動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース
2017年7月11日
我々は、動的細胞突起の長さに沿った相対的なタンパク質濃度の半自動追跡のためのソフトウェアソリューションを提示する。
この画像解析ソフトウェアの全体的な目標は、フィロポディアル長全体にわたる突起ダイナミクスと相対タンパク質濃度の並行解析です。この方法は、細胞生物学における重要な問題、特に糸状仮足の伸長と収縮に関与する個々のタンパク質を理解するのに非常に役立ちます。この技術の主な利点は、提供される適応形状追跡アルゴリズムにより、突起ダイナミクスと空間的に分解されたタンパク質局在の定量的評価が可能になることです。
まず、ニューロン、HeLaまたはCOS細胞を、テキストプロトコルに詳述されているように、補充された培地で培養します。40%のコンフルエント度に達したら、製造元の指示に従ってトランスベクション試薬を使用して、選択したコンストラクトで細胞をトランスベクターします。トランスベクションした細胞をインキュベーター内で摂氏37度、CO2濃度5%で15〜18時間保管します。
インキュベーション後、20ミリモルのHEPESを含む摂氏37度の予熱培地で細胞培養チャンバーを最大90%充填し、画像取得中の蒸発によるpHと浸透圧の変化を低減します。蓋を密閉するには、蓋の内側に真空グリースを薄く塗り、トランスベクトした細胞を含む培養チャンバーにそっと押し付けます。おそらく、画像分析で最も重要な部分は画質です。
私たちが注意しなければならないことの1つは、信号対雑音比が4以上でなければならず、カメラの露光時間とレーザーの強度と力を調整することで、フレームレートが1ヘルツ以上になるようにすることです。60倍または100倍の対物レンズを使用し、ピクセルの曲げがない顕微鏡を使用して画像を取得します。1ヘルツ以上の取得率を使用して、フィロポディアルダイナミクスを追跡します。
焦点が合っていないアーチファクトを最小限に抑えるために、バジル膜の近くでフィロポディアルを画像化します。スムーズなトラッキングを確保するには、カメラの露光時間とレーザー強度を調整して、信号対雑音比が4を超えるようにします。これが完了したら、画像取得を開始します。
テキストプロトコルで説明されているように、画像の前処理に続いて、画像分析に必要なすべてのファイルを含むzipフォルダーをダウンロードして画像を読み込みます。ファイルを解凍して作業フォルダにコピーします。インストールが完了したら、filopodiaAnalysisM3.figという名前のファイルを開いてグラフィカルユーザーインターフェイスを起動します。
保存した個々のタンパク質のスタックTIFFファイルをグラフィカルユーザーインターフェースまたはGUIでロードします。プロテインAのボタン1B、プロテインBのボタン1C、オプションでプロテインCの1Dボタンを使用して、1Aをクリックしてタンパク質チャネルから細胞の重ね合わせ画像を作成します。次に、[2A]をクリックして最初のフレームを割り当て、[2B]をクリックして最後のフレームを解析に割り当てます。
必要に応じて、2H ボタンを使用して、関心のあるフィロポディウムを含む関心領域または ROI を切り抜きます。2Iボタンを使用して画像を回転させるか、フリーハンドの描画ツールである2Jを使用して不要な領域を削除します。スライダーをフレームごとに2Cずつ動かして、品質管理を行い、映画全体を通してフィロポディウムがはっきりと見えるかどうかを確認します。
トレースを生成するには、まず、GUIウィンドウ1の3Aボタンをクリックして、GUIウィンドウ2を開きます。GUIウィンドウ2の4ボタンをクリックし、1Aをクリックした後、GUIウィンドウ1で生成した重ね合わせセル本体の質量を生成する。実験データセットのセグメント数、スキャン幅、スキャン半径などのパラメータの最適化に時間を費やすことをお勧めします。
ウィンドウ番号2のスライダーを動かして、フィロポディアルチップが最初に表示される場所を確認します。次に、ボタン5をクリックすると、カーソルが表示されます。カーソルを使用して、フィロポディアルチップの距離を測定するベースを選択します。
フィロポディアの先端が最初に現れるフレームに続きます。次に、6Cを使用して、糸状仮足が曲がるしきい値の長さを選択します。次に、ボックス6Aで糸状足の形状を近似するために使用されるセグメントの数を指定します。
ノードを 6B に配置するための水平スキャナーとして機能するスキャン幅を指定します。ボックス 6D のスキャン半径は、観察されたフレーム間チップ変位よりも約 50% 大きい値を使用します。次に、ボックス 6E で曲げ角度を指定します。
GUIウィンドウ2でボックスの履歴トレースをチェックして、後で参照できるように追跡プロトコル全体を保存し、[追跡と分析]ボタンをクリックして追跡を開始します。空間時間解析では、8B で表されるボックスを選択し、その後に目的のタンパク質チャネルを選択します。8Aをクリックすると、以前に生成されたトレースを使用して、フィロポディアル長に沿ったタンパク質追跡が開始されます。
レシオメトリックタンパク質解析では、9Bまたは9Cのチェックボックスをオンにし、9Aボタンをクリックすると、空間時間レシオメトリックプロットが得られます。フィロポディアルチップ解析を行うには、8Fチェックボックスにチェックを入れ、8Gと8Hを使用してベースからのチップ長と閾値長さを指定します。プッシュボタンをクリックして、データをdynamics.xlsxという名前のExcelファイルに保存します。
次に、「analysis protein intensities」をクリックして、フィロポディアルチップのタンパク質強度のトレースを生成し、レシオメトリック分析のために保存します。9Dまたは9Eを使用して分析する目的の比率をクリックします。最後に、比較ボタン9Aをクリックして、レシオメトリックデータを生成します。
糸状アクチンのマーカーを赤で、細胞質参照を緑でトランスヴェクしたCOS細胞の分析により、アクチンに富むフィロポディアル突起が明らかになりました。時系列は、アクチンに富む糸状突起が急速に伸縮することを示しています。画像解析ソフトウェアを使用して、個々の糸状仮足を追跡しました。
画像解析ソフトウェアは、個々の糸状仮足の成長速度と収縮速度に加えて、糸状体の伸展を確実に追跡し、ケミグラフは細胞質基準に正規化されたアクチンの濃度も示します。この手法を適切に使用すれば、糸状仮足に沿った突起ダイナミクスと空間的に分解されたタンパク質濃度の定量分析が可能になります。手順を試みるときは、取得速度を覚えておき、個々の画像を飽和させないようにしながら、信号対雑音比を4より大きく保つことが重要です。
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概要
この記事では、細胞の動的な突起に沿ったタンパク質濃度の半自動追跡のためのソフトウェアソリューションを紹介します。このソフトウェアは、突起のダイナミクスとタンパク質の局在化の並行分析を可能にし、細胞生物学の理解を深めます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 画像分析
- タンパク質ダイナミクス
背景
- 突起のダイナミクスを理解することは細胞生物学において重要です。
- フィロポディアは細胞の伸展と縮小において重要な役割を果たします。
- タンパク質局在化の定量的評価は細胞プロセスの研究に不可欠です。
- 適応型形状追跡アルゴリズムは分析の精度を向上させることができます。
研究の目的
- フィロポディアに沿ったタンパク質濃度を分析する手法を開発すること。
- 突起ダイナミクスに関与するタンパク質の理解を深めること。
- 細胞挙動を研究する研究者のためのツールを提供すること。
使用方法
- 培養ニューロン、HeLa、またはCOS細胞を補充培地で培養します。
- トランスベクション試薬を使用して構築物を用いて細胞をトランスベクトします。
- トランスベクトされた細胞を37°Cと5% CO2で15-18時間インキュベートします。
- ソフトウェアを使用してタンパク質濃度と突起ダイナミクスを追跡します。
主な結果
- このソフトウェアはタンパク質局在化の定量的評価を可能にします。
- 細胞突起のダイナミクスについての洞察を提供します。
- 適応型追跡は測定の精度を向上させます。
- この方法は様々な細胞タイプに適用できます。
結論
- 開発されたソフトウェアはタンパク質ダイナミクスを研究するための貴重なツールです。
- 細胞の突起と縮小のメカニズムを理解するのに役立ちます。
- この方法は細胞生物学における将来の研究を促進する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions is critical for de-risking early discovery hypotheses related to cell migration and signaling. This semi-automated image analysis workflow enables spatially resolved, reproducible measurement of protein localization and protrusion dynamics, supporting predictive confidence in target validation. Integrating such adaptive tracking tools strengthens portfolio triage by providing robust, quantitative outputs for mechanistic studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of protein function during filopodial extension and retraction.
- Supports mechanistic de-risking by mapping spatial-temporal protein localization in live cells.
- Facilitates functional target validation through reproducible, high-content imaging data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening of modulators affecting protrusion dynamics.
- Standardizes assay conditions with defined signal-to-noise and acquisition thresholds.
- Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for comparative compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein localization data with disease-relevant cell migration models when applicable.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of migration-related targets.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in cell motility and signaling programs.
Pipeline & Workflow Integration
This software-assisted tracking method fits within the early discovery to lead identification continuum, bridging hypothesis-driven mechanistic studies and quantitative assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying protein dynamics in live-cell protrusions.
- Screening: Establishes reproducible, quantitative readouts for downstream screening workflows.
- Analytics: Generates spatial-temporal protein concentration profiles and protrusion kinetics for robust comparison.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to disease-relevant migration models when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable analytical capability for diverse protein localization and cell motility studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible image analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and mechanisms related to cell migration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and quantitative image analysis.
- Needs high-quality microscopy infrastructure with defined signal-to-noise and frame rate capabilities.
- Demands cross-team standardization of acquisition and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to various cell types exhibiting filopodia, with parameter optimization per system.
- Dependent on maintaining image quality and avoiding saturation for reliable outputs.
