動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

この画像解析ソフトウェアの全体的な目標は、フィロポディアル長全体にわたる突起ダイナミクスと相対タンパク質濃度の並行解析です。この方法は、細胞生物学における重要な問題、特に糸状仮足の伸長と収縮に関与する個々のタンパク質を理解するのに非常に役立ちます。この技術の主な利点は、提供される適応形状追跡アルゴリズムにより、突起ダイナミクスと空間的に分解されたタンパク質局在の定量的評価が可能になることです。

まず、ニューロン、HeLaまたはCOS細胞を、テキストプロトコルに詳述されているように、補充された培地で培養します。40%のコンフルエント度に達したら、製造元の指示に従ってトランスベクション試薬を使用して、選択したコンストラクトで細胞をトランスベクターします。トランスベクションした細胞をインキュベーター内で摂氏37度、CO2濃度5%で15〜18時間保管します。

インキュベーション後、20ミリモルのHEPESを含む摂氏37度の予熱培地で細胞培養チャンバーを最大90%充填し、画像取得中の蒸発によるpHと浸透圧の変化を低減します。蓋を密閉するには、蓋の内側に真空グリースを薄く塗り、トランスベクトした細胞を含む培養チャンバーにそっと押し付けます。おそらく、画像分析で最も重要な部分は画質です。

私たちが注意しなければならないことの1つは、信号対雑音比が4以上でなければならず、カメラの露光時間とレーザーの強度と力を調整することで、フレームレートが1ヘルツ以上になるようにすることです。60倍または100倍の対物レンズを使用し、ピクセルの曲げがない顕微鏡を使用して画像を取得します。1ヘルツ以上の取得率を使用して、フィロポディアルダイナミクスを追跡します。

焦点が合っていないアーチファクトを最小限に抑えるために、バジル膜の近くでフィロポディアルを画像化します。スムーズなトラッキングを確保するには、カメラの露光時間とレーザー強度を調整して、信号対雑音比が4を超えるようにします。これが完了したら、画像取得を開始します。

テキストプロトコルで説明されているように、画像の前処理に続いて、画像分析に必要なすべてのファイルを含むzipフォルダーをダウンロードして画像を読み込みます。ファイルを解凍して作業フォルダにコピーします。インストールが完了したら、filopodiaAnalysisM3.figという名前のファイルを開いてグラフィカルユーザーインターフェイスを起動します。

保存した個々のタンパク質のスタックTIFFファイルをグラフィカルユーザーインターフェースまたはGUIでロードします。プロテインAのボタン1B、プロテインBのボタン1C、オプションでプロテインCの1Dボタンを使用して、1Aをクリックしてタンパク質チャネルから細胞の重ね合わせ画像を作成します。次に、[2A]をクリックして最初のフレームを割り当て、[2B]をクリックして最後のフレームを解析に割り当てます。

必要に応じて、2H ボタンを使用して、関心のあるフィロポディウムを含む関心領域または ROI を切り抜きます。2Iボタンを使用して画像を回転させるか、フリーハンドの描画ツールである2Jを使用して不要な領域を削除します。スライダーをフレームごとに2Cずつ動かして、品質管理を行い、映画全体を通してフィロポディウムがはっきりと見えるかどうかを確認します。

トレースを生成するには、まず、GUIウィンドウ1の3Aボタンをクリックして、GUIウィンドウ2を開きます。GUIウィンドウ2の4ボタンをクリックし、1Aをクリックした後、GUIウィンドウ1で生成した重ね合わせセル本体の質量を生成する。実験データセットのセグメント数、スキャン幅、スキャン半径などのパラメータの最適化に時間を費やすことをお勧めします。

ウィンドウ番号2のスライダーを動かして、フィロポディアルチップが最初に表示される場所を確認します。次に、ボタン5をクリックすると、カーソルが表示されます。カーソルを使用して、フィロポディアルチップの距離を測定するベースを選択します。

フィロポディアの先端が最初に現れるフレームに続きます。次に、6Cを使用して、糸状仮足が曲がるしきい値の長さを選択します。次に、ボックス6Aで糸状足の形状を近似するために使用されるセグメントの数を指定します。

ノードを 6B に配置するための水平スキャナーとして機能するスキャン幅を指定します。ボックス 6D のスキャン半径は、観察されたフレーム間チップ変位よりも約 50% 大きい値を使用します。次に、ボックス 6E で曲げ角度を指定します。

GUIウィンドウ2でボックスの履歴トレースをチェックして、後で参照できるように追跡プロトコル全体を保存し、[追跡と分析]ボタンをクリックして追跡を開始します。空間時間解析では、8B で表されるボックスを選択し、その後に目的のタンパク質チャネルを選択します。8Aをクリックすると、以前に生成されたトレースを使用して、フィロポディアル長に沿ったタンパク質追跡が開始されます。

レシオメトリックタンパク質解析では、9Bまたは9Cのチェックボックスをオンにし、9Aボタンをクリックすると、空間時間レシオメトリックプロットが得られます。フィロポディアルチップ解析を行うには、8Fチェックボックスにチェックを入れ、8Gと8Hを使用してベースからのチップ長と閾値長さを指定します。プッシュボタンをクリックして、データをdynamics.xlsxという名前のExcelファイルに保存します。

次に、「analysis protein intensities」をクリックして、フィロポディアルチップのタンパク質強度のトレースを生成し、レシオメトリック分析のために保存します。9Dまたは9Eを使用して分析する目的の比率をクリックします。最後に、比較ボタン9Aをクリックして、レシオメトリックデータを生成します。

糸状アクチンのマーカーを赤で、細胞質参照を緑でトランスヴェクしたCOS細胞の分析により、アクチンに富むフィロポディアル突起が明らかになりました。時系列は、アクチンに富む糸状突起が急速に伸縮することを示しています。画像解析ソフトウェアを使用して、個々の糸状仮足を追跡しました。

画像解析ソフトウェアは、個々の糸状仮足の成長速度と収縮速度に加えて、糸状体の伸展を確実に追跡し、ケミグラフは細胞質基準に正規化されたアクチンの濃度も示します。この手法を適切に使用すれば、糸状仮足に沿った突起ダイナミクスと空間的に分解されたタンパク質濃度の定量分析が可能になります。手順を試みるときは、取得速度を覚えておき、個々の画像を飽和させないようにしながら、信号対雑音比を4より大きく保つことが重要です。