の胚性血管新生の可視化と定量分析

この手順の全体的な目的は、アフリカツメガエル（Xenopus tropicalis）のオタマジャクシの血管系を可視化することです。この手法は、血管新生がどのように調節されているかなど、心血管生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、単純な蛍光染料の注入により、完全なウェルタイプ胚内の血管を可視化できることです。

まず、マイクロローダーを使用して、沈殿粒子が混入しないように注意しながら、テーパーガラスマイクロピペットに約5 µLの透明なdiIアセチル化LDL溶液を満たします。実体顕微鏡下で、55番の精密ピンセットを用いてピペットの先端をクリップし、充填した複合物の量を調整し、圧力制御注入システムの設定を1回あたりの注入量約5 nLに調整します。その後、特製のSylgard製モールド内で、0.1X modified Barth's saline（MBS）に含まれる0.04% MS-222溶液にピペット先端を浸します。

次に、Xenopus tropicalis の胚を Sylgard モールドに移し、背びれへの刺激に反応がないことを確認して、完全に鎮静されていることを確かめます。解剖顕微鏡下で、胚の腹側を上にして、モールドの V 字型のくぼみにわずかに斜めに配置します。2 本の 0.1 millimeter の minutian ピンをピンホルダーにしっかりと固定し、そのうちの 1 本を用いて、拍動が見える心臓上の皮膚を穿刺します。

心臓と皮膚の間の隙間にある穴にピンを挿入し、心臓を突き刺さないように注意しながら、切開予定部位に挿入端を配置します。次に、挿入したピンに2本目のピンを擦り合わせて直線的な切開を行い、両方のピンを用いて切開部をゆっくりと広げ、心臓を露出させます。DiIアセチル化LDL溶液を注入するために、ガラスピペットのチップを心臓に挿入し、DiIアセチル化LDL 50〜60 nano litersを約10回の排出パルスで注入します。

染料溶液をすべて注入した後、心臓がまだ拍動していることを確認し、胚を0.1X MBSを含む新しいペトリ皿に移します。5分から10分後には、オタマジャクシが麻酔から回復し、動き始めます。十分な数の胚に注入が行われた後、蛍光顕微鏡下で正しく標識された麻酔状態の胚を視覚的にスクリーニングし、他の臓器が標識されている個体は廃棄します。

ラベル付けが不十分な胚には、再度注入を行うことができます。その後、正しくラベル付けされた胚の画像をキャプチャします。血管をより詳細にイメージングする場合、共焦点顕微鏡で可視化するために、再度麻酔をかけた胚を4%パラホルムアルデヒド中で室温、遮光下にて1時間固定します。

十分な量のdiIアセチル化LDLを心臓に注入すると、後主静脈（PCV）が蛍光顕微鏡下ですぐに観察できるはずです。節間静脈（ISV）は、ステージ36から始まり、ステージ40から41頃に終わる前方から後方への波のようにPCVから背側に現れ、ステージ43頃には軽く分岐します。PCVとISVは、厳密な発生制御下にある定型的な血管新生パターンに従って成長します。

興味深いことに、アンチセンスモルフォリノによるTIE-2シグナリングのノックダウンは、ISVの長さと複雑性を減少させますが、一方で構成的に活性化させたTIE-2の発現は、過剰なISVの分岐を誘導します。ISVの複雑性を評価するために静脈複雑性指数（Vein Complexity Index）を算出することができ、また、胚期のXenopus tropicalisの血管系の全体的な構造を可視化するためにレンダリングパスを生成することが可能です。元のプロトコルはLevinとColicsによってXenopus laevisを用いて記述されており、本研究ではそれをXenopus tropicalis用に適応させました。

この手法を習得すれば、適切に実施することで1時間で完了させることができます。この手順の前に、遺伝学的および薬理学的な操作を行うことで、どの遺伝子やシグナル伝達経路が血管形成を制御しているかといった、さらなる疑問を検討することが可能です。本手法を用いることで、ラベル化された血管系を個体内でリアルタイムにイメージングでき、血管形成のダイナミクスを調査するための強力なツールとなります。

このビデオを視聴することで、Xenopus tropicalisのオタマジャクシの心臓にdiIアセチル化LDLを注入し、その血管系を可視化する方法について十分に理解できるはずです。