Name: 原発性前立腺細胞の分化のための迅速なフィルターを挿入ベースの3D培養システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶフィルター挿入ベースの3D培養システムを用いた原発性前立腺上皮細胞の迅速な分化とバイオ分子単離の手法。前立腺がん研究における生物学的に関連性の高いin vitroモデル構築に貢献します。

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本研究では、T32（CA 9686から18）と、TL1（TL1TR001431）ポスドクの訓練助成賞（LT）、DOD PC140268（CA）、W81XWH-13-1-0327（CA）TR000102-04（CA）と同様でサポートされていましたU01 PAR-12から095（クマー）とP30 CA051008-21（ウェイナー）。サンプルの固定、切片と染色はロンバルディ総合がんセンター組織学および組織共有リソースで行いました。私たちは便利な議論のためのリチャード・シュレーゲルに感謝します。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立がん研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

3D細胞培養インサートシステムの1.設立<ol><li> 6ウェルプレート（ 図1A）にダウン逆方向（フィルタ側まで）で2ポリカーボネート細胞培養インサートを配置します。 </li><li>インサートの底面側に水中0.1％ゼラチンの薄い層を適用し、無菌性を維持するために、生物学的安全キャビネットの中で（10〜20分間）乾燥させます。 </li><li>手順を繰り返し1.2インサートに0.1％ゼラチンの3アプリケーションの合計2回以上。 注：ゼラチンコーティングは、チャンバ間の拡散を制限するのに役立ちます。 </li><li>培養フラスコを洗浄するためのPBS 5 mLを加え、標準的な培養条件から主CRCを収集します。 <ol><li> 37℃で5分間、0.25％トリプシン-EDTA（T-75のためのT-25及び2mLのために1 ml）を用いて細胞をトリプシン処理。細胞を穏やかに取り除くのを助けるために、フラスコの側面をタップします。その後トリプシン反応を停止し、完全DMEMを5ml加えることにより細胞を収集するために進みます。 </li><li>集めます<html> 15 mLチューブ内の細胞。 4℃、188×gでチューブを遠心し、自動細胞カウンターまたは血球計数器を使用してカウントされます。 </li><li>メディア（CM）を条件付け250μL60万CRCを再懸濁し、適切に配向（フィルタ側を下に）カルチャーインサート（ 図1B）に追加します。これは、内部チャンバと呼ばれています。 注：CMは、照射J2細胞によって条件付けF-メディアであると以前に7、8、9、11を説明したように10μmのY-27632が含まれています。 </li></ol></li><li> 6ウェルプレートの外側室にCMの2ミリリットルを適用し、（少なくとも18時間）、37℃で一晩インキュベートします。 </li><li>慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットを用いて内部チャンバにCMを削除して、ゆっくりと完全になるまで1 mLのピペットで内室に分化培地（DM）を追加します。細胞層を乱さないように注意してください。 </li></ol>3Dの文化のル &quot;&gt; 2。メンテナンス<ol><li>毎日文化を確認してください。 図2に示すように、健康な細胞が出現します。 </li><li>外側チャンバ内のCM毎日または細胞の代謝に応じて一日おきに変更します。 </li><li>内部チャンバのメディアは、色（黄色）を変更する場合は、慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットで内部フィルター室にメディアを削除します。 </li><li>吸引先端を有する外側6ウェルプレート室でメディアを吸引除去します。 </li><li> 1 mLのピペットを使用して、ゆっくりと完全になるまで、内側室に新鮮なDMを適用します。こすりまたはその他の細胞層を落とさないように注意してください。 </li><li>新鮮なCM 2mLで外側室でメディアを交換してください。 </li><li> 2週間の文化を維持し、目的の生体分子の分離のための処理に進みます。 注：6ウェルプレートの各行は、6インサート（ 図1B）の合計は、DNのための十分な細胞を取得するために、実験ごとに処理する必要があります分析のために、RNAまたはタンパク質。 </li><li>外側チャンバ内を吸引メディアとは、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）ですすいでください。 </li><li>慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットで内側チャンバからメディアを取り出し、500μLのPBSを追加します。スクレイピングまたはそうでなければ、膜上の細胞を乱すことは避けてください。 </li><li>吸引除去し、PBS外側チャンバから、慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットで内部チャンバーからPBSを削除します。 PBSを除去した後、以下に詳述する適切なアプリケーションに直接進みます。膜を乾燥させないでください。アプリケーションを開始する準備ができるまで、文化はPBSで簡単に維持することができます。 </li></ol> 3.ペレットバンキング用フィルターの処理<ol><li>各内部チャンバ100μL、0.25％トリプシン-EDTAを加え、37℃で5分間インキュベートします。 </li><li> （puncを避ける上下にピペッティングとしながら、200μLピペットで膜表面上の細胞をこすり/簡単に言えば、慎重に攪拌）膜をチューリング。 37℃で1分間インキュベートします。 </li><li>フィルターを洗浄するために静かに上下最初の内室とピペットにCMの250μLを追加します。 </li><li>転送は、同じメディア条件が含まれており、上下にピペッティングを繰り返し、隣接するフィルタ室に細胞を再懸濁しました。 </li><li>単一条件の挿入ごとに、この手順を繰り返します。収集し、1.5 mL遠心チューブに細胞を移します。 </li><li>残りの細胞を収集するために、CMの追加の100-200μLで各内側チャンバを洗い流します。ステップ3.5で1.5 mLの遠心分離管に追加します。 </li><li> 5分間、4℃で微量で423×gで細胞をスピン。 </li><li>上清を吸引除去し、1000年μLPBSで一度細胞ペレットを洗浄します。 </li><li> 5分間、4℃で微量で423×gで再びスピン。 </li><li>吸引し、PBS、後で使用するために-80℃で凍結。 </li></ol> 4. RNAまたはDNAの単離のためのフィルタの処理<ol&gt; <li>内室にグアニジンチオシアネート - フェノール - クロロホルムまたは類似の抽出試薬の200μLを加え、簡単に上下にピペッティングすることにより、膜表面上の細胞を攪拌。 </li><li> 外室の乾燥を用いて室温で5分間抽出試薬でインキュベートします。 <ol><li>フィルタは、挿入から解離することができるように、上下に抽出溶液をピペットで解離し、フィルター膜を洗浄してください。 6ウェルプレートを傾けると、残留液体を吸引することにより、可能な限り抽出試薬をできるだけ多く収集します。 </li></ol></li><li>精製およびDNA、RNAまたはタンパク質の回収のための製造業者のプロトコルに従ってください。 </li></ol> 5.タンパク質単離のためのフィルタの処理<ol><li>氷上で6ウェルプレートにフィルタインサートを置きます。内側チャンバーに、10μLの1mMフッ化ナトリウム（NaF）、1mMのバナジン酸ナトリウム（NAV）、100mMのdithiothreを補充したタンパク質の溶解緩衝液を追加ITOL（DTT）および抗プロテアーゼカクテルの100μL。 </li><li> /攪拌上下にピペッティングしながら20μLピペットで膜表面上の細胞をこすり取ります。溶解緩衝液中に気泡を発生させることは避けてください。 </li><li> 10分間氷上でフィルターインサートで6ウェルプレートをインキュベートします。 </li><li>掻き繰り返し、次いで溶解緩衝液で膜表面をすすぎます。 </li><li> 6インサートからの溶解物を収集し、氷上で1.5 mL遠心管に移します。 </li><li>溶解緩衝液の追加の10μLと第一の膜をすすぎ、次のフィルタに転送します。 </li><li>すべての挿入を繰り返しステップ5.6、任意の残留溶解緩衝液を収集し、1.5 mLのチューブ（ステップ5.5）に追加します。 </li><li>さらに5分間氷上でサンプルをインキュベートします。 </li><li> 4℃で15分間、最高速度（テーブルトップ遠心分離機で16873×gで）でスピン。 </li><li>新鮮な1.5 mLのチューブにピペット溶解液上清。 </li><li>タンパク質濃度やSTOの分析に進みます-80℃での溶解物の再。 </li></ol> 6. H＆Eの処理及び免疫染色<ol><li>内側と外側のチャンバーに500μL、10％NBF（中性緩衝ホルマリン）の1 mLを加え、4℃で一晩インキュベートしましょう。 </li><li>外側室からNBFを吸引し、1 mLのヒドロキシエチルアガロース（HEA）1.5 mL遠心に処理ゲルを追加します。ゆっくりと低消費電力を使用して電子レンジでアガロースを融解し、アガロースが溶けるまで、10から20秒のパルスを繰り返しました。 </li><li>使用する準備ができるまでの凝固を防ぐために、37℃の温浴中でHEAを保管してください。 </li><li>内側チャンバからNBFを外し、内部チャンバに溶融HEAの25μLを適用し、アガロースは、2-5分間固化することができます。 </li><li>ウェット2発泡組織学パッドを10％NBF中と包埋カセットに一つのパッドを配置する（ 図3Dを参照）。 </li><li>インサートの底面側からフィルタを獲得するために（非常に鋭い、微尖った刃を持っている）＃11ブレードメスを使用しますチャンバーは、部分的にプラスチック製のインサート室からそれを解放します。 </li><li>ペトリ皿にNBFの少量（100〜200μL）を配置し、NBF（ 図3A）で部分的に外れフィルタを浸します。 </li><li> ＃10ブレードメスで、静かに完全に挿入バレル（ 図3B）からフィルタを取り除くために、インサートチャンバーの内側から、フィルタの中央押し付けます。まだバレルに取り付けられているフィルタの任意の部分がある場合には、メスを用いてそれを切断します。 </li><li> ＃10ブレードメス（ 図3C）で半分にHEAコーティングされたフィルタをカットします。 </li><li>ステップ6.4（ 図3D）で作製した組織学カセットにフォームパッドの上にフィルタの各半分を置きます。 </li><li>フィルタを挟んで、カセットに2つ目の10％NBF浸したスポンジを追加します。 </li><li>スナップNBFカセット、場所を密封し、一晩インキュベートします。 </li><li>切片や染色などのためにパラフィンブロックへのプロセスフィルター以前12記載。 </li></ol>

<ol><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li>
<li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li>
<li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li>
<li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li>
<li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li>
<li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26910887">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li>
<li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor%28s%29+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li>
<li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868(2015).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

初代細胞株は癌研究のための重要かつ急速に発展プラットフォームです。カルチャーインサートベースの3D培養系は、2週間の期間内に原発性前立腺のCRCの分化をサポートしています。 CRCフィルタ法は、前立腺の研究のための新しい媒体スループット法を表します。既存のマウスPDXモデルは時間がかかり、非常に高価であり、PDXサンプルの多くは、研究者によって開始実験とその有用性を制限し、培養物中で成長させることができません。また、PDXの確立の成功率が大きく13を変化しながら、CRC方法は、細胞株3の確立の成功率が高いです。我々は、我々のシステムは、Rスポンジンベースの前立腺オルガノイドアプローチに相補的であるように考慮します。しかしながら、原発性前立腺癌からオルガノイドの確立に関しての成功の欠如は14報告されています。さらに、メディア、設立の方法、そして、のCRCのメンテナンスは、Rスポンジンベースの前立腺オルガノイドのアプローチよりも大幅に簡素化されています。追加の利点として、CRCは確立さ直接分子比較の...

個人にパーソナライズされた癌治療の同定および使用は、癌研究における第一の目標です。最近、新しいアプローチが開発されており、潜在的に識別し、パーソナライズされた治療法をテストし、両方の方法を提供し、初代細胞培養の確立でより容易にするために可能にします。例えば、Rスポンジンベース前立腺オルガノイドアプローチ1は、セルの条件付き再プログラミング（CRC）法が、商業外マトリクス（ 例えば 、マトリゲル）中の正常および転移性前立腺癌細胞の三次元（3D）培養を可能にしますジョージタウン2、3で開発は、より標準的な2D培養条件を利用します。具体的には、Rhoキナーゼ阻害剤（Y-27632）、照射J2マウス線維芽細胞フィーダー細胞の組み合わせは、ケラチノサイトのCRC 2の不定培養をもたらします。 CRC方法であります極めて堅牢、初代細胞株が正常に確立し、前立腺癌および他の多くの正常および悪性上皮組織3から無期限に維持したまま。重要なことは、私たちのCRC技術は、以前の薬物治療の数を失敗していた患者における再発性呼吸器乳頭腫症のための病因の基礎の迅速な同定を可能にしました。また、正常および腫瘍由来のCRCを使用して、FDAの成功同定は、薬物、ボリノスタットは、初期の組織生検の2週間以内に行われた承認されました。患者は、その病気4の成功した治療の結果、ボリノスタット上に置きました。 正常な前立腺は管腔、基底と希少な神経内分泌細胞5から構成されています。管腔細胞が腺の円柱上皮層を形成し、アンドロゲン受容体（AR）、ならびにサイトケラチン8と18とプロのような他の管腔マーカーを発現します状態特異的抗原（PSA）6。逆に、基底細胞が管腔層の下に局在し、サイトケラチン5およびP63が、AR 5を低レベルで発現しています。私たちは、7、8、9、その他10が正常に前臨床メカニズムの薬剤感受性調査で前立腺CRCを使用しています。標準2D組織培養条件下で増殖させた場合しかし、これらの細胞は、完全に10シグナリング ARに係合することができません。免疫不全マウスの腎被膜下に置かれたとき重要なのは、CRCは許容する環境に置かれたとき、前立腺CRCがその系譜コミットメントを維持していることを示す正常前立腺腺のアーキテクチャと機能を取り戻しました。ここで説明したフィルタインサート基づく細胞培養系の開発が急速に（2週間）のために証明さbと前立腺のCRCのインビトロ分化を可能にします増加したARとAR標的遺伝子の発現と同様には、P63のレベルを減少させたY。 使用されるフィルタインサートは、哺乳動物細胞の培養を支持することができるポリカーボネート膜（孔径0.4μm）を含みます。システムは、開発され、正常および悪性前立腺のCRC、6ウェル培養皿とフィルタインサートを利用します。 J2セル11によって調整細胞培養培地を上部チャンバーに下部チャンバと前立腺分化培地中に置かれます。本明細書に記載の技術は、個別化医療の目標と一致して2週間の時間枠内に前立腺管腔細胞分化をサポートしています。文化の総合的、分子遺伝学および細胞プロファイリングを可能にする方法論を開発することも不可欠でした。フィルター表面から放出された細胞からのDNA、RNAおよびタンパク質を単離するための手法が開発され、正確な反復サンプル処理のための合理化されています。フィナLLY、埋め込みを有効にするフィルタを削除切片とH＆E、免疫組織化学および免疫蛍光染色のために必要な方法論は、完全に記載されています。

<table><tbody><tr><td>Corning Costar Snapwell Culture Inserts</td><td>Corning</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Inserts</td><td>Millipore</td><td>PIHP01250</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 Well</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン0.1% 水中</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Saftey Scapel 10 Blade</td><td>Integra Miltex</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>滅菌標準メス 11 ブレード</td><td>インテグラ ミルテック</td>ス <td>4411</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 溶解および抽出バッファー</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>フッ化</td>ナトリウム <td>フィッシュサー サイエンティフィック</td><td>S299-100</td><td></td></tr><tr><td>バナジウム酸</td>ナトリウム <td>フィッシュサー サイエンティフィック</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>3483123</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル(AEBSF、アプロチニン、ベスタチン、E-64、ロイペプチン、ペプスタチンA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>0.25%トリプシン-EDTA(1x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>25030081&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F-12栄養素ミックスメディア</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632二塩酸塩ロック阻害剤</td><td>エンツォ</td><td>ALX-270-333-M025</td><td></td></tr>ヒ<tr><td>ドロコルチゾン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PHG0315</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>コレラ毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3012</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264550</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Histogel Specimen Processing Gel (ヒドロキシエチルアガロース(HEA))</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>非接着性ドレッシング</td><td>Telfa</td><td>KDL2132Z</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養ディッシュ</td><td>Sigma</td><td>SIAL0167</td><td></td></tr><tr><td>HISTOSETTE II 組織処理・包埋カセット</td><td>Crystalgen</td><td>CG-M492</td><td></td></tr></tbody></table>

原発性前立腺細胞の分化のための迅速なフィルターを挿入ベースの3d培養システム

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

条件付きで再プログラムされた細胞（CRCが）初代培養細胞と患者由来細胞株の大規模な「生きたバイオバンク」を開発する能力のための持続可能な方法を提供します。上皮細胞の多くのタイプのために、様々な3次元（3D）培養アプローチは、改善された分化状態をサポートすることが記載されています。 CRCが、それらが分離されている、そこから組織への系統コミットメントを保持するが、それらは通常の2次元（2D）培養条件下で増殖させた場合起源の組織に関連分化マーカーの多くを発現しません。前立腺癌の研究のための患者由来のCRCのアプリケーションを強化するために、3D培養形式は、正常および腫瘍由来の前立腺上皮細胞の両方の急速な（2週間合計）管腔細胞分化を可能にするように定義されています。ここで、フィルタインサートベースのフォーマットは、正常および悪性の前立腺のCRCの両方の培養および分化のために記載されています。デ免疫組織化学および免疫蛍光染色のための細胞の収集および処理に必要な手順の尾説明が提供されます。総称して、プライマリCRCラインと組み合わせて説明した3D培養フォーマットは、生物試料ベースの前立腺研究のためのスループットモデルシステムを高するための重要な中長期を提供します。

細胞培養インサートに基づくシステムは、管腔細胞分化をサポートしている前立腺のCRCの3D培養物を作製するための比較的単純かつ迅速な方法です。システムの概略フィルタインサートの下面にゼラチンコーティングの適用を強調し（ 図1A）が示されています。インサートはゼラチンのみの適用のために覆されています。 図1Bにフィルタが培養のための適切な向きです。透明セルの挿入を使用して、健康的な3D前立腺CRC文化の代表画像は（10X）（ 図2）に示されています。実証健康のCRCの密な階層化は、設立後典型的であり、標準的な光学顕微鏡を用いて可視化することができます。最初の確立時に、この方法は、所定の細胞株およびその適切な添付ファイルやラと互換性があることを確認するために形成された細胞の層を可視化することが重要です細胞のイエリングが発生しています。 上記のようにHEAはイ...

ここでは、初代前立腺上皮細胞の三次元培養とその後の管腔分化を支援する迅速なin vitroシステムを確立する方法を提示します。

原発性前立腺細胞の分化のための迅速なフィルターを挿入ベースの3D培養システム

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

患者由来の初代細胞を用いたこのフィルターインサートベースの3D培養システムの全体的な目的は、前立腺がん研究において、より生物学的に妥当なin vitroモデルシステムを構築することです。ヒト初代細胞を使用することで、この手法は前立腺の発生生物学および前立腺がんにおける重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、分化した初代前立腺細胞を構築するための比較的迅速なin vitro手法であるとともに、RNA、DNA、タンパク質などのバイオ分子を迅速に単離できることです。フィルターインサート上の細胞を組織学的に処理したり、RNAおよびタンパク質を回収したりする操作は、非常に繊細であり、時間的な制約があるため、これらの手法を視覚的に示すことは極めて重要です。バイオセーフティキャビネット内でのチャンバー間の拡散を抑えるために、インサートの底面に0.1% gelatinを薄く塗布し、乾燥させてください。この手順をさらに2回繰り返します。次に、ゼラチンコートしたインサートの内側チャンバーに細胞を播種し、最大2週間まで培養します。2週間後、培養したフィルターインサートを、以下に詳述する適切なダウンストリームアプリケーションのいずれかに直接適用します。この手順を開始するには、外側チャンバーからPBSを吸引し、内側チャンバーから慎重にPBSを除去します。培養したインサートは、操作の準備が整うまで短時間であればPBS中で保持できますが、メンブレンを乾燥させないようにしてください。次に、各インナーチャンバーに0.25% Trypsin EDTAを100 µLずつ加えます。その後、37 °Cで5分間インキュベートします。その後、200 µL ピペットでピペッティングしながら、メンブレン表面の細胞を短時間で慎重に掻き取ります。次に、37 °C で1分間インキュベートします。1分後、最初のインナーチャンバーに 250 µL のコンディショニング培地を加え、優しくピペッティングしてフィルターを洗浄します。この転送後、同じ培地条件を含む隣のフィルターチャンバーに再懸濁した細胞を移し、ピペッティングを繰り返します。単一条件の各インサートに対してこの手順を繰り返してください。その後、細胞を回収し、1.5 milliliter centrifuge tubeに転送します。各インナーチャンバーをさらに100〜200 µLの条件化培地でリンスして、残っている細胞を回収し、1.5 mL centrifuge tubeに加えます。次に、マイクロ遠心分離機を用いて、4 °Cで5分間、細胞を遠心分離します。その後、上清を吸引し、細胞ペレットを1,000 µLのPBSで1回洗浄します。細胞を再びマイクロ遠心機を用いて4°Cで5分間遠心分離します。5分後、PBSを吸引除去し、サンプルを-80°Cで冷凍保存して後で使用します。この手順では、200 µLのグアニジニウムチオシアネート・フェノール・クロロホルムまたは同様の抽出試薬を内部チャンバーに加え、ピペッティングによってメンブレン表面の細胞を軽く撹拌します。次に、細胞を抽出試薬中で室温で5分間インキュベートし、外側のチャンバーは乾燥したままにします。その後、抽出液をピペッティングしてフィルターメンブレンを洗浄します。6ウェルプレートを傾け、残液を吸引することで、抽出試薬を可能な限り回収します。フィルターがインサートから外れる可能性があることに注意してください。外れたフィルターメンブレンが付着している場合は、それを洗浄してください。その後、抽出試薬を可能な限り回収し、DNA、RNA、またはタンパク質の精製および回収について、メーカーのプロトコルに従ってください。グアニジニウムチオシアネートで細胞とフィルターを洗浄する際は、過剰な撹拌によりRNAの品質が低下する可能性があるため、注意して行ってください。フィルターインサートからタンパク質を分離するには、フィルターインサートを氷上の6ウェルプレートに配置します。その後、内部チャンバーに10 µLのタンパク質溶解バッファーを加えます。20 µL ピペットを使用して、ピペッティングを行いながらメンブレン表面の細胞を撹拌し、掻き取ります。その際、溶解バッファー内に気泡が発生しないように注意してください。その後、フィルターインサートを入れた6ウェルプレートを氷上で10分間インキュベートします。再度掻き取りを行い、その後メンブレン表面を溶解バッファーで洗浄します。6つのインサートからライセートを回収し、氷上の1.5 milliliter centrifuge tubeに移します。次に、1枚目のメンブレンをさらに10 microlitersの溶解バッファーでリンスし、次のフィルターに移します。特定の実験条件におけるすべてのインサートに対してこの手順を繰り返し、残存する溶解バッファー溶液を回収して1.5 milliliter tubeに加えます。サンプルを氷上でさらに5分間インキュベートします。その後、4°Cで最大速度にて15分間遠心分離します。完了後、ライセートを新しい1.5 mmチューブにピペッティングして移します。その後、タンパク質濃度の分析に進むか、ライセートを-80°Cで保存します。この手順では、内室と外室にそれぞれ500 µLおよび1 mLの10% NBFを加えてください。それらを4°Cで一晩インキュベートします。翌日、外腔からNBFを吸引し、1.5 mL centrifuge tubeに1 mLのHEA処理用ゲルを加えます。電子レンジの低出力設定で10秒間ずつのパルス状に加熱し、アガロースが溶解するまでゆっくりと融解させます。使用するまで凝固を防ぐため、HEAを37 °Cの温浴で保持してください。次に、インナーチャンバーからNBFを除去します。溶融したHEAを25 microliters インナーチャンバーに塗布し、アガロースが凝固するまで2〜5分間待ちます。その後、2枚のフォーム組織学用パッドを10%NBFで湿らせ、そのうち1枚を包埋カセットに入れます。HistoGelを用いてフィルターインサート上の細胞層の完全性を保護することは、組織切片作成のために細胞層を損なわずに保存するための重要なステップです。その後、11番メスを用いてプラスチックインサートチャンバーの底面からフィルターに切り込みを入れ、部分的に切り離します。シャーレに100-200 µLのNBFを入れ、部分的に切り離したフィルターをNBFに浸します。10番のメスを用いて、インサートチャンバーの内側からフィルターの中央を軽く押し、フィルターをインサートバレルから完全に切り離します。フィルターの一部がまだバレルに付着している場合は、メスで切り離してください。その後、HEAコートフィルターを半分に切断します。フィルターの各半分を、準備した組織 cassettes 内のフォームパッドの上に置きます。次に、2つ目の10%NBFに浸したスポンジをカセットに加え、フィルターを挟みます。最後に、カセットをスナップシールで閉じます。NBFに入れ、一晩インキュベートします。この明視野像は、多孔性膜の上に多層の細胞層があることを示しています。核、P63、およびアンドロゲン受容体の個別の蛍光画像と、これら3つの蛍光マーカーすべてを統合したマージ像を示します。最後に、明視野像と免疫蛍光染色のオーバーレイ合成画像を示し、細胞およびフィルターに対する蛍光シグナルの局在を確認します。ここでは、無傷の前立腺の管状上皮層と比較した、フィルターインサートの断面画像を示しています。この手法を習得すれば、2週間で完了でき、適切に実施すれば、最終的な細胞とフィルターインサートまたは目的のバイオ分子の単離に30分未満で済みます。この手順を行う際は、細胞層や下層のフィルターに損傷を与えないよう、フィルターインサートの取り扱いに常に注意することが重要です。本手順に続き、パスウェイ解析やがん細胞に関するさらなる疑問を解消するために、ウェスタンブロッティング、RNAマイクロアレイ、プロテオーム解析などの他の手法を実施することが可能です。この技術は、前立腺がん分野の研究者が、初代前立腺細胞を用いて前立腺の生物学的な特性および前立腺がんの基礎メカニズムをより深く探究するための道を開く一助となるでしょう。このビデオを視聴することで、この3D培養システムを用いて培養した初代前立腺細胞を適切にセットアップし、回収する方法について深く理解することができます。

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