構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産

このプロトコルは、膜タンパク質が脂質包埋ドメインを通じて互いにどのように相互作用するかを理解することを目的とした構造研究のために、膜貫通ペプチドの共有結合的に安定化された複合体を産生します。まず、大腸菌に目的の膜貫通配列を含むhistタグ付き融合タンパク質を発現します。次に、ギネを使用して封入体画分からタンパク質を抽出し、ニッケル親和性マトリックスを使用して界面活性剤を抽出します。

hist タグ付き融合タンパク質を濃縮し、酸化剤を含む溶液でカラムを洗浄することにより、ジサルフィドを直径型に架橋します。次に、架橋融合タンパク質をTri Fluor酢酸で溶出させ、臭化シアンで処理して融合パートナーを放出させ、逆相HPLCにより消化混合物から架橋ペプチド産物を単離する。最終的に、製品の同一性と純度は、SDSページと質量分析によって検証されます。

この手法の主な利点は、溶液や固体NMRなどの技術を使用した構造研究のために、純粋なソシオメトリック錯体が生成されることです。2つの膜貫通ドメインが相互作用することが知られている場合でも、実験条件下ではペプチドの溶解性と複合体形成はしばしば対立します。明確に定義された共有結合安定化複合体から始めると、高品質のデータ収集のためにテストできる実験条件の範囲が大幅に広がります。

一般に、この方法に不慣れな個人は、これらの非常に疎水性のタンパク質断片の取り扱いの難しさに苦労します。このプロトコルと添付の原稿に記載されているアドバイスは、予測および精製プロセスにおける最も一般的な課題のいくつかに対して簡単な解決策を提供するように設計されています。口蓋は、胃袋ペプチドを発現する細菌の1リットル培養物を融合させ、溶解緩衝液の50ミリリットルに再懸濁する。

次に、最大出力で1分間3サイクルの超音波処理を行い、氷上で5分間冷却します。不溶性含有体材料を20, 000 Gで遠心分離して15分間デカントし、上清を脇に置きます。超音波処理および遠心分離のステップは、IB画分の純度の向上が必要な場合に繰り返すことができる。

ペレットと上清材料のサンプルをSDSページ分析用に予約して、トリップを確認します。TM融合のインクルージョン体への局在化は、インクルージョンボディペレットをギン溶液に溶解し、培養物1リットルあたり25〜50ミリリットルを使用します。処理された混合物は、室温で数時間穏やかに混合され、時々日光を浴びます。

次に、75, 000〜100, 000倍Gで1時間遠心分離することにより、封入体溶解物を除去します。室温で、50ミリリットルの円錐管内の0.2ミクロンのメンブレンでスーパーナトをろ過します。透明化されたインクルージョン体ライセートを、ギネ溶液に平衡化したニッケルアフィニティー樹脂と組み合わせ、バッチ結合します。

懸濁液を室温で一晩穏やかに混合します。包含体ライセートニッケル樹脂懸濁液を、全容積が流れるまで多孔質床支持体を備えた空の重力流塔にロードします。まだ結合していない融合タンパク質が含まれている可能性のある流れを収集して脇に置きます。

次に、ニッケル樹脂を重力で洗浄します。5ミリモルビームメルカプトエタノールを含む尿素溶液の5床容量のフロー。3回目の洗浄では、ビームメルカプトエタノールを使用せずに2回目の洗浄を行います。

硫酸銅と酸化グルタチオンを補給した尿素溶液を使用してください。次に、カラム出口を閉じ、室温で30分間インキュベートして、ジサルフィド結合を最大限に形成します。酸化性尿素溶液を10ベッド容量の水で洗い流します。

次に、バキュームラインを適用してカラムベッドを乾燥させ、カラム出口を閉じます。次に、化学安全フードに1.5ベッド容量のきちんとしたTFAを追加し、小さなヘラでニッケル樹脂を攪拌して酸に均一にさらし、5分間インキュベートします。必要に応じて、圧縮されたエアラインで穏やかに加圧して酸溶出液を収集し、すべての液体を押し出します。

タンパク質の収量を測定するには、トリフルオロエタノールでTFA EITを希釈し、A-T-F-A-T-Eに対して280ナノメートルで吸光度を測定します。酸eluを滴下して最終TFA濃度の80%に希釈します。やさしく混ぜながら水を加えます。

フォームを沈殿させる場合は、溶液が明確になるまで少量のTFAを戻します。その後、水で80%に再補正します。SDSページ分析用に5マイクロリットルのプリダイジェストサンプルを予約し、液体窒素ですぐに凍結します。

次に、臭化シアン結晶をサンプル1ミリリットルあたり約0.2グラムの秤量します。有毒化学物質を安全に計量するように注意してください。安全フード内のサンプルに臭化シアンを加え、完全に溶解するまで穏やかに混合します。

次に、反応容器を不活性ガスシール内で洗い流し、光から保護された室温で3〜4時間インキュベートします。5 マイクロリットルのポストダイジェストサンプルを SDS ページ分析用に予約し、すぐに液体窒素で凍結して、プリダイジェストサンプルと一緒に凍結乾燥します。その後、消化反応を再生したセルロース透析カセットに移し、体積を大幅に増やすことができます。

ケミカルファムフード内の4リットルの水に対してサンプルを一晩透析します。翌朝、懸濁タンパク質沈殿物を含む透析反応溶液を透析カセットから取り出し、懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移します。次に、サンプルを数日間凍結して凍結乾燥し、水分と微量のシアン、臭化物、TFAを取り除き、最大100ミリグラムの凍結乾燥消化物を3ミリリットルのきれいなギ酸混合物に溶解します溶液が完全に透明になるまで混合します。

サンプルを分取スケール zoax SB 300 C3 カラムにロードし、5 mL のサンプルループを使用して溶媒 A を流します。次に、溶媒Bのグラジエントで、少なくとも5カラム容量にわたって消化産物を溶出します。SDSページとMALDI TOF質量分析によりHPLCフラクションを解析し、目的の種を特定し、予想される質量凍結乾燥を確認します。

架橋ペプチド産物を含有するHPLC画分。製品が乾燥して粉末状になった場合は、少量のHFIPに再溶解し、液体で凍結して凍結乾燥することができます。再び、結果は、免疫受容体膜貫通シグナル伝達分子の膜貫通領域およびフラグ領域をコードするDNA配列を容易に傾けて秤量することができるふわふわの白い円錐形になります。

DAP 12は、ヒンディー語の3つおよびBAM H 1の制限部位を使用してPMMペプチドベクターにクローニングしました。得られた細菌発現コンストラクトは、臭化シアン切断および酸化的架橋のためのユニークな内部メチオニンおよびシスチン残基を有する彼のタグ付きトリップ融合タンパク質を産生する。トリプ融合体で達成される発現レベルは、結合したペプチドのアミノ酸配列によって異なります。

この調製物により、1 リットルの培養物と 4 ミリリットルのニッケルマトリックスから、約 120 ミリグラムの純粋なインタクト融合タンパク質が得られました。細胞溶解後、融合タンパク質は封入体ペレットに局在しました。ニッケル精製トリプDAP 12 TM融合液の約70%は、DME型に架橋されたジスルフィドでした。

DAP 12 TM ペプチド産物は、全臭化シアン消化サンプルでは容易に識別できませんが、還元消化サンプル中のインタクト融合およびトリップフラグメントバンドを比較すると、この典型的な消化産物の分離において、融合の消化が約 60% 完了したことが示されています。逆相HPLCを使用した分取スケールのC3カラムでは、溶媒B.Theのディススルフィド架橋ペプチド産物の2段階グラジエントで言及された結合生成物は、非還元および還元条件下での主要なHPLC画分のSDSページ分析で識別できます。Maldi tof 質量分析により、ピーク 4 の deme ペプチドと主要生成物 6729.2 ダルトンの同一性が確認されました。

臭化シアン有機溶剤や濃酸の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。これらの手順を実行するときは、適切な保護具を着用する必要があり、臭化シアンは承認された化学安全フードの外で取り扱わないでください。この手法は、膜貫通型ペプチド複合体の3つの異なる溶液n mr構造の主要な研究材料を提供し、マルチサブユニット免疫受容体がリンパ球膜内のタンパク質相互作用を通じてどのように組み立てられるかを示しています。

この技術の適用は、他の膜タンパク質システムにも同様に価値があることが証明されると信じています。