、ほとんどの細胞が緑色カルセイン染色、生細胞、少量赤色PIが死んでおり、図A。画像Jベースの定量解析では、分離された島およびアシナー細胞の生存率は97.52±0.16%および96.55プラス/であることが示されています。それぞれマイナス0.95%、図B。単離された膵腺腺細胞、基礎アミラーゼ活性は0.79±0.01単位/ミリリットル。10ナノモル、20ナノモル、50ナノモルのカエルリン刺激後、アミラーゼ活性はそれぞれ1.45±0.03単位/ミリリットル、1.65±0.05単位/ミリリットル、1.39±0.02単位/ミリリットルでした。一方変ANOVAでは、すべてのカエルリン群が対照群と有意に異なるアミラーゼ活性を示し、すべてのP値は0.001未満でした。

さらに、20ナノモル群は10ナノモル群と大きく異なり、P値は0.001未満、図A。インスリン分泌時に5.6ミリモラーグルコースで刺激した場合、アイレットあたり0.27±0.04ナノグラム、22ミリモラーグルコースで刺激した場合、1イレットあたり0.27±0.04ナノグラム/ミリリットル/時間、分離されたアイランド群が0.27±0.04ミリリットル/時間で分離された。 GSIは3.44に等しい、図B。本研究は複雑なin vivo灌流なしに一次マウスアイレットと膵腺細胞を同時に分離する方法を確立した。長い技術的障壁があるため、この方法は操作が容易で、マウスあたり120個の±5個のアイレットと1.6から1.95×10の7乗のアクシナー細胞を得られます。両細胞タイプとも96%以上の生存率を示します。分離されたアイスレットは正常なグルコース刺激インスリン分泌を示し、アクシナー細胞はカエルリン刺激に感受性を示します。これにより、この方法で得られた細胞が機能が完全に維持され、膵臓の外分泌および内分泌の相互作用の研究に適しています。

ただし、この方法は基本的なマウス解剖学知識の必要性、試薬用量調整の必要性、同時処理マウスの数の制限、そして未検証の適用リスクにより制限されています。灌流経験のない研究者にとっては、依然として信頼できる細胞分離プロトコルを提供しています。