の胚性血管新生の可視化と定量分析ツメガエル
May 25th, 2017
このプロトコルは、脈管構造を視覚化し、 Xenopus tropicalisにおけるその複雑性を定量化する蛍光ベースの方法を実証する。インビボでの心臓血管発達を研究するために、遺伝的および/または薬理学的操作の後、胚の拍動する心臓に蛍光色素を注入した後、数分後に血管を撮像することができる。
この手順の全体的な目標は、Xenopus tropicalisオタマジャクシの血管系を視覚化することです。この方法は、血管新生がどのように制御されているかなど、心血管生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、無傷のウェルタイプの胚の血管を単純な蛍光色素注入で視覚化できることです。
まず、マイクロローダーを使用して、先を細くしたガラスマイクロピペットに約5マイクロリットルの透明なdiIアセチル化LDL溶液を充填し、沈殿した粒子がロードされないように注意します。解剖顕微鏡下で、No.55鉗子の細いペアを使用してピペットの先端をクリップし、アップロードされた複合体の容量を調整し、圧力制御注入システムが注入ごとに約5ナノリットルの溶液を排出するように設定します。次に、ピペットチップを0.04%MS-222に0.1倍改質Barthの生理食塩水またはMBSに浸し、カスタムメイドのSylgard型に入れます。
次に、Xenopus tropicalis胚をシルガード型に移し、背びれ刺激に対する反応がない完全な鎮静を確認します。解剖顕微鏡の下で、胚の腹側を上にして、わずかに斜めの位置で型のV字型のくぼみにロードします。2本の0.1ミリメートルの極小ピンをピンホルダーにしっかりとはめ込み、1本のピンを使用して、目に見えて脈動しているはずの心臓の上の皮膚に穴を開けます。
心臓と皮膚の間の穴にピンを挿入し、心臓に穴を開けずに挿入した先端を切開する領域内に配置します。次に、挿入したピンに対して2番目のピンをこすりつけて直線的な切開を行い、両方のピンを一緒に使用して切開部を緩やかに広げ、心臓を露出させます。DiIアセチル化LDL溶液を注入するには、ガラスピペットチップを心臓に挿入し、50〜60ナノリットルのDiIアセチル化LDLを約10回の駆出パルスで注入します。
すべての色素溶液が送達されたら、心臓がまだ鼓動していることを確認し、胚を0.1X MBSを含む新しいシャーレに移します。5〜10分後、オタマジャクシは麻酔から回復し、動き始めるはずです。適切な数の胚が注入された後、蛍光顕微鏡で正しく標識された麻酔された胚を視覚的にスクリーニングし、他の臓器が標識されている動物を廃棄します。
標識が不十分な胚は、再度注入することができます。次に、正しく標識された胚の画像をキャプチャします。血管のより完全なイメージングのために、共焦点顕微鏡による視覚化のために、光から保護された室温で4%パラホルムアルデヒドに再麻酔をかけた胚を1時間固定します。
十分な量のジIアセチル化LDLを心臓に注入すると、後部枢機卿静脈(PCV)が蛍光顕微鏡ですぐに見えるはずです。体節間静脈 (ISV) は、ステージ 36 から始まり、ステージ 40 から 41 の前後で終わる前波から後波で PCV から背側に出現し、ステージ 43 の周りで軽く分岐します。PCVとISVは、厳格な発達制御下にあるステレオタイプの血管新生パターンで成長します。
興味深いことに、アンチセンスモルファリノによるTIE-2シグナル伝達のノックダウンは、ISVの長さと複雑さを減少させますが、TIE-2の構成的に活性な形態の発現は、過剰なISV分岐を誘導します。ISVの複雑さを評価するために静脈複雑性指数を計算でき、レンダリングされたパスを生成して、胚のXenopus tropicalis vasculatureの全体的なアーキテクチャを視覚化できます。元のプロトコルは、LevinとColicsによってXenopus laevisの使用について説明し、Xenopus tropicalisに適応させました。
このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1時間で完了することができます。この手順の前に、遺伝的および薬理学的操作を実行して、どの遺伝子とシグナル伝達経路が血管発達を調節するかなどの追加の質問に答えることができます。この手順を使用すると、標識された血管系を無傷の動物でリアルタイムに画像化でき、血管発達のダイナミクスを調査するための強力なツールを提供します。
このビデオを見れば、Xenopus tropicalisオタマジャクシの心臓にdiIアセチルLDLを注入して血管系を視覚化する方法をよく理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、Xenopus tropicalisの血管系を視覚化し、その複雑さを定量化する蛍光ベースの方法を示しています。この技術により、胚の心臓に蛍光染料を注入した直後に血管を撮像することができ、生体内での心血管の発達の研究を促進します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 心血管生物学
- 血管新生
- 発生生物学
背景
- Xenopus tropicalisは脊椎動物の発生を研究するためのモデル生物です。
- 血管の発達を理解することは、様々な疾患への洞察を得るために重要です。
- 蛍光イメージング技術は生物学的構造の視覚化を向上させます。
- この方法により、血管の変化をリアルタイムで観察することができます。
研究目的
- Xenopus tropicalisのオタマジャクシの血管系を視覚化する。
- 血管新生の調節を調査する。
- 心血管の発達を研究するための簡単で効果的な方法を提供する。
使用された方法
- 胚の心臓への蛍光染料の注入。
- 正確な染料の注入のためのマイクロローダーと先細ガラスマイクロピペットの使用。
- 解剖用顕微鏡下での血管の視覚化。
- 血管系への影響を研究するための遺伝的および薬理学的操作の適用。
主な結果
- 完全な胚での血管の成功的な視覚化。
- 撮像を通じて達成された血管の複雑さの定量化。
- 心血管の発達のダイナミクスに関する洞察。
- 蛍光染料注入法の有効性の実証。
結論
- このプロトコルは血管の発達を研究するための信頼できる方法を提供します。
- 蛍光イメージングはリアルタイム分析のための強力なツールです。
- このアプローチは心血管生物学のさらなる研究を促進することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of vascular complexity in a vertebrate model, supporting early-stage target validation in angiogenesis pathways. By providing quantitative readouts of vessel sprouting and branching, it facilitates mechanistic de-risking of vascular targets before committing to lead identification campaigns. The Xenopus tropicalis system offers a disease-relevant platform for assessing angiogenic phenotypes with predictive confidence in preclinical cardiovascular research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding angiogenic regulators such as TIE-2 signaling through direct observation of vessel sprouting patterns.
- Operational Value: Provides a rapid, one-week workflow to assess gene or pathway impact on vascular development without requiring genetically engineered models.
- Predictive Value: Quantifiable outputs like the Vein Complexity Index support objective assessment of target modulation effects for portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible vascular labeling compatible with downstream imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Enables measurement of intersomitic vein length and branching complexity as dose-responsive readouts for compound screening.
- Scalability: Simple dye injection and imaging procedure supports medium-throughput evaluation of pharmacological or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models stereotypic angiogenesis in Xenopus tropicalis, offering insight into human vascular development pathways.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation through conserved angiogenic mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Allows rapid testing of pathway modulators to clarify target biology before investing in mammalian model studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing vascular phenotype data that informs go/no-go decisions in angiogenesis-focused programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to quantifiable changes in vascular architecture.
- Screening: Delivers reproducible, imaging-based readouts suitable for evaluating compound effects on angiogenic sprouting.
- Analytics: Provides quantitative vascular complexity metrics that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Leverages conserved angiogenesis mechanisms to support continuity from embryonic models to mammalian vascular systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis target projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, quantitative visualization of vascular networks.
- Operational Value: Standardizes vascular assessment via simple dye injection and reproducible imaging, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of vascular targets, reducing late-stage failure risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of angiogenesis modifiers based on quantitative phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for embryo handling and cardiac microinjection.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure for vessel visualization and image capture.
- Necessitates standardization of embryo staging and injection timing for consistent vascular labeling.
- Involves adaptation considerations when extending findings to other model systems or human relevance contexts.
- Practical limitations include reliance on embryonic accessibility and the need for careful optimization of dye concentration to avoid non-specific labeling.
