蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

この手順の全体的な目的は、葉内の生細胞共焦点蛍光顕微鏡を用いてストロミュールの頻度を可視化および決定すること、ならびに葉から抽出した葉緑体を用いてin vitroでストロミュールを可視化することです。これらの実験手法は、ストロミュールがどのように機能するかを明らかにすることで、植物細胞生物学および葉緑体研究における重要な疑問への回答に寄与します。これらの技術の主な利点は、非常にダイナミックな葉緑体構造であっても、再現性と堅牢性の高いデータが得られることです。

ストロムールの形成には細胞骨格などの細胞質構造が必要であるという研究報告があったため、私たちは葉緑体分離の研究に着手しました。そこで、細胞を破砕してもストロムールが形成されるかどうかを確認することにしました。葉のサンプルを準備するには、まず非常に鋭利なカミソリを用いて、Nicotiana benthamiana の葉の一部分を小さく切り出します。

葉の切片を切り出した直後に、水を満たした5 mLシリンジの中に浸します。次に、シリンジ内の空気を抜き、指でシリンジの開口部を塞いでからプランジャーを引いて真空状態にします。葉の切片を損傷させないよう、プランジャーをゆっくりと戻します。

その後、気泡除去を2〜3回、または気泡がなくなり葉が濃い緑色に見えるまで繰り返します。スライドガラスに水を1滴加え、その滴の上に葉の切片を載せます。次に、葉の上にさらに水を1滴加え、カバーガラスを被せます。

気泡がある場合は、気泡が消えるまでカバーガラスを軽く叩いてください。透過光を用い、20倍対物レンズで葉切片の中心付近の視野に焦点を合わせ、複数の葉緑体を同時に視認します。後で必要に応じて細胞型を区別できるよう、透過光の画像を保存してください。

次に、使用する蛍光色素に適した励起フィルターおよび蛍光フィルターを用いてレーザー照射に切り替え、別の画像を保存します。顕微鏡ソフトウェアを使用してGFPチャンネルを選択し、ピンホール絞りを1 airy unitに調整します。レーザー走査を選択してサンプルの可視化を開始し、ストロミュール（stromules）を明確に可視化できる範囲でレーザー出力を最小限に抑えるため、GFPチャンネルと検出器ゲイン（detector gain）をクリックして調整します。

次に、視野内の葉表皮を通じて一連の画像を収集するZスタック実験を準備します。Zスタックを迅速に収集できるよう、必要に応じてスキャン速度と画像解像度を調整してください。その後、後で解析するためにZスタックを保存します。

Image Jを使用し、ソフトウェア内の最大強度（maximum intensity）を用いてZスタックを単一の画像にマージします。次に、画像内のすべての葉緑体を特定し、手動でカウントします。マージされたZスタック画像において、各葉緑体から1つ以上のストロームルが伸びているか視覚的に判定します。

無傷の葉緑体を抽出するために、以下の試薬を用いて冷抽出緩衝液を調製します。次に、NaOHとHClを用いてpHを6.9に調整し、使用まで冷蔵保存してください。また、単離緩衝液を調製し、pHを7.6に調整します。

葉が遺伝子コード化ストロマ蛍光タンパク質を発現していない場合は、カルボキシフルオレセインジアセテート（CFDA）溶液を調製します。葉緑体を単離するために、数株の植物から約5〜10gの葉を取り出し、冷水で軽くすすぎます。その後、直ちに葉を50mLの冷抽出バッファーに移します。

ブレンダーを用い、短時間のパルス動作を数回繰り返して葉を粉砕し、その後、混合液を2〜3層のチーズクロスでろ過して葉の残渣を除去します。抽出した葉緑体を2本の50 milliliter遠心チューブに分け、750 x gで1分間遠心分離します。上清を捨て、10 millitersの分離バッファーを用いて緑色の葉緑体を再懸濁します。

その後、750 x gで1分間再び遠心分離し、上清を捨て、単離バッファーを用いて葉緑体を最終容量5 mLまで再懸濁します。葉緑体がプラスチド標的蛍光タンパク質を発現している形質転換植物由来である場合は、葉緑体20 µLをスライドガラスに移し、カバーガラスを掛けます。その後、顕微鏡観察を行います。

プラスチド標的型蛍光タンパク質を発現していない植物の葉緑体を染色するには、分離バッファー中の葉緑体懸濁液 5 mL に 50 mM CFDAストック溶液 5 µL を加えます。葉緑体を5分間インキュベートした後、少量をスライドガラスに分注し、カバーガラスを載せて顕微鏡観察を行います。最後に、FITCまたはGFPフィルターセットと20倍対物レンズを用いて、複数の葉緑体を同時に可視化します。

または、単一の単離された葉緑体を可視化するために、より高倍率の対物レンズを使用します。ここでは、若齢のN.Benthamiana苗の茎葉におけるGFPストマウールの頻度を示すマージスタックを示します。このパネルでは、ストロマが黒く見えるように、画像の彩度を下げて反転させています。

葉緑体は、ストロムール（stromule）を持たないか、または少なくとも1つのストロムールを持つかに分類してラベル付けされました。可視化された87個の表皮葉緑体のうち、33個にストロムールが認められ、この葉における頻度は37.9%でした。このグラフは、21個の異なる個体から得られた単一の葉における、23,000個以上の葉緑体および数百個の細胞の解析結果を表しています。

日中の平均ストローム頻度は20.8 ± 1.8%であり、夜間の平均ストローム頻度は12.8 ± 0.9%であった。Welchのt検定により、日中の頻度が有意に高いことが示された。本図では、プラストイド標的GFPを発現させたN.benthamianaから単離した後、またはCFDAを用いてN.benthamianaまたはSpinachia oleraceaの葉緑体を染色した後に、in vitroで葉緑体ストロームを観察した。ストロームのライブセルイメージングを行う際は、迅速に作業し、植物組織への操作を最小限に抑えることが重要である。

本手順に従い、遺伝子サイレンシングや化学的処理などの他の手法を用いることで、ストロムールの形成および機能に関与するさらなる分子因子や経路を探索することが可能です。この技術は、植物細胞生物学や植物免疫の研究者によって、細胞シグナル伝達経路におけるストロムールの役割や、病原体に対する植物の応答を研究するために活用されてきました。このビデオを視聴することで、葉におけるストロムール出現頻度の算出方法と、抽出した葉緑体におけるストロムールの観察方法について十分に理解できるはずです。

また、走査電子共焦点顕微鏡に供給されるレーザーおよび電気電圧は非常に危険である可能性があるため、本装置を使用する際のシステム要件を理解しておくことが重要です。