蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

この手順の全体的な目標は、葉内の生細胞共焦点蛍光顕微鏡を使用してストロミュールの頻度を視覚化および決定すること、および葉から抽出した葉緑体を使用してin vitroでストロミュールを視覚化することです。これらの実験方法は、ストロミュールがどのように機能するかを発見することにより、植物細胞生物学や葉緑体研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、これらの非常に動的な葉緑体構造であっても、再現性のある堅牢なデータが得られることです。

葉緑体単離研究のアイデアは、ストロームの形成には細胞骨格のような細胞質構造が必要であることを示唆する研究があったからです。そこで、細胞をブレンドして、ストロムがまだ形成されるかどうかを確認することにしました。葉のサンプルを準備するには、まず非常に鋭利なカミソリの刃を使用して、Nicotiana benthamianaの葉の小さな部分を切り取ります。

葉の部分を切断した直後に、水で満たされた5ミリリットルの注射器にそれを浸します。次に、シリンジから空気を抜き、プランジャーを引く前に、指でシリンジの開口部を覆って真空剤を塗布します。葉の部分を傷つけないように、プランジャーを静かに放します。

次に、空気の除去を2〜3回、または空気が除去され、葉が深緑色に見えるまで繰り返します。スライドに水滴を追加し、その滴の上に葉の部分を置きます。次に、葉の上部にさらに水を一滴加え、カバースリップを追加します。

気泡がある場合は、カバースリップが剥がれるまで軽くたたいてください。透過光と20倍の対物レンズを使用して、葉の部分の中心近くの視野に焦点を合わせ、複数の葉緑体を同時に視覚化します。透過光で画像を保存しておけば、後で必要に応じて細胞の種類を区別できます。

次に、使用している蛍光色素に適した励起フィルターと蛍光フィルターを使用してレーザー照明に切り替え、別の画像を保存します。顕微鏡ソフトウェアを使用してGFPチャンネルを選択し、クリックしてピンホール絞りを1つのエアリーユニットに調整します。レーザースキャンを選択してサンプルの視覚化を開始し、GFPチャネルと検出器ゲインをクリックしてレーザー出力を最小限に抑えながら、ストロミュールを鮮明に視覚化します。

次に、視野内の葉の表皮を通して一連の画像を集めるZスタック実験を準備します。必要に応じてスキャン速度と画像解像度を調整して、Zスタックが迅速に収集されるようにします。次に、後で分析するために Z スタックを保存します。

画像 J を使用して、ソフトウェアの最大強度を使用して Z スタックを 1 つの画像にマージします。次に、画像内のすべての葉緑体を特定し、手動でカウントします。葉緑体ごとに、マージされた Z スタック画像で葉緑体から伸びる 1 つ以上のストロムが見えるかどうかを視覚的に判断します。

無傷の葉緑体を抽出するには、以下の試薬を使用して冷抽出バッファーを調製します。その後、NaOHとHClを使用してpHを6.9に調整し、冷蔵してから使用してください。単離バッファーを調製し、pHを7.6に調整します。

葉が遺伝的にコードされたストロモフルオロフォアを発現していない場合は、カルボキシフルオレセインジアセテートまたはCFDA溶液を調製します。葉緑体を分離するには、いくつかの植物から約5〜10グラムの葉を取り除き、冷水で短時間すすぎます。次に、すぐに葉を50ミリリットルの冷抽出緩衝液に移します。

いくつかの短いパルスのブレンダーを使用して、葉を挽き、次に混合物を2〜3層のチーズクロスでろ過して葉の破片を取り除きます。抽出した葉緑体を2本の50ミリリットル遠心分離管に分割し、750 x gで1分間遠心分離します。上清を捨て、10ミリリットルの分離バッファーを使用して緑色の葉緑体を再懸濁します。

次に、750 x gで1分間再度遠心分離し、上清を廃棄し、分離バッファーを使用して葉緑体を最終容量5ミリリットルまで再懸濁します。葉緑体が色素体を標的とする蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック植物由来の場合は、葉緑体20マイクロリットルをスライドに移し、カバースリップを追加します。その後、顕微鏡検査を行います。

色素体を標的とする蛍光タンパク質を発現していない植物由来の葉緑体を染色するには、分離バッファー中の葉緑体5ミリリットルに5マイクロリットルの50ミリモルCFDAストックを追加します。葉緑体を5分間インキュベートした後、小さなアリコートをスライドに移し、カバースリップを追加して顕微鏡検査を行います。最後に、FITCまたはGFPフィルターセットと20倍対物レンズを使用して、複数の葉緑体を同時に視覚化します。

または、単一の孤立した葉緑体を視覚化するというより高い目的。ここには、N.Benthamianaの若い苗のコドレデンスにおけるGFPストークル頻度を示すマージされたスタックが示されています。このパネルでは、間質が黒く見えるように、画像の彩度を下げて反転させています。

葉緑体は、ストロムがない、または少なくとも1つのストロムルを持っているとラベル付けされました。視覚化された87の表皮葉緑体のうち、33の葉にストロムがあり、この葉では37.9%の頻度でストロモがあります。このグラフは、21の異なる植物の1枚の葉から得られる23, 000以上の葉緑体と数百の細胞の分析を表しています。

日中の平均ストロミュール頻度は20.8±1.8パーセント、夜間の平均ストロミュール頻度は12.8±0.9パーセントであり、ウェルチのT検定によって決定されるように、日中の頻度が有意に高いことを示しています。この図では、色素体標的GFPを発現するN.benthamianaから単離した後、またはCFDAを使用してN.benthamianaまたはSpinachia oleraceaの葉緑体を染色した後、in vitroで葉緑体ストロミュールが観察されました。ストロムのライブセルイメージングを行う際には、迅速に作業を行い、植物組織の操作をできるだけ少なくすることが重要です。

この手順に続いて、遺伝子サイレンシングや化学処理などの他の方法を使用して、ストロミュールの形成と機能に関与する追加の分子プレーヤーまたは経路を発見することができます。この技術は、植物細胞生物学と植物免疫の研究者によって、細胞シグナル伝達経路と病原体に対する植物の応答におけるストロミュールの役割を研究するために使用されてきました。このビデオを見れば、葉のストロムル周波数を計算する方法と、抽出された葉緑体のストロムを観察する方法を十分に理解できるはずです。

また、走査型電子共焦点電子顕微鏡に供給するレーザーと電圧は非常に危険である可能性があるため、この装置を使用するためのシステム要件を理解することが重要です。