神経筋接合部機能を測定

この手順の全体的な目的は、ex vivo実験アプローチを用いて神経筋接合部の機能を研究することです。これは、筋肉の膜への直接刺激と、神経を介した刺激という2つの方法で筋肉神経標本を刺激することによって達成されます。膜刺激では神経伝達シグナリングをバイパスするため、2つの収縮反応の間に生じる差異は、神経筋接合部の機能の間接的な測定値として考えることができます。

ここでは、ヒラメ筋および坐骨神経標本を用いた本の手順について説明します。筋肉を神経と共に摘出し、灌流組織浴に配置します。これを張力および長さ制御装置に固定し、筋肉と平行に白金電極の一対を配置します。

次に、ガラス製吸引電極を切断した神経端の近くまで移動させます。その後、神経筋接合部と筋肉の両方の機能を徹底的に評価するために、包括的な検査プロトコルを適用します。筋肉と神経の間の機能的結合により、両方の部位および生存している2つの分画についての結論が得られます。

2つの組織が接する最初の領域には、通常、圧着したような形態を示す神経筋接合部が存在します。しかし、いくつかの病理学的条件下では、筋肉と神経の間の機能的な相互作用が著しく損なわれ、神経筋接合部は複雑な形態学的組織を失います。本手順の全体的な目的は、ex vivoの実験的アプローチを用いて、神経筋接合部の機能を研究することです。

これは、2つの方法で筋肉神経標本を刺激することによって行われます。一つは筋膜を直接刺激する方法、もう一つは神経を刺激して筋肉の特性を分析する方法です。循環式恒温水槽の電源を入れ、温度を30°Cに調整してください。

バスにKrebs-Ringer溶液を満たします。0.4 barの混合ガスをoxitube経由でバス内に流します。アクチュエータ・トランスデューサーと2台のパルス刺激装置の電源を入れます。

膜刺激の電流値を300 million pairに、神経刺激の電流値を5 million pairに設定します。頚椎脱骨によりマウスを安楽死させた後、脚部の皮膚を取り除きます。次にアキレス腱を切断し、腱をしっかりとクランプしながら、腓腹筋とヒラメ筋を一緒に上方へ引き上げます。

ヒラメ筋の近位腱を露出させた後、その上のふくらはぎ全体を切除し、速やかにサンプルを実体顕微鏡下の組織浴に設置します。ピンセットを用いてヒラメ筋の近位腱をしっかりと固定し、ゆっくりと引っ張って坐骨神経の支配領域を露出させます。神経が露出したら、周囲の組織を除去し、神経を約5 mm露出させます。

次に、精巧な鋏を用いて神経を慎重に切断します。アキレス腱を切断して、ヒラメ筋を腓腹筋から分離し、筋肉と神経の摘出を完了させます。これで、筋肉・神経標本を試験装置に取り付ける準備が整いました。

ナイロン糸の末端に引き抜き結びを作り、アキレス腱に巻き付けて締め付けます。近位側の腱を固定クランプで挟み、ナイロン糸を力変換器のレバーアームに結び付けます。その後、筋肉を溶液中で平衡状態にします。

初期の最適長を決定するために、クリープ荷重値を緩やかに変化させながら、一連の単一パルスで筋肉を刺激します。収縮力が最大となったときが最適長です。吸引電極を筋肉の近くに配置し、神経を引き込みます。

次に、パルス電流値を緩やかに変化させながら、一連の単発パルスで筋肉を刺激します。神経を介して刺激した際に筋肉によって生成される収縮力は、膜上で刺激した際に測定された値と同等であるはずです。最適な電流値が決定したら、電極から神経を出し、数回の電流パルスを印加します。

以前に選択した電流値が過剰な場合、吸引電極を通じて供給される電流パルスが浴液を介して電流を伝導し、筋肉の収縮を誘発します。自作のソフトウェアを用いて、ヒラメ筋神経筋接合部の機能性を研究するための自動試験プロトコルを考案しました。このプロトコルは約65分間で構成され、4つの異なるパートに分かれています。

第一部では、筋肉に4回の単一パルス刺激を与えます。そのうち2回は直接刺激し、2回は神経を介して刺激します。その後、収縮反応から、ピーク到達時間、半弛緩時間、力微分の最大値、および収縮力を測定します。

第2部では、筋肉に20 hertzから強直周波数である80 hertzまでの一連のパルス列による刺激を与えます。これにより、神経刺激と直接刺激の両方について、力-周波数曲線（force-frequency curves）を算出します。プロトコルの第3部および第4部では、神経伝達不全と強直内疲労を測定するため、筋肉に2つの疲労パラダイムを適用します。

これらの疲労パラダイムでは、まず膜に1回のパルス列を送り、続いて神経を介して14回のパルス列を送り、筋肉を連続的に刺激します。この一連のシーケンスを20回繰り返します。最初のパラダイムは35 hertzの発火周波数で実施されます。

2回目は80 Hzの強直周波数で行います。神経伝達の不全は、活動電位伝播の外部ブロック、伝達物質放出の減少、および接合部疲労能における膜興奮性の低下に関連しており、疲労の進展において重要な役割を果たすと考えられています。神経筋接合部疲労能のもう一つの側面は、単一の強直性収縮中に筋力が維持される能力の指標であり、高周波疲労を反映する強直内疲労によって明確に示されます。

プロトコルの最後に、アナログキャリパーと精密天秤を用いて筋肉の正味の長さと重量を測定し、筋肉の横断面積を算出します。筋萎縮性側索硬化症のSOD1トランスジェニックマウスモデルを用いた研究により、この手法の有用性が強調されています。実際、トランスジェニックマウスのヒラメ筋では、直接刺激時の力微分および強直力（tetanic force）の両方において収縮反応の低下が認められ、神経を介して刺激した場合にはさらに顕著な低下が認められます。

例えば強直性張力に関して、これらの実験では、筋肉の収縮能が損傷の25%を占め、さらに45%が神経伝達の欠損に関連していることが示されました。もう一つの興味深い点は、対照群の筋肉において、直接刺激または間接刺激による差が認められなかったことです。対照群の動物では神経筋接合部が完全に機能していると考えられるため、この結果は、本手法が技術的なアーティファクトを誘発していないことを証明しています。

強直性疲労に関しては、トランスジェニックのヒラメ筋において、コントロール群よりも有意に低い値が示されました。興味深いことに、トランスジェニックのヒラメ筋は反復刺激によって著しく損傷するため、神経筋接合部の機能評価が可能な最大刺激時間は8分間となります。8分後、トランスジェニック筋に刺激を与えても、筋力はほぼゼロに近い値まで低下します。

ビデオを視聴したことで、マウスの神経筋接合部の機能およびヒラメ筋の測定方法について理解できたはずです。この手法は神経筋接合部の機能の間接的な測定に基づいているため、報告された欠損が形態学的変化によるものか生化学的変化によるものかを判断することはできません。一方で、このアプローチは、これらの侵害が神経伝達信号の最終的な機能に影響を与えるかどうかを評価するための不可欠な方法となります。

最後に、このプロトコルの提案は、病理学的疾患にしばしば関与する別の筋肉である横隔膜の神経筋接合部の機能を測定するためにも容易に応用可能です。