神経筋接合部機能を測定

この手順の全体的な目標は、ex vivo 実験的アプローチによって神経筋接合部の機能を研究することです。これは、筋肉の神経の準備を、筋肉の膜に直接刺激する方法と神経を介して刺激することによって達成されます。膜刺激は神経伝達シグナル伝達をバイパスするため、2つの収縮応答の違いは、神経筋接合機能の間接的な測定と見なすことができます。

ここでは、ヒラメ筋坐骨神経の準備におけるこの手順を紹介します。筋肉は神経と一緒に解剖され、灌流組織浴に入れられます。これは、力と長さのコントローラーに固定され、白金の電極ペアが筋肉と平行に配置されます。

次に、ガラス吸引電極を神経の切断端に近づけます。次に、包括的なテストプロトコルを適用して、神経筋接合部と筋肉機能の両方を徹底的に評価します。筋肉と神経の間の機能的なつながりは、部分的な派閥と生き残った2つの派閥の両方にとっての結論です。

2つの組織のそれぞれのレベルの最初の領域では、通常、形態のような圧力を示すこれらの神経筋接合部を通信します。それにもかかわらず、いくつかの病理学的状態では、筋肉と神経の間で相互作用する機能が著しく損なわれ、神経筋接合部は複雑な形態学的組織を失います。私たちの手順の全体的な目標は、ex vivo 実験的アプローチを使用して神経筋接合部の機能を研究することです。

これは、2つの方法で筋肉神経の準備を刺激することによって達成されます。1つは筋肉膜を直接刺激する方法、もう1つは神経を刺激して筋肉の特性を分析する方法です。循環ウォーターバスをオンにし、温度を摂氏30度に調整します。

お風呂にクレブスリンガー溶液を入れます。Oポイント4バールのガス混合物が酸素管を通って浴に流れるようにします。アクチュエータトランスデューサーと2つのパルス刺激装置をオンにします。

電流値を、膜刺激の場合は3億ペア、神経刺激の場合は500万ペアに設定します。頸部脱臼によってマウスを犠牲にした後、脚から皮膚を取り除きます。次に、アキレス腱を切断し、腓腹筋をしっかりと固定しながら、腓腹筋とヒラメ筋を一緒に上に引っ張ります。

ヒラメ筋の近位腱が露出したら、その上のふくらはぎ全体を切断し、サンプルを実体顕微鏡の下にある準備組織浴にすばやく置きます。一対の鉗子を使用して、ヒラメ筋の近位腱をしっかりと固定し、そっと引っ張って坐骨神経支配を露出させます。神経支配が露出したら、周囲の組織を取り除き、神経の約5ミリメートル

次に、細いハサミを使用して神経を慎重に切断します。アキレス腱を切断してヒラメ筋を腓腹筋から分離することにより、筋肉、神経の切除を完了します。これで、筋肉、神経の準備を試験装置に取り付ける準備が整いました。

ナイロン糸の端にスリップノットを作り、アキレス腱の周りで締めます。固定クランプ内に近位腱をクランプし、力変換器のレバーアームにナイロン線を結びます。溶液中で筋肉が平衡化するのを待ちます。

初期の最適な長さを決定するには、クリープ負荷値を穏やかに変えながら、一連の単一パルスで筋肉を刺激します。最適な長さは、twitch forceが最大の場合に得られます。吸引電極を筋肉の近くに置き、神経を引き込みます。

そして、パルス電流の値を緩やかに変えながら、一連のシングルパルスで筋肉を刺激します。神経を介して筋肉が刺激されたときに筋肉が生成するけいれん力は、膜上で筋肉を刺激するときに測定された値と等しくなければなりません。最適な電流値が決定されたら、神経を電極から押し出し、いくつかの電流パルスを送達します。

以前に選択した電流の量が多すぎると、吸引電極を介して供給される電流パルスが、バスに電流を流すことにより筋肉の収縮を誘発します。自家製のソフトウェアを使用して、ヒラメ筋神経筋接合部の機能を研究するための自動テストプロトコルを考案しました。プロトコルは約65分続き、4つの異なる部分で構成されています。

最初の部分では、筋肉は4つの単一パルスで刺激されます。2つは直接、2つは神経を介して送達されました。次に、ピークまでの時間、半緩和時間、力微分の最大値、および単収縮力が、単収縮応答から測定されます。

第2部では、破傷風の周波数である20ヘルツから80ヘルツまでの一連のパルス列で筋肉が刺激されます。力を計算するために、神経刺激と直接刺激の両方の周波数曲線を描きます。プロトコルの 3 番目と 4 番目の部分では、筋肉に 2 つの疲労パラダイムを適用して、神経伝達障害と破傷風内疲労を測定します。

これらの疲労パラダイムでは、筋肉は継続的に刺激され、1つのパルス列がメンブレンに送達され、続いて14のパルス列が神経を介して送達されます。シーケンス全体が 20 回繰り返されます。最初のパラダイムは、35ヘルツの発射周波数で提供されます。

80ヘルツの破傷風の周波数で2番目。神経伝達障害は、活動電位伝播の外部ブロック、送信機の放出の減少、接合疲労能力のプレート興奮性の低下に関連しているため、疲労の発症に重要な役割を果たすと考えられています。神経筋接合部疲労能力の別の側面は、単一の破傷風収縮中に力を維持する筋肉の能力の推定値であり、高周波疲労を反映するイントラテタニック疲労によって明確に表現されます。

プロトコルの最後に、アナログキャリパーと精密スケールを使用して正味の筋肉の長さと重量を測定し、筋肉の断面積を計算します。筋萎縮性側索硬化症のSOD1トランスジェニックマウスモデルに関する研究は、この方法論の可能性を強調しています。実際、トランスジェニックヒラメ筋は、直接刺激された場合、力の微分力と破傷風力の両方に対して収縮反応が減少し、神経を介して刺激された場合はさらに大きな減少をもたらします。

例えば、破傷風荷重に関しては、これらの実験では、筋肉の収縮性が損傷の25%を占め、さらに45%が神経伝達の欠陥に関連していることが示されています。もう一つ興味深いのは、直接的または間接的に刺激を受けたときに、制御筋に違いがないことです。この知見は、この方法論が、制御動物において神経筋接合部が完全に機能することが期待されるため、技術的なアーティファクトを誘発しないことを証明している。

戦略疲労に関しては、結果は、トランスジェニックヒラメ筋の値が対照筋よりも有意に低いことを示しています。興味深いことに、トランスジェニックヒラメ筋は反復刺激によって著しく損傷を受けるため、最大8分間の刺激時間で神経筋接合部の機能を評価できます。8分後、トランスジェニック筋肉は刺激を受けると、力のほぼゼロ値に戻ります。

ビデオを見た後、マウスの神経筋接合機能とヒラメ筋を測定する方法を理解できるはずです。この技術は、神経筋接合部機能の間接的な測定に基づいているため、報告された欠陥が形態学的または生化学的変化に関連している場合は、これを行うことはできません。一方、このアプローチは、これらの攻撃性が神経伝達シグナルのユーザー機能に影響を与えるかどうかを評価するための重要な方法を表しています。

最後に、プロトコルの提案は、病理学的疾患にしばしば関与する別の筋肉である横隔膜の神経筋接合部機能を測定するために容易に採用できます。