Name: の生産、結晶化と構造決意 C。ディフィシル PPEP-1 Microseeding及び亜鉛SADを介しました (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 学ぶマイクロシード法によるClostridium difficile由来PPEP-1タンパク質の単結晶育成技術。X線回折に適した高品質結晶を短期間で効率的に作製し、構造生物学研究や創薬開発への応用可能性を示します。

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私たちは、シンクロトロンデータ収集時のサポートのためのスイスの光源、ポールシェラー研究所、Villigen、スイスでのビームラインX06DAのスタッフに感謝します。私たちは、優れた技術サポートのためのモニカGompertに感謝しています。プロジェクトはケルン大学でサポートされているとドイツの研究評議会からINST 216/682から1 FUGGを付与しました。 CPの開発健康と疾病の国際大学院から博士課程の交わりが認められています。これらの結果につながる研究は、助成金の契約番号283570（BioStruct-X）の下で欧州共同体のセブンス枠組み計画（FP7 / 2007年から2013年）から資金提供を受けています。

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著者らは開示するものは何もない。

X線結晶学は、依然としてタンパク質28の3次元近接原子分解能構造を決定するための最速かつ最も正確な方法です。しかし、十分に秩序単結晶の成長を必要とします。これらは、多くの場合、取得するのが困難であり、結晶状態は、人工的です。しかしながら、他の方法によって決定されたもので、X線結晶学によって決定されるタンパク質構造の比較は、特にNMR、一般的に非常に良い一致を示しています。 PPEP-1の場合には、最近29公開されたNMR構造は、S-ループの移動度を含む当社の結晶構造14との優れた一致を示しています。 このプロトコルは、構造研究およびタグなしrPPEP-1の結晶化および構造決意のためのN末端HisタグrPPEP-1タンパク質の産生および精製を記載します。単結晶は、この場合、成長させることが困難であり、特殊microseeding手順を必要としました。トンで彼は我々がPPEP-1の結果を議論し、プロトコルが任意の他のタンパク質の生産および結晶化のために適合させることができる方法を示しますセクション以下。 <p ...

クロストリジウム・ディフィシルは、院内抗生物質関連下痢症の感染1の主要な原因の1つです。このグラム陽性嫌気性細菌は、糞口経路を介して、その胞子の形を介して送信されます。過去十年間で、新しい&#39;&#39;流行&#39;&#39;または&#39;&#39;の超&#39;&#39;株（ 例えば BI / NAP1 / 027）北米、欧州2の新規感染と死亡率の大幅な増加を引き起こしました。 C.ディフィシル -関連疾患（CDAD）は、高い致死率3との生活を脅かす大腸の炎症です。症状は、下痢4から偽膜性大腸炎5、しばしば致命的な中毒性巨大結腸6の範囲です。 毒性株が多剤耐性であり、再発率が7高いほどCDADの治療は困難です。抗生物質メトロニダゾール、fidaxomicinまたはバンコマイシンが含まれる、またはrepetitiのモーメント療法でvely再発例の糞便細菌叢移植。新しい治療戦略が緊急に8を必要とされています。いくつかの進展がC.ディフィシル毒素B 9をターゲットに 、治療用モノクローナル抗体Bezlotoxumabとして記録され、最近成功した第III相臨床試験を通過し、FDAやEMAと承認のために提出されました。さらに、新たな抗生物質は臨床試験10の異なる段階で、現時点ではテストされています。 効果的な治療法を開発するために新たな治療標的を識別しなければなりません。ノックアウト株におけるPPEP-1の欠如がCの病原性を減少させるように、そのような有望な標的である最近C.ディフィシルプロテアーゼプロリン-プロリンエンドペプチダーゼ-1（;; CD2830 / Zmp1 EC 3.4.24.89 PPEP-1）が発見されました生体内 11インチ ディフィシル 。 PPEP-1は、それらのC末端で2 C.ディフィシルアドヘシンを切断分泌型メタロプロテアーゼ12,13で13こうして付着bacterを解放人間の腸上皮からIA。したがって、 クロストリジウム・ディフィシルの固着性と運動性の表現型の間のバランスを維持することに関与しています。 PPEP-1に対する選択的阻害剤を開発するために、それはその3次元構造の詳細な知識が不可欠であるその基質を認識する方法を理解します。私たちは、基質ペプチド14でPPEP-1単独および複合体中の第1の結晶構造を解決しました。 PPEP-1は、2プロリン残基15との間に選択的に切断ペプチド結合最初の既知のプロテアーゼです。それは二重ねじれた方法で基板を結合し、プロテアーゼ活性部位14をカバーする S-ループに位置する残基の延長脂肪族-芳香族、ネットワークを介して、それを安定化させます。この基質結合モードはPPEP-1に固有のものであり、現在までに人間のプロテアーゼには見られません。これは有望な薬物標的になり、および阻害剤のオフターゲット効果は非常に低いです。 選択PPEP-1 INHを開発し、画面に将来的にibitors純粋な単分散PPEP-1タンパク質を多量に必要とされます。また、第一の阻害剤の結合様式を決定するために、PPEP-1との共結晶構造が決定されなければなりません。私たちの手でPPEP-1は常に相互成長結晶を生成します。したがって、私たちはPPEP-1の単一回折品質の結晶を生成するために最適化手順を開発しました。このプロトコルでは、我々は詳細にPPEP-1 14の生産、精製、結晶化および構造ソリューションについて説明します。我々は、亜鉛単一波長異常分散を介して最適化画面と構造決意に16 microseeding続く精製タグの除去と分泌シグナル配列、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを欠くPPEP-1変異体の大腸菌における細胞内発現を使用します（亜鉛-SAD）17。このプロトコルは、他のタンパク質（ 例えば 、の産生および構造決意に適合させることができます&lt;/ em&gt;のメタロプロテアーゼ）と相互成長結晶の製造タンパク質について、特にインチリクエストに応じて、構築物（をpET28a-NHIS-rPPEP-1）のプラスミドDNAおよび回折データは、教育目的のために提供することができます。

<table><tbody><tr><td>Genes / Vectors / cell strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a ベクター</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Thrombin cleavable N-terminal His-tag</td></tr><tr><td>E. coli strain BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td> PPEP-1 (CD630_28300) の <td>RNase H 欠損</td></tr><tr><td>コドン最適化遺伝子 (for E. coli)</td><td>Geneart(サーモフィッシャーサイエンティフィック)</td><td>カスタム</td><td>アミノ酸27-220</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出</td><td>物任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>消泡剤 B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>水性シリコーンエマルジョン</td></tr><tr><td>寒天</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>バッファーグレード</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>任意の</td><td></td><td>バッファーグレード</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>バッファーグレード</td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>リン酸アンモニウム 二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール 100%</td><td>any</td><td></td><td>純度の高いグレードの</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>液体</td><td></td><td></td><td>結晶の貯蔵および凍結冷却のための</td>窒素</tr><tr><td>任意名前</td><td>会社</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>機器(一般)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>振とうインキュベータ</td><td>ー20</td>の温度を提供する任意の<td></td><td>&deg;C-37 >C</td></tr><tr><td>ガラス製品</td><td>、任意の</td><td></td><td>バッフル、三角フラスコ(50ml-2.8L)、</td></tr><tr><td>大容量培養液の遠心分離</td>機、最大<td>12Lの処理容量のための遠心</td><td></td><td></td>分離機</tr>、超音波<tr><td>処理機、Vibra-Cell VCX500</td>、<td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>、またはその他の超音波処理機/細胞破壊器</td></tr>、<tr><td>超遠心分離機</td>、<td>最大150,000 x g</td><td></td>の速度を提供する遠心<td></td>分離機</tr><tr><td>NiNTA スーパーフロー樹脂</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Empty Glass Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>またはその他の空のガラスまたはプラスチックカラム</td></tr><tr><td>サイズ排除クロマトグラフィーカラム HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>クロマトグラフィーシステム &Auml;kta 清浄機</td><td>GE ヘルスケア</td><td>28406264</td><td>またはその他のクロマトグラフィーシステム</td></tr><tr><td>透析チューブ Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ クロージャー</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>限外ろ過ユニット(濃縮器) 10,000 NWCO</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis分光光度計</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>機器(結晶学)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>少量ピペット0.1-10 & マイクロ;</td><td></td><td></td><td></td>l</tr><tr><td>容積式ピペット Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>晶析ロボット</td><td>96</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウェル結晶化プレート TTP IQ 3つのタンパク質ウェル付き</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>またはその他の96ウェル結晶化プレート&nbsp;</td></tr><tr><td>24ウェルCombiCloverジュニアプレート</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルクリアシーリングテープハ</td><td>ンプトンリサーチ</td><td>HR3-511</td><td></td></tr>シリコン<tr><td>ガラスカバースライドハ</td><td>ンプトンリサーチ</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>商業結晶化スクリーン:SaltRx、インデックス、PEG /イオン、クリスタルハ</td><td>ンプトンリサーチ</td><td></td>多様な<td></td></tr><tr><td>商業結晶化スクリーン:ウィザード、PACT++、JCSG++イ</td><td>エナバイオサイエンス</td><td>多様な</td><td></td></tr><tr><td>JBSビーズフォーシードイ</td><td>エナバイオサイエンス</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT(ナイロンループ)</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>多様な</td><td>ループサイズ0.025 mm - 0.5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCapバイアル</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR4-904</td><td></td></tr>極<tr><td>低温フォームデュワー800ミリリットル</td>ハ<td>ンプトンリサーチ</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>極低温フォームデュワー 2 L</td><td>ハンプトン研究</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>バイアルクランプ、ストレートハ</td><td>ンプトン研究</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルワンド磁気、ストレート</td><td>ハンプトン研究</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>クライオケーン 6 バイアルホルダー</td><td>ハンプトン研究</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>クライオスリーブ</td><td>ハンプトン研究</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>クライオケーンカラーコーダー - ホワイト</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR4-713</td><td></td></tr>メス<tr><td></td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ストレートマイクロ鉗子</td><td>シール</td>テープの操作のために任意の<td></td>ストレートマイクロ鉗子<td>。 etc.</td></tr> <tr><td>鍼灸針</td><td>any</td><td></td><td>例えば薬局から</td></tr><tr><td>ステレオ顕微鏡</td><td></td><td></td> <td>any結晶化プレートの検査や結晶実装、最大160倍の倍率</td></tr></tbody></table>

の生産、結晶化と構造決意<em&gt; c。ディフィシル</em&gt; ppep-1 microseeding及び亜鉛sadを介しました

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

新しい治療法は、人間の健康に対する主要な脅威であるクロストリジウム・ディフィシル感染症を治療するために必要とされています。C.ディフィシルメタロプロテアーゼPPEP-1は、病原体の病原性を低下させる阻害剤の将来の開発の標的です。生物物理学的および構造的特性評価、および阻害剤のスクリーニングを行うには、高純度で活性なタンパク質が大量に必要になります。私たちは、大腸菌を発現宿主として用いることにより、結晶化と構造決定に十分な量と純度のタンパク質を産出するPPEP-1の効率的な生産と精製のためのプロトコールを開発しました。さらに、マイクロシーディングを使用して、PPEP-1の高度に相互成長した結晶をX線回折分析に適した整然とした結晶に成長させることができます。また、この方法は、他の組換えタンパク質を作製したり、相互成長結晶を産生する他のタンパク質の構造を研究したりするためにも使用できます。

rPPEP-1を大腸菌 BL21（DE3）スター（ 図1C）で最も高い収率で、いくつかの大腸菌株で過剰発現されます。最初のNiNTAアフィニティークロマトグラフィー工程後の6xHisタグが正常タンパク質の大部分から切断することができ、第二のNiNTAステップで未消化のタンパク質を完全にトロンビン消化されたタンパク質（ 図1D）から分離することができます。 S200 16/600カラムタグなしrPPEP-1に時折有するモノマーとして移動するには、おそらく二量体種（ 図2A）に対応する面し。タンパク質は、（ 図2B）純粋であり、収率は大腸菌培養物1 Lから約50mgのタンパク質です。 rPPEP-1は、多くの場合、リン酸を含む、様々な条件（ 図3）に結晶化します。結晶は、非常にすべての条件に相互成長しているので、結晶の最適化を実行しなければなりませんでし...

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) は、ヒトの病原体であるClostridium difficileから分泌されるメタロプロテアーゼであり、有望な薬物標的です。ここでは、このタンパク質の産生と構造決定に必要なすべての方法について説明します。

の生産、結晶化と構造決意<em&gt; C。ディフィシル</em&gt; PPEP-1 Microseeding及び亜鉛SADを介しました

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

この手順の全体的な目標は、組換えプロリンプロリンエンドペプチダーゼ-1、またはrPPEP-1タンパク質の単一格子回折品質の結晶を効率的に成長させることです。この方法を使用しないと、rPPEP-1はX線回折分析に適さない高度に相互成長した結晶を即座に生成します。この手法の主な利点は、rPPEP-1の構造決定のための多数の整然とした回折結晶を、限られた材料投入で短期間に製造できることです。この手順はマイクロシティ法を利用しており、rPPEP-1およびその基質ペプチド複合体の成功した初期結晶化条件のすべてに適応できます。この方法は、相互成長結晶を生成するほぼすべてのタンパク質の整然とした結晶を生成するように適合させることができます。また、クロスシーディング実験、タンパク質分散、または低分子の共結晶化実験にも使用できます。結晶化法の取り扱いを視覚的に実証することは、わずかな変動でも結晶の回折品質に大きな影響を与える可能性があるため、非常に重要です。市販の標準的なスクリーンと結晶化ロボットを用いて、シッティングドロップ方式で結晶化試験を行います。まず、精製したタンパク質を遠心限外ろ過装置を用いて、4000g、摂氏4°Cで5分間隔で12ミリグラム/ミリリットルに濃縮します。各間隔の後にタンパク質を混合して、沈殿物や悪化を防ぎます。モルセンチメートルあたり25, 900の吸光係数を使用して、280ナノメートルでのタンパク質濃度を決定します。タンパク質を摂氏20度に平衡化した後、16000倍g、摂氏20度で10分間遠心分離することにより、すべての粒子とほこりを取り除きます。クリスタルスクリーンを実行するには、摂氏4度で密封および保管されたプレフィルド結晶化プレートを使用します。トライアルを設定するときは、少量はすぐに乾くため、迅速に作業してください。また、可能であれば、ロボットのドックの周りに湿度チャンバーを使用してください。すべての結晶化プレートを摂氏20度に平衡化した後、タンパク質entリザーバーをサブウェル2〜4にピペッティングしてスクリーンをセットアップします。300ナノリットルの液滴容量を使用してください。タンパク質とリザーバーの比率は、サブウェル 2 では 200:100、サブウェル 3 では 150:150、サブウェル 4 では 100:200 を使用します。すぐにプレートを密封し、摂氏20度のチャンバーに入れます。最初の週は毎日セットアップ後にトレイを点検し、その後は毎週点検します。基質ペプチドrPPEP-1複合体の共結晶化のためには、rPPEP-1を1:1の比率で24ミリグラム/ミリリットルで混合し、トリス緩衝生理食塩水に可溶化した7倍モル過剰のペプチド溶液を凍結乾燥粉末でレイオフします。20°Cで30分間インキュベートした後、16000倍g、20°Cで1

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここで脂質中間相で手動での膜タンパク質の結晶化の試験を設定するにはカフリーの膜構造機能生物学研究グループに実装されたプロシージャが記述されています。...

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

構造に基づいたドラッグデザインは、薬物開発において重要な役割を果たしている。並行して複数のターゲットを追求すると、大幅にリード発見のための成功の可能性が高くなります。次の記事では、感染症のためにシアトル構造ゲノム科学センターでは、PB2インフルエンザサブユニットの遺伝子対構造決定のためのマルチターゲットアプローチを利用してどのように強調しています。...

インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

出典: フィゲロア、DM、 et.al。 抗菌ペプチド局在を特徴付けるための細菌スフェロプラストとプロトプラストの生産と可視化 J. Vis. 経験。 (2018年)このビデオでは、最初に細胞分裂を阻害してフィラメント化を誘導し、続いて細胞壁を酵素的に消化することにより、 大腸...

大 腸菌 スフェロプラストの調製

膜に埋め込まれたタンパク質ドメイン間の相互作用の生物物理学的および生化学的研究は多くの技術的課題は、適切な教材を入手されているの最初に直面しています。この記事では、ソリューションの核磁気共鳴（NMR）およびその他の分析アプリケーションによる構造解析に適しているジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体を製造し、精製するためのプロトコルについて説明します。...

構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産

βバレル外膜タンパク質(OMP)は、グラム陰性菌、ミトコンドリア、葉緑体の外膜内で多くの機能を果たします。ここでは、X線結晶構造解析またはNMR分光法による構造決定に十分な量のβバレルOMPを生成するためのプロトコルを提示することにより、構造研究における既知のボトルネックを軽減したいと考えています。...

βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

肺炎球菌から炭水化物基質結合タンパク質の豊富な生化学的および構造解析を実行するための合理化されたプロトコルが表示されます。...

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

ここで提案するグラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) を生成するプロトコル スフェロプ ラストとグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) 明確に可視化し、急速に特徴付けるプロトプ...

生産と細菌のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

X線結晶学によるNEMOのIKK結合ドメインの構造決定のためのプロトコルについて説明する。この方法には、タンパク質発現、精製および特性評価、ならびに結晶最適化を成功させるための戦略および非結合形態のタンパク質の構造決定が含まれる。...

NEMOのIKK結合ドメインの生産・結晶化・構造決定

このプロトコルは、構造レベルでTmPep1050、M42アミノペプチダーゼのダイマー-ドデカマー転移を研究するために開発されました。タンパク質精製からX線データ処理まで、簡単なパイプラインです。結晶生成、データセットインデックス化、および分子置換は、研究の場合、TmPep1050H60A H307A...

X線結晶学は 、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する

多目的なマイクロ流体デバイスは、カウンター拡散法を用いた酵素の結晶化、浸漬による結晶中の基質の導入、および室温でチップ内部の結晶の逐次分析による酵素:基質複合体の3D構造決定を可能にする記載されている。...

酵素の結晶化と構造決定:多用途マイクロ流体チップにおける連続結晶学による基質複合体

cryoEMを用いた高分子複合体の構造決定は、ある種のタンパク質や複合体に対して日常的なものとなっている。ここでは、このパイプラインが要約され(サンプルの準備、スクリーニング、データの取得と処理)、読者は、より困難な標本の場合に変更される可能性があり、さらに詳細なリソースと変数に向けられています。...

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

学ぶマイクロシード法によるClostridium difficile由来PPEP-1タンパク質の単結晶育成技術。X線回折に適した高品質結晶を短期間で効率的に作製し、構造生物学研究や創薬開発への応用可能性を示します。

の生産、結晶化と構造決意

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