Name: 神経筋接合部機能を測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学ぶ神経筋接合部機能評価法。マウスのsoleus-sciatic神経筋標本を用いたex vivo実験で、直接刺激と神経刺激の収縮応答を比較し、神経伝達機能を間接的に測定します。神経筋疾患の研究に有用です。

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筆者らの研究室で仕事に支えられたスタンパーリアラヴェッロ ローマ、テレソン (付与なし。GGP14066)。

<ol><li>Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bdying-back%26%2334%3B+phenomenon+of+motor+neurons+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The &#34;dying-back&#34; phenomenon of motor neurons in ALS.</a> J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

上記実験のプロトコルは、測定、差別または筋肉に直接に発生した任意の機能変化間接的神経筋接合部のレベルでの理想的な方法を提供します。この手法は NMJ 機能の間接測定に基づいているので、かどうか瑕疵は形態学的変化または生化学的変化に関係を確立する使用できません。対照的に、任意の形態学的または生化学的変化が神経伝達シグナルの機能を減らしたかどうかを決定するの効果的な方法を用意します。しかし、力の測定が完了したら、筋肉お風呂から削除、消された、最適の長さで固定、埋め込み化合物に囲まれたできイソペンタンを溶解で急速凍結されました。筋肉は、免疫組織化学的、形態学的分析など-80 ° C 以降の評価のために格納できます。
我々 はここで提案する手法は、初めて NMJ と筋肉の機能を特徴づけるいくつかのパラメーターの測定を組み合わせた実験的テスト プロトコルに基づいています。3 つの重要なポイントは、この手法には、信頼性の高い結果が得られますを確認します。
まず、骨格筋切除は比較的一般的な手法では今、余分な注意が必要、神経を筋肉をそのままに...

神経筋接合部 (NMJ) は、筋線維の運動終板と運動ニューロンの軸索の端末間の接続によって形成される化学シナプスです。略記は、筋肉と神経との間の通信が高齢化や筋萎縮性側索硬化症 (ALS) が発生すると、障害に重要な役割を再生する示されています。筋肉や神経は、双方向の方法1,2通信、筋肉奇形とは切り離して NMJ 欠陥を測定することができるという、physiopathological の相互作用に新たな洞察があります。確かに、この機能の評価は、形態や生化学的変化を減らす神経伝達機能を伝達するかどうかを評価するために役立つことがあります。
神経刺激と同じ筋に、膜の直接刺激によって誘発される応答による筋収縮反応の比較は NMJ 機能の間接測定として提案されています。確かに、膜刺激パスによって神経伝達シグナル、以来 2 つの収縮応答の違いと思われる略記で変更します。このアプローチをラット3,4,5,6、7、広く提案されており、またマウス モデル8,9,10、11,12に関する情報を収集するために使用します。
ここでは、私たちは消費税し、2 つの筋の準備、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔の準備をテストする手順の詳細に説明します。特注を使用してソフトウェア、考案した NMJ と筋肉の両方の機能を特徴付けるいくつかの測定を組み合わせた連続的なテスト プロトコルそれにより筋肉の別々 に NMJ 損傷の包括的な評価を降伏します。特に、収縮力と筋の動態、直接力周波数曲線, 神経刺激、発砲とテタヌス周波数と intratetanic 疲労7の両方の神経伝達障害13プロトコルを測定します。

<table><tbody><tr><td>デュアルモードレバーシステム&nbsp;</td><td>オーロラ・サイエンティフィック社</td><td>300B</td><td>アクチュエータ/トランスデューサ</td></tr>ー <tr><td>ハイパワーバイフェーズスティミュレーター&nbsp;</td><td>オーロラ・サイエンティフィック社</td><td>701B</td><td>パルススティミュレータ(神経)</td></tr><tr><td>ハイパワーバイフェーズスティミュレータ&nbsp;</td><td>オーロラ・サイエンティフィック社</td><td>701C</td><td>パルス刺激装置(筋肉)</td></tr><tr><td>In vitro Muscle Apparatus&nbsp;</td><td>オーロラ・サイエンティフィック社</td><td>800A</td><td></td></tr><tr><td>準備ティッシュバス</td><td>Radnoti</td><td>158400</td><td></td></tr><tr><td>モノポーラ吸引電極</td><td>AMシステム</td><td>573000</td>自家製<td>リファレンス&nbsp;</td></tr><tr><td>オシロスコープ&nbsp;</td><td>テクトロニクス</td><td>TDS2014</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ 800</td><td></td></tr><tr><td>冷光照明&nbsp;</td><td>フォトニックオプティクス</td><td>PL 3000</td><td></td></tr><tr><td>アクイジションボード</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>NI PCIe-6353</td><td></td></tr><tr><td>端子台</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>NI 2110</td><td></td></tr><tr><td>パーソナルコンピュータ</td><td>AMD Phenom II x4 970</td><td></td><td>プロセッサ 3.50 Ghz Windows 7</td></tr><tr><td>LabView 2012ソフトウェア</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クレブスリンガー重炭酸塩バッファ&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>K4002&nbsp;</td><td>生理学的バッファー</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウムCaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>無水、粉末、&ge;97%</td></tr><tr><td>バッファーHEPES</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>H3375</td><td>&ge;99.5% (滴定)</td></tr><tr><td>ディッシュ 60mm x 15mm</td><td>ファルコン</td><td>353004</td><td>ポリスチレン</td></tr><tr><td>シリコーン</td><td>シルガード&nbsp;</td><td>184シリコーン&nbsp;</td><td>エラストマーキット&nbsp; 0.5Kg。</td></tr><tr><td>サーモスタット</td><td>Dennerle</td><td>DigitalDuomat 1200</td><td></td></tr><tr><td>ポンプ</td><td>Newa Mini</td><td>MN 606</td><td>水族館用</td></tr><tr><td>耐熱性 サーモケーブル</td><td>ラッキー 爬虫類</td><td>61403-1</td><td>50/60Hz 50W</td></tr><tr><td>バケツ</td><td>任意の 10 リットル</td><td></td><td>ポリプロピレン</td></tr><tr><td>O2 + 5%CO2</td><td>siad</td><td></td><td>混合ガス</td></tr><tr><td>#5 鉗子&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-20</td><td>2アイテム</td></tr><tr><td>スプリングハサミ - 8 mm ブレード</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15024-10</td><td>神経切除</td></tr><tr><td>シャープハサミ&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>14059-11</td><td>筋肉除去</td></tr>繊細な<tr><td>はさみ</td><td>ワグ</td><td>ナー02.06.32</td><td>動物の</td></tr><tr><td>学生のメスのハンドル#3</td><td>ファインサイエンスツールの外側&nbsp;</td><td>91003-12&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>メスブレード #10</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>メスブレード #11</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンワイヤー&オスラッシュ;0.16 mm</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

神経筋接合部機能を測定

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

神経筋接合部 (NMJ) 機能は運動ニューロンと筋肉の間の通信障害、加齢、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの病気を勉強して極めて重要な役割を果たしています。ここで述べる NMJ 機能を電気刺激の 2 つのタイプを組み合わせることで測定するために使用することができます実験的プロトコル: 筋膜刺激と神経を通して刺激を直接します。これらの 2 つの異なる刺激に対する筋反応の比較は、筋肉の機能低下につながる略記で潜在的な変化の機能レベルで定義する助けることができます。
Ex vivo準備はよく統制された研究に適しています。ここで筋肉と NMJ 機能ヒラメ坐骨神経の準備のため、ダイヤフラム横隔神経の準備のためのいくつかのパラメーターを測定するための集中的なプロトコルについて述べる。プロトコルは約 60 分を持続し、カスタムメイドによる間断なく行われている収縮動態特性、筋肉や神経の刺激の力周波数の関係と 2 つパラメーター NMJ 機能に固有すなわち神経伝達障害と intratetanic の疲労を測定するソフトウェア。この方法論は、SOD1G93Aトランスジェニック マウス、普遍的突然変異体の抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) を染色 ALS の実験モデルを用いたヒラメ筋と横隔膜筋の準備で損害を検出する使用されました。

我々 が説明されたプロトコルでは、いくつかの神経筋疾患や老化サルコペニア機能神経について説明します。かどうか (その場合は、どのレベルで) は、このプロトコルを使用することができます筋肉の変化がそれ自体筋肉または神経筋伝達で発生する選択の変更によるものです。下図のデータは、我々 グループの18、20疾患の末期で筋萎縮性側索硬化症の SOD1G93Aトランスジェニック マウス モデルの実施による前の仕事の結果です。G93A SOD1 のトランスジェニック マウスでは、突然変異体の抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) 普遍的染色します。図 3 と 4 は、dF/dt とヒラメ坐骨神経 (左) およびダイヤフラム横隔神経 (右) 準備テタヌス力値を示します。これらの結果は、厳密に筋肉自体に関連するものではなく NMJ に関連している遺伝子の筋肉の機能的な欠陥を検出するここで提案する手法の能力を発揮します。確かに、dF/d...

神経筋接合部 (NMJ) の機能評価は、筋肉と神経の間の通信に不可欠な情報を提供できます。ここで使用して 2 つの異なる筋神経剤、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔 NMJ と筋肉の両方の機能を総合的に評価するためのプロトコルについて述べる。

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

この手順の全体的な目的は、ex vivo実験アプローチを用いて神経筋接合部の機能を研究することです。これは、筋肉の膜への直接刺激と、神経を介した刺激という2つの方法で筋肉神経標本を刺激することによって達成されます。膜刺激では神経伝達シグナリングをバイパスするため、2つの収縮反応の間に生じる差異は、神経筋接合部の機能の間接的な測定値として考えることができます。ここでは、ヒラメ筋および坐骨神経標本を用いた本の手順について説明します。筋肉を神経と共に摘出し、灌流組織浴に配置します。これを張力および長さ制御装置に固定し、筋肉と平行に白金電極の一対を配置します。次に、ガラス製吸引電極を切断した神経端の近くまで移動させます。その後、神経筋接合部と筋肉の両方の機能を徹底的に評価するために、包括的な検査プロトコルを適用します。筋肉と神経の間の機能的結合により、両方の部位および生存している2つの分画についての結論が得られます。2つの組織が接する最初の領域には、通常、圧着したような形態を示す神経筋接合部が存在します。しかし、いくつかの病理学的条件下では、筋肉と神経の間の機能的な相互作用が著しく損なわれ、神経筋接合部は複雑な形態学的組織を失います。本手順の全体的な目的は、ex vivoの実験的アプローチを用いて、神経筋接合部の機能を研究することです。これは、2つの方法で筋肉神経標本を刺激することによって行われます。一つは筋膜を直接刺激する方法、もう一つは神経を刺激して筋肉の特性を分析する方法です。循環式恒温水槽の電源を入れ、温度を30°Cに調整してください。バスにKrebs-Ringer溶液を満たします。0.4 barの混合ガスをoxitube経由でバス内に流します。アクチュエータ・トランスデューサーと2台のパルス刺激装置の電源を入れます。膜刺激の電流値を300 million pairに、神経刺激の電流値を5 million pairに設定します。頚椎脱骨によりマウスを安楽死させた後、脚部の皮膚を取り除きます。次にアキレス腱を切断し、腱をしっかりとクランプしながら、腓腹筋とヒラメ筋を一緒に上方へ引き上げます。ヒラメ筋の近位腱を露出させた後、その上のふくらはぎ全体を切除し、速やかにサンプルを実体顕微鏡下の組織浴に設置します。ピンセットを用いてヒラメ筋の近位腱をしっかりと固定し、ゆっくりと引っ張って坐骨神経の支配領域を露出させます。神経が露出したら、周囲の組織を除去し、神経を約5 mm露出させます。次に、精巧な鋏を用いて神経を慎重に切断します。アキレス腱を切断して、ヒラメ筋を腓腹筋から分離し、筋肉と神経の摘出を完了させます。これで、筋肉・神経標本を試験装置に取り付ける準備が整いました。ナイロン糸の末端に引き抜き結びを作り、アキレス腱に巻き付けて締め付けます。近位側の腱を固定クランプで挟み、ナイロン糸を力変換器のレバーアームに結び付けます。その後、筋肉を溶液中で平衡状態にします。初期の最適長を決定するために、クリープ荷重値を緩やかに変化させながら、一連の単一パルスで筋肉を刺激します。収縮力が最大となったときが最適長です。吸引電極を筋肉の近くに配置し、神経を引き込みます。次に、パルス電流値を緩やかに変化させながら、一連の単発パルスで筋肉を刺激します。神経を介して刺激した際に筋肉によって生成される収縮力は、膜上で刺激した際に測定された値と同等であるはずです。最適な電流値が決定したら、電極から神経を出し、数回の電流パルスを印加します。以前に選択した電流値が過剰な場合、吸引電極を通じて供給される電流パルスが浴液を介して電流を伝導し、筋肉の収縮を誘発します。自作のソフトウェアを用いて、ヒラメ筋神経筋接合部の機能性を研究するための自動試験プロトコルを考案しました。このプロトコルは約65分間で構成され、4つの異なるパートに分かれています。第一部では、筋肉に4回の単一パルス刺激を与えます。そのうち2回は直接刺激し、2回は神経を介して刺激します。その後、収縮反応から、ピーク到達時間、半弛緩時間、力微分の最大値、および収縮力を測定します。第2部では、筋肉に20 hertzから強直周波数である80 hertzまでの一連のパルス列による刺激を与えます。これにより、神経刺激と直接刺激の両方について、力-周波数曲線（force-frequency curves）を算出します。プロトコルの第3部および第4部では、神経伝達不全と強直内疲労を測定するため、筋肉に2つの疲労パラダイムを適用します。これらの疲労パラダイムでは、まず膜に1回のパルス列を送り、続いて神経を介して14回のパルス列を送り、筋肉を連続的に刺激します。この一連のシーケンスを20回繰り返します。最初のパラダイムは35 hertzの発火周波数で実施されます。2回目は80 Hzの強直周波数で行います。神経伝達の不全は、活動電位伝播の外部ブロック、伝達物質放出の減少、および接合部疲労能における膜興奮性の低下に関連しており、疲労の進展において重要な役割を果たすと考えられています。神経筋接合部疲労能のもう一つの側面は、単一の強直性収縮中に筋力が維持される能力の指標であり、高周波疲労を反映する強直内疲労によって明確に示されます。プロトコルの最後に、アナログキャリパーと精密天秤を用いて筋肉の正味の長さと重量を測定し、筋肉の横断面積を算出します。筋萎縮性側索硬化症のSOD1トランスジェニックマウスモデルを用いた研究により、この手法の有用性が強調されています。実際、トランスジェニックマウスのヒラメ筋では、直接刺激時の力微分および強直力（tetanic force）の両方において収縮反応の低下が認められ、神経を介して刺激した場合にはさらに顕著な低下が認められます。例えば強直性張力に関して、これらの実験では、筋肉の収縮能が損傷の25%を占め、さらに45%が神経伝達の欠損に関連していることが示されました。もう一つの興味深い点は、対照群の筋肉において、直接刺激または間接刺激による差が認められなかったことです。対照群の動物では神経筋接合部が完全に機能していると考えられるため、この結果は、本手法が技術的なアーティファクトを誘発していないことを証明しています。強直性疲労に関しては、トランスジェニックのヒラメ筋において、コントロール群よりも有意に低い値が示されました。興味深いことに、トランスジェニックのヒラメ筋は反復刺激によって著しく損傷するため、神経筋接合部の機能評価が可能な最大刺激時間は8分間となります。8分後、トランスジェニック筋に刺激を与えても、筋力はほぼゼロに近い値まで低下します。ビデオを視聴したことで、マウスの神経筋接合部の機能およびヒラメ筋の測定方法について理解できたはずです。この手法は神経筋接合部の機能の間接的な測定に基づいているため、報告された欠損が形態学的変化によるものか生化学的変化によるものかを判断することはできません。一方で、このアプローチは、これらの侵害が神経伝達信号の最終的な機能に影響を与えるかどうかを評価するための不可欠な方法となります。最後に、このプロトコルの提案は、病理学的疾患にしばしば関与する別の筋肉である横隔膜の神経筋接合部の機能を測定するためにも容易に応用可能です。

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JoVE Journal

Neuroscience

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神経筋接合成分を正確に検出する能力は、病理学的または発達的プロセスのために、そのアーキテクチャの変更を評価する上で非常に重要です。ここでは、定量的測定を行うために使用できる全マウント神経筋接合部の高品質画像を得るための簡単な方法の完全な説明を提示する。...

全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖

ヒトが誘導した多能性幹細胞由来の運動ニューロンを、機能的に活性な神経筋接合の形成をもたらすヒトの一次メソアンジオ芽細胞由来筋膜と共培養することにより、市販の微小流体デバイスにおけるヒト運動ユニットを生成する方法を説明する。...

マイクロ流体デバイスにおける機能性神経筋接合を有するヒト運動ユニットの生成

このプロトコルは、SMAおよびColQ関連のCMSのマウスモデルの病理学的変化を定量化するために使用される共焦点顕微鏡とSTED顕微鏡の組み合わせによる神経筋接合部の形態測定分析の方法を説明しています。...

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

我々は、ヒト工学的骨格筋組織および光遺伝学的運動ニューロンを用いて神経筋接合機能を特徴付けるための、再現可能で自動化された、偏りのないイメージングシステムについて記載する。このシステムは、経時的な神経筋接続性の機能的定量化を可能にし、神経毒および重症筋無力症患者血清によって引き起こされる神経筋機能の低下を検出する。...

ヒト神経筋接合部の光遺伝学的モデルの工学と特徴付け

このプロトコールは、異なるバイオマーカー、すなわち、ニューロフィラメント200、小胞アセチルコリントランスポーター、α-バンガロトキシン、およびS100を有する蛍光免疫組織化学を用いて、ラット内側腓腹筋におけるシナプス前末端、シナプス後部受容体、およびシナプス周囲シュワン細胞間の空間的相関を調べる方法を示す。...

ラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化

この研究では、げっ歯類モデルにおける神経筋接合部(NMJ)伝達の in vivo 測定を可能にする洗練された単繊維筋電図(SFEMG)プロトコルを示します。ラット腓腹筋のNMJ伝達変動と機能不全を定量化できるように、SFEMG技術への段階的なアプローチが説明されています。...

げっ歯類モデルにおける神経筋接合部伝達を評価するための刺激単繊維筋電図法 (SFEMG)

学ぶ神経筋接合部機能評価法。マウスのsoleus-sciatic神経筋標本を用いたex vivo実験で、直接刺激と神経刺激の収縮応答を比較し、神経伝達機能を間接的に測定します。神経筋疾患の研究に有用です。

神経筋接合部機能を測定

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