同時光刺激とビデオ録画による機能的神経筋接合部の評価

、コラーゲンが埋め込まれた筋肉組織を含む筋肉室がチャンバーの柱の上に支えられているバイオリアクターから始めます。

ニューロスフィアチャネルには、コラーゲンマトリックスにニューロスフィアが含まれています。神経圏の運動ニューロンは、光に敏感なチャネルを発現します。

ニューロンを刺激して突起を拡張する神経成長因子を含む分化培地を追加します。

定期的に培地を交換して、ニューロンが筋肉組織に向かって継続的に伸び、神経筋接合部を形成します。

カメラと青色光源を備えた顕微鏡でバイオリアクターを観察します。

青色光パルスを印加してニューロンの光に敏感なチャネルを開き、媒体からのイオンが流れ、ニューロンを刺激して電気信号を生成します。

これらの信号は、ニューロンの投射を介して神経筋接合部に移動し、電気信号を筋肉組織に伝達します。

ビデオを同時に録画します。筋線維の段階的な収縮は、機能的な神経筋接合部の発達を確認します。

ミリリットルあたり3ミリグラムのコラーゲンIと可溶化基底膜マトリックスの4対1の混合物を調製します。次に、この新しく調製したコラーゲン混合物に筋芽細胞を再懸濁します。

次に、この細胞コラーゲン懸濁液をバイオリアクターの各筋肉室に15マイクロリットル加え、ピペットチップを使用して懸濁液を両方の柱に広げるようにします。細胞ゲル混合物を摂氏37度で30分間重合させます。次に、各バイオリアクターウェルに450マイクロリットルの筋強直性増殖培地を充填します。

運動ニューロン分化の11日目に、細胞と培地を50ミリリットルのチューブに移し、神経球を5分間底に沈殿させます。上清を吸引し、脳由来神経栄養因子1ミリリットルあたり20ナノグラム、グリア細胞由来神経栄養因子1ミリリットルあたり10ナノグラムを添加した15ミリリットルの運動ニューロン懸濁液培地に細胞を再懸濁します。

分化プロトコルの14日目に、運動ニューロンをプラットフォームにシードします。1ミリリットルあたり2ミリグラムのコラーゲンIと可溶化基底膜マトリックスの4対1のゲル混合物を調製します。400ナノメートルの細胞ストレーナーを使用して大きな神経球を選択し、調製したゲル混合物に再懸濁します。

、リザーバーと神経圏から培地をよく吸引します。次に、15マイクロリットルのゲル混合物を神経球チャネルに加えます。10マイクロリットルのピペットに10マイクロリットルのゲルを入れ、神経球を1つ選びます。神経球を神経球チャネルに堆積させ、チャンバー内にあることを確認します。次に、神経球が沈着したら残りのゲルを放出しながら、ピペットをゆっくりと持ち上げます。

ゲルを摂氏37度で30分間重合させます。次に、450マイクロリットルのNbActiv4を1ミリリットルあたり20ナノグラムの脳由来神経栄養因子と10ナノグラム/ミリリットルのグリア細胞由来神経栄養因子をリザーバーに加えます。

イメージングには、科学的な相補型金属酸化物半導体カメラソフトウェアを備えた倒立蛍光顕微鏡を使用します。ビニングを2×2、露出を20ミリ秒、ローリングシャッターオン、読み出しレートを540メガヘルツ、ダイナミックレンジを12ビット、ゲイン1、センサーモードをオーバーラップに設定します。顕微鏡の2倍対物レンズを使用して微小組織を画像化し、ライブセルチャンバーを顕微鏡ステージに取り付けます。

神経支配された骨格組織を含む関心領域を選択して、ファイルサイズと処理時間を最小限に抑えます。次に、サンプルとイメージング対物レンズの間に594ナノメートルのロングパスエミッションフィルターを配置して、カメラからの青色光パルスを除去します。次に、4つのバイオリアクターを含む長方形の4ウェルプレートを生細胞チャンバーに入れます。次に、[ライブビュー]をクリックし、中央に配置し、目的のROIで画像に焦点を合わせます。

GitHubフォルダからカスタムマクロコードをダウンロードして、ステージ位置、Arduinoボード、ビデオ取得を制御します。次に、出力ムービーをday_tissuegroup_tissuename_experimentとして設定します。ND2です。ステージ上に設定した目的のX座標とY座標でマクロコードを実行し、毎秒50フレームで1,700フレームの高速タイムラプス

イメージング後、培地を交換し、サンプルをインキュベーターに戻します。組織の疲労を避けるために、画像取得セッションの間に少なくとも24時間の間隔を空けてください。