健康なボランティアからの内皮前駆細胞の単離および心臓手術後の血清試料の影響を受け彼らの渡り鳥の可能性

内皮前駆細胞（EPC）が決定的に虚血組織の血管新生に関与しています。この方法は、末梢血由来のヒトEPCの単離、ならびに心臓手術患者の血清サンプルに対する彼らの渡り鳥の可能性の同定を記載します。

この細胞単離手順と遊走プロトコルの全体的な目標は、内皮前駆細胞とその移動能を心臓外科患者の血清サンプルに向けて分離する信頼性の高い方法を示すことです。この方法は、虚血や再灌流関連の損傷による心臓手術後に必要となる内皮内層と血管の再生における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、CD-34陽性細胞の事前単離を含む、前駆細胞を単離する比較的簡単な方法です。

死亡者に加えて、心臓手術の主要な合併症は依然としてあまりにも一般的です。心臓手術中の結線リスクと保護メカニズムを特定する必要性を強調しています。内皮前駆細胞は、虚血組織の血管新生に決定的に関与しており、心臓保護特性を提供することが知られています。

実験を開始するには、血液をカルシウムフリーおよびマグネシウムフリーのPBSと1対1で混合します。15ミリリットルの密度勾配溶液を50ミリリットルのチューブに加えます。そして、密度勾配溶液の上に希釈した血液をゆっくりと重ねます。

次に、サンプルを遠心分離します。滅菌プラスチックピペットを使用して、すべてのチューブのバフィーコート層を慎重に収集し、密度勾配溶液を避けながら別のチューブに入れます。末梢血単核細胞(PBMC画分)を少なくとも3容量のPBSで希釈し、ピペッティングで溶液を混合します。

混合物を室温で15分間、200倍Gで遠心分離し、上清を吸引し、細胞ペレットを5ミリリットルの内皮細胞増殖培地MV-2に再懸濁します。細胞を再懸濁した後、使用済みのバフィーコートごとに100マイクロリットルのヒトCD-34抗体を追加し、細胞を回転させます。使用済みのバフィーコートごとに50マイクロリットルのデキストランコーティングされた磁気ビーズを追加し、細胞を回転させます。

インキュベーション後、懸濁液を最大3ミリリットルのファクシミリリットルでファクシミリ管に移します。次に、ファックス管を磁石に挿入し、5分間待ちます。ファックスチューブを磁石から引き抜かずに、スーパーネイタントを捨てます。

次に、磁石の外側で、各ファックス管のセルを3ミリリットルのMV-2培地で再懸濁します。細胞懸濁液をプレコートされたT-75フラスコに移します。各フラスコに17ミリリットルのMV-2ミディアムを追加します。

遊走アッセイを調製するには、ピペットを使用して、T-75フラスコ内の内皮前駆細胞またはEPCから培地を取り出します。細胞を5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで洗浄し、フラスコを慎重に振る。次に、PBSを取り外し、市販の細胞剥離液を5ミリリットル追加します。

次に、細胞が光学顕微鏡で分離されるまで待ちます。フラスコの底を慎重に叩くことで取り外しを加速します。細胞が剥離したら、5ミリリットルのMV-2完全培地を迅速に追加し、細胞懸濁液を別のチューブに移します。

細胞を2, 000 x Gで5分間遠心分離します。細胞をペレット化した後、5〜10ミリリットルのPBSに再懸濁します。そして、それらを再び遠心分離します。

細胞を再び5〜10ミリリットルのPBSに再懸濁し、続いて遠心分離を行います。細胞ペレットをMV-2飢餓培地に再懸濁します。次に、血清サンプルをMV-2飢餓培地で1〜5希釈します。

235マイクロリットルの血清サンプルを下部チャンバーに追加して、移行プレートを準備します。セル溶液を追加する直前にインサートを追加します。次に、75マイクロリットルの細胞溶液を上部チャンバーに加えます。

EPC の移行を許可します。すべての未移行細胞を含む上部チャンバーを取り外してください。1 対 1, 000 で希釈した hoechst 染料を含む 3.6% パラホルムアルデヒド溶液を 75 マイクロリットル追加します。

プレートをまもなく遠心分離して、すべての細胞を2、000 x Gで1〜2分間同じ焦点面に入れます。血清の自家蛍光アーチファクトを避けるために、顕微鏡で100倍の倍率でウェルごとに5枚の写真を撮影し、移動した細胞を定量します。最後に、半自動ソフトウェアを使用して移行した細胞をカウントします。

EPCのFAX解析により、acLDLの取り込みと、単離された細胞集団の表面でのCD-31の発現が確認されます。acLDLとCD-31の解析を分離すると、各マーカーの均質な分布が明らかになります。Elysoは、MIF、CXCL12、CXCL8、およびVEGFの循環血清レベルの濃度に対する心筋再灌流障害後の心臓手術の影響を特定します。

血清サンプルは術前および術中に採取されました。MIF、CXCL12、CXCL8 の血清レベルは、ベースライン値と比較して術中有意な増加を示しました。対照的に、VEGF濃度は有意な変化を示さなかった。

手術前および手術中に採取した血清サンプルを使用した ex vivo 遊走アッセイを、健康なボランティアから分離した EPC を使用して実施し、術中に採取したサンプルへの移動率が大幅に増加したことを明らかにしました。この技術に続いて、末梢血単核細胞を容易に単離し、追加の炎症関連の問題に答えることができます。