の生産、結晶化と構造決意 C。ディフィシル PPEP-1 Microseeding及び亜鉛SADを介しました

この手順の全体的な目標は、組換えプロリンプロリンエンドペプチダーゼ-1、またはrPPEP-1タンパク質の単一格子回折品質の結晶を効率的に成長させることです。この方法を使用しないと、rPPEP-1はX線回折分析に適さない高度に相互成長した結晶を即座に生成します。この手法の主な利点は、rPPEP-1の構造決定のための多数の整然とした回折結晶を、限られた材料投入で短期間に製造できることです。

この手順はマイクロシティ法を利用しており、rPPEP-1およびその基質ペプチド複合体の成功した初期結晶化条件のすべてに適応できます。この方法は、相互成長結晶を生成するほぼすべてのタンパク質の整然とした結晶を生成するように適合させることができます。また、クロスシーディング実験、タンパク質分散、または低分子の共結晶化実験にも使用できます。

結晶化法の取り扱いを視覚的に実証することは、わずかな変動でも結晶の回折品質に大きな影響を与える可能性があるため、非常に重要です。市販の標準的なスクリーンと結晶化ロボットを用いて、シッティングドロップ方式で結晶化試験を行います。まず、精製したタンパク質を遠心限外ろ過装置を用いて、4000g、摂氏4°Cで5分間隔で12ミリグラム/ミリリットルに濃縮します。

各間隔の後にタンパク質を混合して、沈殿物や悪化を防ぎます。モルセンチメートルあたり25, 900の吸光係数を使用して、280ナノメートルでのタンパク質濃度を決定します。タンパク質を摂氏20度に平衡化した後、16000倍g、摂氏20度で10分間遠心分離することにより、すべての粒子とほこりを取り除きます。

クリスタルスクリーンを実行するには、摂氏4度で密封および保管されたプレフィルド結晶化プレートを使用します。トライアルを設定するときは、少量はすぐに乾くため、迅速に作業してください。また、可能であれば、ロボットのドックの周りに湿度チャンバーを使用してください。

すべての結晶化プレートを摂氏20度に平衡化した後、タンパク質entリザーバーをサブウェル2〜4にピペッティングしてスクリーンをセットアップします。300ナノリットルの液滴容量を使用してください。タンパク質とリザーバーの比率は、サブウェル 2 では 200:100、サブウェル 3 では 150:150、サブウェル 4 では 100:200 を使用します。

すぐにプレートを密封し、摂氏20度のチャンバーに入れます。最初の週は毎日セットアップ後にトレイを点検し、その後は毎週点検します。基質ペプチドrPPEP-1複合体の共結晶化のためには、rPPEP-1を1:1の比率で24ミリグラム/ミリリットルで混合し、トリス緩衝生理食塩水に可溶化した7倍モル過剰のペプチド溶液を凍結乾燥粉末でレイオフします。

20°Cで30分間インキュベートした後、16000倍g、20°Cで10分間遠心分離し、すべての粒子と塵埃を除去します。未結合のrPPEP-1タンパク質と同じマイクロシード手順を使用して結晶化を進めます。高度に相互成長したrPPEP-1の結晶は、2.4モルリン酸アンモニウム二塩基性および0.1モルのトリサシールpH 8.5を含む状態で2日後に現れました。

初期条件を最適化するには、ソフトウェアを使用して容量を計算し、ピペッティングスキームを使用して各条件の2ミリリットルを取得し、10個の最適化スクリーンを可能にします。条件には、0.15モルのステップで1.8〜2.55モルのリン酸アンモニウム二塩基性、および0.5 pH単位のステップで0.1モルのトリサシールpH 7.5〜9.0が含まれます。ストック溶液から24の条件からなるグリッドスクリーンを準備します。

ピペッティングスキームを使用して、個々の条件を構成します。すべてのグリッドスクリーン溶液の200マイクロリットルを24ウェルプレートのウェルにピペットで移し、プレートを摂氏20度で平衡化します。結晶化プレートを手動でセットアップします。

液滴容量は3マイクロリットルで、タンパク質とリザーバーの比率は2:1、1.5:1:5、1:2です。ここでは、気泡の形成を避けるために、容積式ピペットを使用してください。すぐにプレートを密封します。

次に、プレートを摂氏20度のチャンバーに入れます。1〜4日後、2.55モルリン酸アンモニウム二塩基性および0.1モルトリサシールpH7.5〜9.0を含む4つの条件で、高度に相互成長したrPPEP-1の結晶が現れますが、残りの20の条件では結晶は形成されません。これらの条件でrPPEP-1の単結晶を得るために、マイクロシーディング手順を実行します。

マイクロシードストックを調製するには、まず、成功した条件の1つから単一の相互成長結晶を選択します。次に、それぞれの母液の50マイクロリットルを、小さく高度に研磨されたガラスビーズを含む1.5ミリリットルのチューブに移し、母液の1マイクロリットルをガラスカバースライドに移します。取り付けられたナイロン潤滑剤を使用して、クリスタルを釣り上げ、ガラスカバースライドの液滴に移します。

次に、結晶を含む液体をチューブに移し、ガラスビーズが渦巻いていることを確認して、高速で30秒間渦巻きます。シードストックを1:1000に希釈して、同じ新しく準備した条件を含む新しい1.5ミリリットルのチューブにし、5秒間完全にボルテックスします。次に、20の条件をクリアドロップで覆っているプレートのシールをはがします。

0.5マイクロリットルの種子ストックをウェルにピペットで移します。プレートを密封し、摂氏20度のチャンバーに入れます。このマイクロシーディング技術を適用した後、高い回折品質の単結晶は、1.8〜2.4モルのリン酸アンモニウムと0.1モルのトリスpH 7.5〜9を含む、さまざまな条件でセットアップ後数時間から数日で現れます。

結晶は、最大寸法で100〜200ミクロンのサイズに成長します。選択したクリスタルの最大長に最適なサイズのナイロンループを選択するには、クリスタルのすぐ上のシーリングテープにループを配置し、上下に焦点を合わせます。rPPEP-1結晶の一般的な最長アクセスは約100〜200ミクロンです。

また、適切なクライオコンディションを準備します。フォームデュワーに液体窒素を入れます。次に、バイアルクランプにバイアルをロードし、液体窒素を充填した800ミリリットルのフォームデューワーで予冷します。

適切な識別子とクライオスリーブでマークされたクライオケーンホルダーを、液体窒素で満たされた2リットルのフォームデューワーに入れます。次に、マグネットワンドに適切なサイズのナイロンループを取り付けます。次に、結晶化プレートのシールテープを鋭利なメスで切り開き、鉗子で剥がします。

クライオコンディションの1マイクロリットルをカバースライドにピペットで移します。結晶やループ内の微量のクライオ溶液を乾燥させると、結晶品質の変動や回折の完全な損失につながる可能性があるため、このステップで迅速に作業することが特に重要です。すべての結晶操作ステップは、実体顕微鏡下で実行する必要があります。

結晶がプラスチック表面にくっついている場合は、鍼治療の針で周囲のプラスチックを変形させて地面から剥がします。取り付けられたナイロンループでクリスタルを釣り上げて、ドロップからクリスタルを取り外します。結晶を凍結状態の液滴にすばやく移し、1秒間平衡化させます。

次に、取り付けられたナイロンループで水滴からクリスタルをできるだけ早く釣り上げます。回収した結晶を液体窒素にすぐに急降下凍結します。取り付けられたループの周りの液体窒素の沸騰が止まったら、ループをバイアルに入れます。

バイアルをクライオケーンホルダーに置きます。ホルダーに6本のバイアルが装填されたら、ホルダーの周りにクライオスリーブを置きます。結晶は、使用するまで液体窒素で満たされたタンクに保管してください。

データ収集を行うには、取り付けられた結晶をクランプを使用してクライオケーンから慎重に取り出し、輸送のために発泡スチロールに保管します。ビームストップと検出器をパーク位置に移動し、クライオノズルを数ミリメートル上に動かします。バイアルをすばやく取り外しながら、指でベースを保持しながら、クライオキャップのベースをゴニオメーターヘッドに取り付けます。

次に、クライオノズルとビームストップを元の位置に戻し、結晶を中央に配置します。ビームストップや検出器には常に触れないように注意してください。次に示すように、振動角が0.1度の180度のデータセットの収集に進みます。

ここに示されているのは、1.4クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物、0.1モルHEPESナトリウム、pH 7.5の市販の結晶化スクリーニングを使用した初期スクリーニングから得られた高度に相互成長したrPPEP-1結晶です。ここに示されているのは、60%の容量から体積のタクシメート、pH 7.0、0.1モルのBIS-TRISプロパン、pH 7.0での初期スクリーニングから得られた結晶です。結晶は、2.4モルリン酸アンモニウム二塩基性、0.1モルトリス、pH 8.5でも現れました。

マイクロシーディング最適化手順を適用した後、単結晶を2.1モルリン酸アンモニウム二塩基、0.1モルトリス、pH 8、および2.25モルリン酸アンモニウム二塩基、0.1モルトリス、pH 8を含むいくつかの条件で含みました。ナイロンループに取り付けられた結晶は、サイズが100〜200ミクロンで、顕微鏡検査からは単一の格子を持っているように見えます。X線回折分析は、これらの結晶が実際に単一の格子を示し、X線を原子分解能に近いまで回折することを示しています。

組換えPPEP-1基質ペプチド複合体の結晶構造を解くことで、PPEP-1の基質結合モードに関する洞察が得られます。基質ペプチドは、その開放確認でPPEP-1の基質結合基に拡散する可能性があります。その後、ループ閉鎖が起こると、基板は水素結合とSループ上に位置するユニークな脂肪族芳香族側鎖ネットワークを介してPPEP-1と相互作用します。

この基質は、シズルペプチド結合とP2プライムからP3プライムペプチド結合にキンクを持つユニークな二重キンクコンフォメーションで結合します。このビデオを見れば、構造研究のために組換えPPEP-1の単一格子井戸回折結晶を作製する方法を十分に理解できるはずです。同様のアプローチを他のタンパク質にも使用することができ、高度に相互成長した結晶が得られ、さらに異なるインキュベーション温度とCストック希釈が得られます。

その汎用性と簡単な使用のため、この単純な手法は、すべての結晶最適化プロセスで試す必要があります。