Name: 臨床応用のためのヒト尿中の3-ニトロチロシンの小型化固相抽出およびLC-MS / MS検出の統合 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぼう、小型化固相抽出とLC-MS/MSを用いてヒト尿中の3-ニトロチロシンを高感度に定量する方法。酸化ストレスバイオマーカーの臨床応用に適した迅速かつ正確な分析技術です。

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著者らは、Scott HaardとAbigail Marinackがこの作業の全般的なサポートと調整について認めてくれるだろう。

ヒト尿サンプルを含むすべての研究は、Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board（IRB）によって承認された手順に従って実施された。 1.尿試料採取およびクレアチニン（Cr）測定<ol><li>次の朝の尿サンプル5mLをca.保存まで3N HCl250μLを含む5mL輸送管Aで一晩10時間絶食させ、使用するまで-20℃で保存する。 </li><li>解凍しボルテックスする5mLの輸送尿チューブと遠心分離機（ 例えば Sorvall）（2297xg、10分）中で遠心分離する。 </li><li> 5mLの輸送管Aから2回、1mLの尿を分注する。 </li><li>尿クレアチニン法によるCrの測定26 。 </li></ol>標準、ISおよび品質管理（QC）サンプルの調製<ol><li> 0.01％HCOOH移動相A（MA）を含む水中で100μg/ mLの3-NTのストック溶液を調製し、-20℃で保存する。 </li><li>メイク100μg/ mLの3-NTストック溶液をMAで希釈することにより、100ng / mLの濃度の3-NT作動標準溶液。 </li><li>ブランクおよび二重ブランク試料とともに、3-NTを含まない0.15M HCl酸性ブランク尿で100ng / mLの作業標準液を希釈することにより、5〜2500pg / mLの標準物質を生成する。 </li><li> -20℃でMAとストアと水で100μg/ mLのにある13 C 9 -3-NTのストック溶液を調製します。 </li><li> 100μg/ mLの13 C 9 -3-NTの希釈により500 pg / mlでで動作している溶液を作るには、MAとのストック溶液です。 </li><li>酸性化されたブランク尿中の3-NT作業標準の希釈によって、LLOQ、低、中および高レベル（ すなわち 、10,25,100,500および1,250 pg / mL）をカバーする5レベルのQCサンプルを確立する。 </li></ol>固相抽出手順<ol><li>解凍し、尿サンプル、標準品およびQCサンプルをボルテックスする。 </li><li>尿サンプル、標準およびQCサンプルを追加les（各250μL）を32ウェルの清潔な2mL 96ウェル収集プレートに移した。 </li><li>二重ブランク試料ウェルを除く各ウェルに500 pg / mL IS作動液（50μL）を導入する。二重ブランク試料ウェルに0.01％HCOOH（50μL）を添加する。 </li><li> 0.1％HCOOH（250μL）を含むLC-MS / MS水を加える。 </li><li>上記の混合物を8チャンネルピペットで3回混合する。 </li><li> SPE装填までプレートを覆う。 </li><li> MCX 96ウェル抽出プレートとコレクションリザーバーを陽圧プロセッサーに置きます。 </li><li>抽出プレートを、流出するMeOH（200μL）で吸着剤に通す。 </li><li>吸着剤に2％HCOOH（200μL）を流して平衡させる。 </li><li>予め混合した各サンプルの全容積を、8チャンネルのピペットで慎重に予備条件抽出プレートにロードする。 </li><li>混合物を流れさせるために陽圧プロセッサーに低い正の圧力（ 例えば 3psi）を設定する吸収剤をゆっくりと摂取し、必要に応じて圧力を調整します。 </li><li> 2％HCOOH（200μL）を含む水を吸着剤に流してウェルを洗浄する。 </li><li>吸着剤にメタノール（200μL）を流してウェルを洗浄する。 </li><li>吸着剤に水（200μL）を流してウェルを洗浄する。 </li><li>ポジティブプレッシャープロセッサーで、正の高圧力設定（ 例えば 、40 psi）でウェルを完全に乾燥させます。 </li><li>リザーバーを清潔な2 mL 96ウェルコレクションプレートに交換します。 </li><li>抽出プレートから保持された検体およびISを溶出するために、pH 9（50μL）で25mM NH 4 OAcを適用する。 </li><li>溶出液を中和するために、5％HCOOH（50μL）を含むLC-MSピペット水。 </li><li> 8チャンネルピペットで3回ミックスし、分析のためにLC-MS / MSステーションに提出する。 </li></ol> LC-MS / MS分析<ol><li>メスシリンダーで2000mLのLC-MS水を正確に測定し、2Lボトルに移します。 </li><li> P200μLの純粋なHCOOHを上記のLC-MS水を含むボトルに入れる。 </li><li>完全に混合し、移動相A（MA）とラベルする。イニシャル、準備日、有効期限を記入してください。 </li><li> 2リットルのLC-MSメタノールボトルに入れ、開始日と有効期限のある移動相B（MB）とラベルを付けます。 </li><li>オートサンプラーの温度を4℃に設定します。 </li><li>調製したサンプルを含むコレクションプレートをオートサンプラにセットします。 </li><li>オーブンにPFPカラム（150 mm x 2.1 mm id、3μm）とガードカラムを置きます。 </li><li>オーブンの温度を30℃に設定します。 </li><li> 表1に示すLCグラジエント溶出を用いた取得法を用いて10分間平衡化する。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 時間（分） </td><td> モジュール </td><td> イベント </td><td> パラメータ </td></tr><tr><td> 0 </td><td>パンプス</td><td>ポンプBコンク。 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td>パンプス</td><td>ポンプBコンク。 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 1 </td><td>パンプス</td><td>ポンプBコンク。 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td>パンプス</td><td>ポンプBコンク。 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 4 </td><td>パンプス</td><td>ポンプBコンク。 </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 4.01 </td><td>パンプス</td><td>ポンプBコンク。 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.5 </td><td>パンプス</td><td>ポンプBコンク。 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.6 </td><td>パンプス</td><td>ポンプBコンク。 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td>コントローラ</td><td>やめる</td><td></td></tr></tbody></table> 表1： 液体クロマトグラフィーグラジエント溶出条件 <ol start="10"><li>以下を含むバッチリストを作成するスタンダード、QCおよび尿サンプル。 </li><li>調製したサンプル（12μL）の注入によりバッチを開始する。 </li></ol> 5.ピーク識別、統合、データ処理<ol><li>ソフトウェアを使用したデータの取得と処理を制御します。 </li><li>すべてのサンプルについて3-NTピークとISピークを特定し、統合します。 </li><li> 3-NTおよびISのピーク面積比対公称3-NT濃度の1 / xの重み付け係数を線形回帰することにより、3-NT定量のために10-2,500 pg / mLの範囲の標準曲線を確立する。 </li><li>標準曲線を使用してすべてのサンプルを定量する。 </li><li> QCサンプルが確立された範囲内にあるかどうかを決定する。 </li><li>検出された尿サンプルの濃度をnMまたはnmol / mmol Crの単位で最終結果に変換します。 </li></ol>

<ol><li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).</li>
<li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).</li>
<li>Baraldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Nitrotyrosine%2C+a+marker+of+nitrosative+stress%2C+is+increased+in+breath+condensate+of+allergic+asthmatic+children%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children.</a> Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).</li>
<li>Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+nitration+in+neurodegeneration%3A+Cause%2C+effect%2C+or+association%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association?</a> J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).</li>
<li>Butterfield, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+3-nitrotyrosine+in+brain+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment%3A+implications+for+the+role+of+nitration+in+the+progression+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease.</a> Brain Res. 1148, 243-248 (2007).</li>
<li>Hui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+LC-MS%2FMS+method+for+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+from+patients+receiving+on-pump+CABG+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery.</a> Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+modified+tyrosines+in+healthy+and+diabetic+human+urine+using+liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Biochem.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).</li>
<li>Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+approaches+to+the+analysis+of+3-nitrotyrosine%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine.</a> Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).</li>
<li>Ryberg, H., Caidahl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+and+mass+spectrometric+methods+for+quantitative+determination+of+3-nitrotyrosine+in+biological+samples+and+their+application+to+human+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples.</a> J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).</li>
<li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+3-nitrotyrosine+quantification+in+biological+samples%3A+the+unique+role+of+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry.</a> Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).</li>
<li>Tsikas, D., Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+and+3-nitrotyrosine%3A+strategies%2C+controversies%2C+and+our+current+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective.</a> Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).</li>
<li>Iwasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence+reagents+for+simultaneous+determination+of+hydroxylated+phenylalanine+and+nitrated+tyrosine+by+high-performance+liquid+chromatography+with+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.</a> Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).</li>
<li>Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+performance+liquid+chromatography-electrochemical+array+method+for+the+measurement+of+oxidative%2Fnitrative+changes+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine.</a> J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).</li>
<li>Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+the+synthesis+of+a+water+compatible+molecularly+imprinted+polymer+as+artificial+receptor+for+detection+of+3-nitro-L-tyrosine+in+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases.</a> Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).</li>
<li>Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic-tandem+mass+spectrometric+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+at+the+basal+state%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state.</a> Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).</li>
<li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).</li>
<li>Marvin, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+o%2Co%27-dityrosine%2C+o-nitrotyrosine%2C+and+o-tyrosine+in+cat+urine+samples+by+LC%2Felectrospray+ionization-MS%2FMS+using+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution.</a> Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).</li>
<li>Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+tyrosine%2C+phenylalanine+and+deoxyguanosine+oxidation+products+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+as+non-invasive+biomarkers+for+oxidative+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage.</a> J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).</li>
<li>Chen, H. J. C., Chiu, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+quantification+of+3-nitrotyrosine+and+3-bromotyrosine+in+human+urine+by+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).</li>
<li>Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+excreted+in+the+urine+as+biomarkers+of+nervous+system+activity%3A+validity+and+clinical+applicability%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+specific+and+sensitive+LC-MS%2FMS+method+for+quantification+of+urinary+catecholamines+and+application+in+biological+variation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-analytical+and+analytical+validations+and+clinical+applications+of+a+miniaturized%2C+simple+and+cost-effective+solid+phase+extraction+combined+with+LC-MS%2FMS+for+the+simultaneous+determination+of+catecholamines+and+metanephrines+in+spot+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples.</a> Talanta. 159, 238-247 (2016).</li>
<li>Chao, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+3-nitrotyrosine+and+3-nitro-4-hydroxyphenylacetic+acid+in+human+urine+by+online+SPE+LC-MS%2FMS+and+their+association+with+oxidative+and+methylated+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions.</a> Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).</li>
<li>Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+detection+of+nitrotyrosine+in+biological+fluids+development+of+a+clinically+translatable+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker.</a> Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00216-015-8934-5">Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).</li>
<li>Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. , Mannheim. Available from:
 <a target="_blank" href="https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html">https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html</a> 2011-2011 (2011).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mixed-mode+solid+phase+extraction+coupled+with+LC-MS%2FMS+for+the+re-evaluation+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+as+an+oxidative+stress+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker.</a> Talanta. 140, 45-51 (2015).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+approach+for+the+ultra-sensitive+determination+of+catecholamines+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+assess+neural-immune+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication.</a> J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).</li>
</ol>

著者らは、彼らには利益相反がないと宣言している。

以前にヒトの尿サンプル中の内因性遊離3-NTについての文献に報告された濃度の実質的なバリエーションが利用可能なアッセイ8、9、10、11に関連した方法論の問題点を明らかにする。ヒト尿中の3-NTの低い基底レベルの正確な決定は、試料調製およびLC-MS / MS分析のための特別な予防措置を必要とする困難な作業である。このプロトコールは、選択的LC-MS / MS検出と組み合わせた新規SPE手順と、高スループットでの尿3-NTの特異的かつ高感度の測定を可能にする。 MRMパラメータの注意深い選択は、3-NTの検出のための選択性を改善した。血漿27中の3-NTに対するISのMRM転移m / z 236.0&gt; 96.0は、尿試料に対する重大な汚染を引き起こした。よりクリーンな9倍の...

酸化ストレスが臨床上のプレゼンテーションに及ぼす影響は、近年ますます重要視されています1 。探索されているバイオマーカーの1つは、3-ニトロチロシン（3-NT）であり、反応性窒素種（RNS）がチロシン、カテコールアミン神経伝達物質前駆体と相互作用するときに生成する最終安定生成物である。 3-NTは、in vivoでの RNSのためのバイオマーカーとして臨床的価値を有していてもよいが、チロシンの性質及び機能の実質的な変化が悪影響を対応するタンパク質及び細胞機能1,2に影響を及ぼし得ます。新興の研究では、3-NTは、炎症状態で3、神経変性疾患の重要な役割を果たしていることを示唆している4、5、6心血管疾患や糖尿病7と同様に酸化ストレスに関連する状態。しかし、これらのobservations、感度及び/又は選択8、9、10、11に欠ける方法からの結果に基づいています。以前に文献に報告された生​​物学的サンプルの3-NTの濃度範囲の大部分は、深刻な分析上の問題がこれらのアッセイに関連していることを示しており、3-NTレベルを正確に定量化し、 。 生物学的マトリックス中の自由3-NTの定量化は、人間と機器8、9、10、11に特別な挑戦を提示しています。第1に、内因性3-NTのトレースレベルは、超高感度検出を必要とする。第二に、多数の構造的に類似した類似体、特にチロシンが存在し、これは非常に過剰であり、高度の選択性を必要とする。第3に、遍在する硝酸塩および亜硝酸塩によるチロシンニトロ化による3-NTの人工的形成は、3-NTの誤った過大評価を避けるために試料調製中に特別な配慮を必要とする。 3-NTを測定するために用いられる方法の多種多様な中でも、MS / MSは、その優れた感度と選択性11、12、13、14に金標準的な方法を考えてきました。ガスクロマトグラフィー（GC）は、MS / MSは、最良の感度を提供結合、しかし、必須サンプル誘導体化ステップは、臨床的有用性15、16のために効率的であることがあまりにも面倒で時間がかかります。 LC-MS / MSは複雑なサンプルの誘導体化を必要とせず、より有望な選択肢になります。それにもかかわらず、克服すべきいくつかの障害があります文献に報告されたLC-MS / MS法のnsitivity低豊富3-NT 7、17、18の測定のために改善する必要があり、比較的長いターンアラウンドタイムは、ハイスループットアプリケーション12のために短くする必要があり、13、17、19 。 さらに、臨床応用を考慮するとき、使用される生物学的マトリックスは重要な役割を果たす。それは簡単で得ることが安価で可能な20、21、22であれば、非侵襲性であるべきです。文献で伝統的に使用されている血漿である血漿は、臨床的に望ましいマトリックスではないので、非侵襲的かつ費用対効果の高い尿を利用する方法論が求められていた。 relを開発するためのいくつかの試みiableと特定LC-MS / MS方法論は、尿9、10、11を用いて行われてきました。しかし、それらはすべて、臨床的使用のために十分に選択的、信頼できる、または効率的であるのに足りない。 3-NTの分析のためのサンプルクリーンアップが疑問視されていると強カチオン交換（SCX）と逆相C18-OHの順次SPE 6提案されているような従来の逆相カートリッジ（C18型）を用いて、優勢なSPEの有効性、 7、19。最近開発されたLC-MS / MS法は、手動C18 SPE、分取高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）、および3-NT 23の分析のためのオンラインSPEの多段階精製プロセスを利用した。この方法は、0.041nMのLLOQを有する臨床目的のために十分に敏感であったが、クリーンアッププロセスは集中的で面倒であり、赤色の3 mLの尿。高スループットの実現可能性が制限されています。クリーンアッププロセス14の効率を改善するために、分子的にインプリントされたポリマーをSPE吸着剤として使用したが、得られたLLOQ（0.7μg/ mL）は臨床検体にとって十分に低いものではなかった。別の方法は、0.022 nMで24の検出限界（LOD）を達成するために、2次元（2D）LC-MS / MSおよびサンプルクリーンアップのためのイムノアフィニティークロマトグラフィーを必要としました。これらの方法はすべて3-NTの評価において進歩を遂げてきましたが、臨床応用に必要な感度、信頼性、効率を達成したものはありませんでした。 3-NTの病態とその臨床的環境における酸化ストレスのバイオマーカーとしての役割を調べるために、我々はハイスループットの臨床応用が可能なシンプルで効率的で正確で正確な方法論を開発した25 。小型化された混合モードカチオンexc誘導体化、蒸発および2D-LCを必要とする既存の方法に見られる欠点を迂回して、単一の抽出で3-NTの簡便で効果的なサンプルクリーンアップおよび濃縮を達成するためにハンゲイ（MCX）96ウェル抽出マイクロプレートを実施した。移動相における添加剤として0.01％HCOOHを用いた液体クロマトグラフィーは、迅速なサイクル時間で増強されたシグナル応答を提供した。選択性は、3-NTの選択的溶出のための軽度のNH 4 OAc溶出溶液の適用、および3-NTおよび内部標準（IS）の両方のMRM転移の使用によってさらに改善された。マトリックス効果は、定量化のために好ましい量の13 C標識同位体ISを使用することによって補償された。この方法論の出現により、研究者および臨床医は、臨床状態における3-NTの役割を検証し、さらに酸化ストレスの影響を探ることができるようになる。

<table><tbody><tr><td>3-ニトロ-L-チロシン</td><td>シグマ</td><td>N7389-5g</td><td></td></tr><tr><td>3-ニトロ-L-チロシン-13C9</td><td>Sigma</td><td>652296-5.0mg</td><td></td></tr><tr><td>質量分析金尿</td><td>ゴールデンウエストバイオロジカルズ</td><td>MSG 5000-1L</td><td></td></tr><tr><td>オアシスMCX 96-ウェル & マイクロ;溶出プレート</td><td>Waters</td><td>186001830BA</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 96 ウェル コレクション プレート</td><td>Phenomenex&nbsp;&nbsp;</td><td>AH0-7194</td><td></td></tr><tr><td>96 ポジティブプロセッサ</td><td>Waters&nbsp;</td><td></td><td></td>186005521</tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV メタノール&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>14262-2L</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS ウルトラクロマソルブ水</td><td>シグマ</td><td>14263-2L</td><td></td></tr><tr><td>質量分析用ギ酸</td><td>シグマ</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム溶液</td><td>シグマ</td><td>338818-1L</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラ PFP プロピルカラム</td><td>Restek</td><td>9179362</td><td></td></tr><tr><td>5500 トリプル クワッド</td><td>AB Sciex&nbsp;</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>UFLC-XR</td> 島津製作所の詳細はこちら<td>&nbsp;</td><td>/</td><td>詳細については、</td></tr><tr><td>Integra 400 Plus&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>/</td><td>尿中クレアチニンJaff&eacute;Gen 2 メソッド</td></tr><tr><td>LCMS 認定 12 x 32 mm スクリューネックバイアル</td><td>Waters</td><td>600000751CV</td><td></td></tr><tr><td>LCGC 認定 12 x 32 mm スクリューネックトータルリカバリーバイアル</td><td>Waters</td><td>186000384C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL トランスポートチューブ</td><td>Phenix</td><td>TT-3205</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心分離チューブ</td><td>Crystalgen&nbsp;</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>15 mL遠心分離管</td><td>Crystalgen&nbsp;</td><td>23-2266</td><td></td></tr><tr><td>eLine電動ピペット</td><td>ザルトリウス</td><td>730391</td><td></td></tr><tr><td>マイクロフュージ 遠心分離機&nbsp;</td><td>ベックマン・コール</td><td>ターA46474</td><td></td></tr><tr><td>OHAUS天びん&nbsp;&nbsp;</td><td>ケネディスケールズ株式会社</td><td>735</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー&nbsp;</td><td>ベルンステッドサーモリン</td><td>M16715</td><td></td></tr></tbody></table>

臨床応用のためのヒト尿中の3-ニトロチロシンの小型化固相抽出およびlc-ms / ms検出の統合

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

遊離3-ニトロチロシン（3-NT）は、酸化ストレスのための可能なバイオマーカーとして広範に使用されている。広範な病理学的状態において、3-NTのレベルの上昇が報告されている。しかし、既存の方法は、3-NTの低内在レベルを確実に測定するのに必要な十分な感度および/または特異性を欠いており、臨床応用には扱いにくい。したがって、3-NTのレベルを正確に定量化し、病理学的状態における3-NTの役割を確認するためには、分析的改善が急務である。このプロトコルは、非侵襲性バイオマーカーとしてのヒト尿中の3-NTの迅速かつ正確な測定のための小型液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS / MS）検出と小型化固相抽出（SPE）酸化ストレス96ウェルプレートを使用するSPEは、退屈な誘導体化および蒸発工程なしでサンプルのクリーンアップおよび分析物の濃縮を組み合わせることによりプロセスを顕著に単純化した廃棄物処分、汚染の危険性および全体的な処理時間を削減する。 SPE溶出溶液としてのpH9での25mM酢酸アンモニウム（NH 4 OAc）の使用は、選択性を実質的に向上させた。質量分析法のシグナル応答は、多重反応モニタリング（MRM）移行の調整によって改善されました。ペンタフルオロフェニル（PFP）カラム（150mm×2.1mm、3μm）上の添加剤として0.01％HCOOHを使用すると、シグナル応答がさらに2.5倍改善され、全実行時間が7分に短縮されました。 10pg / mL（0.044nM）の定量下限（LLOQ）が達成され、報告されたアッセイより有意な感度の改善を示した。この単純化された迅速で選択的で敏感な方法により、尿試料の2つのプレート（n = 192）を24時間の時間内で処理することが可能になる。顕著に改善された分析性能、および非侵襲的かつ安価な尿サンプリングを考慮すると、提案されたアッセイは、前臨床および臨床研究。

図1は、3-NTが、これらの非常に過剰な化合物に起因する共溶出妨害を排除し、結果としてアッセイ選択性の程度を高める、最適化されたLC条件下で他の構造的に類似のチロシン類似体から完全にクロマトグラフィーで分離されることを示す。さらに、0.45mL /分の流速でのMAおよびメタノール中の添加剤としての0.01％HCOOHによる勾配溶出により、3-NT（ すなわち 、7分のターンアラウンドタイムで3分）の迅速な溶出が可能になる。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55778/55778fig1.jpg" /> 図1： 標準溶液中の他のチロシンアナログからの3-NTのベースラインLCクロマトグラフィー分離。 （ A<...

混合モードカチオン交換（MCX）96ウェルマイクロプレート上での効率的な固相抽出と組み合わせた選択的かつ高感度の液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS / MS）法を、遊離3-ニトロチロシンの測定のために開発した3-NT）をヒト尿中に高スループットで導入することができ、これは臨床用途に適している。

臨床応用のためのヒト尿中の3-ニトロチロシンの小型化固相抽出およびLC-MS / MS検出の統合

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

この小型化された固相抽出とLC-MS/MSを組み合わせたアッセイの全体的な目的は、臨床応用のためにヒト尿中の遊離3-ニトロチロシンを正確に定量することです。遊離3-ニトロチロシンは、酸化ストレスのバイオマーカーとして有用です。しかし、感度と選択性の不足、および煩雑な試料調製のため、臨床応用のための生物学的検体において3-ニトロチロシンを正確に定量することは、依然として大きな課題となっています。高感度なLC-MS/MS相互作用に効率的な固相抽出を組み込んだこの手法により、構成や二次元LCを必要とすることなく、ヒト尿中の低レベルの内因性3-nitrotyrosineを迅速、特異的、かつ正確に定量することが可能になります。この方法は酸化ストレスの研究に知見を提供できるだけでなく、複雑な炎症性疾患や神経変性疾患などの他の病理学的状態にも適用可能です。3-nitrotyrosineレベルは抗酸化剤によって低下するため、この技術の意義は抗酸化療法の有効性のモニタリングにまで拡張できると考えられます。本手順を開始するには、あらかじめ調製し解凍した尿サンプル、標準試料、およびQCサンプルをボルテックスで撹拌してください。ボルテックス後、各サンプルおよび標準物質を 250 µL ずつ、清潔な 2 mL 96ウェルコレクションプレートの32ウェルに分注します。ダブルブランクサンプルウェルを除く各ウェルに、あらかじめ調製した内部標準作業溶液を 50 µL 加えます。次に、ダブルブランクサンプルウェルに 0.01%ギ酸含有 LC-MSグレード水を 50 µL 加えます。続いて、0.1%ギ酸含有LC-MSグレード水を各ウェルに250 µLずつ加えます。その後、8チャンネルピペットを用いて溶液を3回混合し、SPEロードまでプレートをカバーして保持します。次に、混合モード陽イオン交換96ウェル抽出マイクロプレートと回収リザーバーを陽圧プロセッサーに設置します。混合モード陽イオン交換マイクロプレートを用いた固相抽出により、一度の抽出でサンプルのクリーンアップと3-nitrotyrosineの濃縮を同時に行うことができます。吸着剤にLC-MSグレードのメタノール 200 microlitersを流し、抽出プレートをコンディショニングします。正圧プロセッサーの圧力調整ノブを回して低い正圧に設定し、混合液が吸着剤をゆっくりと通過するようにします。必要に応じて圧力を調整してください。2%ギ酸を含むLC-MSグレードの水200 µLを吸着剤に流して平衡化します。8チャンネルピペットを用いて、あらかじめ混合した各サンプルの全量を、コンディショニング済みの抽出プレートに慎重にロードします。正圧プロセッサーで低正圧に設定し、混合液が吸着剤をゆっくりと流れるようにし、必要に応じて圧力を調整します。続いて、2%ギ酸を含むLC-MSグレードの水200 µLを吸着剤に通してウェルを洗浄します。200 µLのメタノールと水で洗浄した後、正圧プロセッサーを高圧に設定してウェルを乾燥させます。ウェルが乾燥したら、リザーバーを清潔な2 mL 96ウェル回収プレートに交換します。次に、25 millimolarの酢酸アンモニウム溶液を50 µL添加し、抽出プレートから保持された分析物と内部標準物質をゆっくりと溶出させます。その後、溶出液を中和するために、5% formic acidを含むLC-MSグレードの水を50 µL加えます。溶出に穏やかな酢酸アンモニウム溶液を用いることで、3-nitrotyrosineの選択性と感度が大幅に向上します。液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）分析に備え、8チャンネルピペットを用いてサンプルを3回混合します。LC-MS/MS装置をセットアップした後、LCグラジエント溶出により、3-nitrotyrosine LC-MS/MSメソッドを10分間平衡化します。メソッドを平衡化することで、LCグラジエントが初期のグラジエント溶出状態になります。オートサンプラーの温度を4 °Cに、オーブンの温度を30 °Cに設定します。尿サンプル、標準試料、およびQCサンプルを含むバッチリストを作成してください。その後、調製したサンプルを注入してバッチを開始します。すべての注入が完了した後、3-ニトロチロシンのピーク面積比と内部標準物質の比を名目上の3-ニトロチロシン濃度に対して線形回帰させ、10から2,500 pg/mLの範囲で3-ニトロチロシン定量用の標準曲線を作成します。最後に、作成した標準曲線を用いて他のすべてのサンプルを定量し、QCサンプルが規定の範囲内にあるかを確認します。ヒト尿サンプルのLCデータは、最適化された条件下で3-ニトロチロシンが構造的に類似した他のチロシンアナログからクロマトグラフィー的に分離されることを示しており、これにより、これら極めて過剰な化合物に起因する共溶出干渉が排除され、結果としてアッセイの選択性が向上します。ダブルブランクサンプルの多重反応モニタリングクロマトグラムでは3-nitrotyrosineのシグナルが観察されず、全工程において3-nitrotyrosineが生成されていないことが示されました。ここでは、健康な個体における3-nitrotyrosineおよび内部標準物質の代表的な多重反応モニタリングクロマトグラムを示します。3-nitrotyrosineおよび内部標準物質の保持時間において、干渉シグナルは観察されませんでした。代表的な標準曲線をここに示します。信号対雑音比が3を超える最低濃度として定義される検出限界は、2 pg/mLと決定されました。定量下限は10 pg/mLと決定され、これは信号対雑音比が10を超え、かつ不精確度および正確度が20%以内である最低濃度として定義されます。最適化された統合アッセイにより、マトリックス効果、吸着剤の使用量、および廃棄物の処理を低減しつつ、特異度、感度、およびスループットを大幅に向上させることができます。この簡便かつ迅速なアッセイを用いることで、尿検体を24時間以内に処理することが可能です。また、尿サンプリングが非侵襲的で低コストであることも考慮してください。この大幅に改良された手法は、前臨床および臨床研究において、酸化ストレスのバイオマーカーとしての 3-nitrotyrosine の役割を評価するのに非常に適しています。

integration-miniaturized-solid-phase-extraction-lc-msms-detection-3

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

将来の臨床応用のための唾液採取を考慮して、ロリポップのような限外濾過（LLUF）プローブは、ヒトの口腔内に収まるように作製した。ナノLC-LTQ質量分析法による消化唾液の直接分析は、大規模なタンパク質や高濃度タンパク質を除去し、低豊富なペプチドは多くの検出可能なようにするLLUFプローブの能力を実証した。...

ロリポップライク限外プローブを用いたヒト先住民唾液ペプチドーをサンプリング：臨床質量分析のためのペプチドの検出を簡素化し、強化

非標的メタボロミクスは、代謝プロファイルのスナップショットを生成する仮説を提供します。このプロトコルは、細胞、血清、または組織からの代謝物の抽出と分析を紹介します。代謝物の範囲は、液 -...

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Α-水酸化チトクローム p450 によって発がん性ニトロソアミンが受け入れられる代謝経路突然変異を引き起こす DNA 損傷中間体を生成します。ただし、新しいデータは、nitrosamides への酸化がさらに発生することができますを示します。一般について述べるニトロソアミンのチトクローム p450 代謝体外産 nitrosamides...

チトクローム p450 によるニトロソアミンのIn Vitro代謝 Nitrosamide 形成を検出するための一般的な方法

3 つのモノアミン神経伝達物質の一斉分析や乳児の尿中代謝物の 2 つの (ECD) の電気化学検出高速液体クロマトグラフィー (HPLC) に結合する便利な固相抽出を提案する.脳障害の早期診断のための潜在的なバイオ マーカーとして代謝物 MHPG...

抽出と神経伝達物質カテコールアミン及びその代謝物の高速液体クロマトグラフィーによる分析のための便利な方法

高性能液体クロマトグラフィー-電気化学検出器 (HPLC-ECD) を使用して空気サンプラー プリフィルターからカット 6 mm ラウンド...

3-ニトロチロシン大気環境を介して高性能液体クロマトグラフィー-電気化学検出器システムの検出

マルチ セグメントの注入キャピラリー電気泳動質量分析法による高スループットかつ包括的な薬物監視

チロシン硝化タンパク質のプロテオミックプロファイリングは、3-ニトロチロシン修飾の低い存在性のために挑戦的な技術であった。ここでは、アンジオテンシンIIをモデルにしたニトロペプチド濃縮とプロファイリングに対する新しいアプローチについて述べた。この方法は、他のインビトロまたはインビボシステムに拡張することができます。...

アンジオテンシンIIによるニトロペプチドプロファイリングと同定

ここで説明するキヌレニン経路で生成される4種類のトリプトファン代謝産物(キヌレニン、3−ヒドロキシキヌレニン、キサンチュレン酸、3−ヒドロキシアントラニル酸)を、液体クロマトグラフィーによって分析した培養液から採取した培地中の単一の四重極質量分析法を用いて説明する。...

癌細胞培養から採取した培地における液体クロマトグラフィー-質量分析法による選択キヌレニンの同時定量化

このプロトコルは、臨床サンプルからのタンパク質の多重反応モニタリング(MRM)のための三重四重極質量分析計の使用を導入することを目的としています。我々は、サンプル調製から臨床サンプルのデータ分析に始まる体系的なワークフローを提供し、必要な予防措置をすべて講じています。...

ヒト脳組織からのタンパク質の多発反応モニタリングを用いた定量的プロテオミクスワークフロー

このプロトコルでは、CRISPR-Casを介した多検体合成尿バイオマーカー検査について説明しており、腫瘍関連プロテアーゼ活性のex...

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

学ぼう、小型化固相抽出とLC-MS/MSを用いてヒト尿中の3-ニトロチロシンを高感度に定量する方法。酸化ストレスバイオマーカーの臨床応用に適した迅速かつ正確な分析技術です。

臨床応用のためのヒト尿中の3-ニトロチロシンの小型化固相抽出およびLC-MS / MS検出の統合

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