臨床応用のためのヒト尿中の3-ニトロチロシンの小型化固相抽出およびLC-MS / MS検出の統合

この小型化された固相抽出とLC-MS/MSを組み合わせたアッセイの全体的な目的は、臨床応用のためにヒト尿中の遊離3-ニトロチロシンを正確に定量することです。遊離3-ニトロチロシンは、酸化ストレスのバイオマーカーとして有用です。しかし、感度と選択性の不足、および煩雑な試料調製のため、臨床応用のための生物学的検体において3-ニトロチロシンを正確に定量することは、依然として大きな課題となっています。

高感度なLC-MS/MS相互作用に効率的な固相抽出を組み込んだこの手法により、構成や二次元LCを必要とすることなく、ヒト尿中の低レベルの内因性3-nitrotyrosineを迅速、特異的、かつ正確に定量することが可能になります。この方法は酸化ストレスの研究に知見を提供できるだけでなく、複雑な炎症性疾患や神経変性疾患などの他の病理学的状態にも適用可能です。3-nitrotyrosineレベルは抗酸化剤によって低下するため、この技術の意義は抗酸化療法の有効性のモニタリングにまで拡張できると考えられます。本手順を開始するには、あらかじめ調製し解凍した尿サンプル、標準試料、およびQCサンプルをボルテックスで撹拌してください。

ボルテックス後、各サンプルおよび標準物質を 250 µL ずつ、清潔な 2 mL 96ウェルコレクションプレートの32ウェルに分注します。ダブルブランクサンプルウェルを除く各ウェルに、あらかじめ調製した内部標準作業溶液を 50 µL 加えます。次に、ダブルブランクサンプルウェルに 0.01%ギ酸含有 LC-MSグレード水を 50 µL 加えます。

続いて、0.1%ギ酸含有LC-MSグレード水を各ウェルに250 µLずつ加えます。その後、8チャンネルピペットを用いて溶液を3回混合し、SPEロードまでプレートをカバーして保持します。次に、混合モード陽イオン交換96ウェル抽出マイクロプレートと回収リザーバーを陽圧プロセッサーに設置します。

混合モード陽イオン交換マイクロプレートを用いた固相抽出により、一度の抽出でサンプルのクリーンアップと3-nitrotyrosineの濃縮を同時に行うことができます。吸着剤にLC-MSグレードのメタノール 200 microlitersを流し、抽出プレートをコンディショニングします。正圧プロセッサーの圧力調整ノブを回して低い正圧に設定し、混合液が吸着剤をゆっくりと通過するようにします。必要に応じて圧力を調整してください。

2%ギ酸を含むLC-MSグレードの水200 µLを吸着剤に流して平衡化します。8チャンネルピペットを用いて、あらかじめ混合した各サンプルの全量を、コンディショニング済みの抽出プレートに慎重にロードします。正圧プロセッサーで低正圧に設定し、混合液が吸着剤をゆっくりと流れるようにし、必要に応じて圧力を調整します。

続いて、2%ギ酸を含むLC-MSグレードの水200 µLを吸着剤に通してウェルを洗浄します。200 µLのメタノールと水で洗浄した後、正圧プロセッサーを高圧に設定してウェルを乾燥させます。ウェルが乾燥したら、リザーバーを清潔な2 mL 96ウェル回収プレートに交換します。

次に、25 millimolarの酢酸アンモニウム溶液を50 µL添加し、抽出プレートから保持された分析物と内部標準物質をゆっくりと溶出させます。その後、溶出液を中和するために、5% formic acidを含むLC-MSグレードの水を50 µL加えます。溶出に穏やかな酢酸アンモニウム溶液を用いることで、3-nitrotyrosineの選択性と感度が大幅に向上します。

液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）分析に備え、8チャンネルピペットを用いてサンプルを3回混合します。LC-MS/MS装置をセットアップした後、LCグラジエント溶出により、3-nitrotyrosine LC-MS/MSメソッドを10分間平衡化します。メソッドを平衡化することで、LCグラジエントが初期のグラジエント溶出状態になります。

オートサンプラーの温度を4 °Cに、オーブンの温度を30 °Cに設定します。尿サンプル、標準試料、およびQCサンプルを含むバッチリストを作成してください。その後、調製したサンプルを注入してバッチを開始します。

すべての注入が完了した後、3-ニトロチロシンのピーク面積比と内部標準物質の比を名目上の3-ニトロチロシン濃度に対して線形回帰させ、10から2,500 pg/mLの範囲で3-ニトロチロシン定量用の標準曲線を作成します。最後に、作成した標準曲線を用いて他のすべてのサンプルを定量し、QCサンプルが規定の範囲内にあるかを確認します。ヒト尿サンプルのLCデータは、最適化された条件下で3-ニトロチロシンが構造的に類似した他のチロシンアナログからクロマトグラフィー的に分離されることを示しており、これにより、これら極めて過剰な化合物に起因する共溶出干渉が排除され、結果としてアッセイの選択性が向上します。

ダブルブランクサンプルの多重反応モニタリングクロマトグラムでは3-nitrotyrosineのシグナルが観察されず、全工程において3-nitrotyrosineが生成されていないことが示されました。ここでは、健康な個体における3-nitrotyrosineおよび内部標準物質の代表的な多重反応モニタリングクロマトグラムを示します。3-nitrotyrosineおよび内部標準物質の保持時間において、干渉シグナルは観察されませんでした。

代表的な標準曲線をここに示します。信号対雑音比が3を超える最低濃度として定義される検出限界は、2 pg/mLと決定されました。定量下限は10 pg/mLと決定され、これは信号対雑音比が10を超え、かつ不精確度および正確度が20%以内である最低濃度として定義されます。

最適化された統合アッセイにより、マトリックス効果、吸着剤の使用量、および廃棄物の処理を低減しつつ、特異度、感度、およびスループットを大幅に向上させることができます。この簡便かつ迅速なアッセイを用いることで、尿検体を24時間以内に処理することが可能です。また、尿サンプリングが非侵襲的で低コストであることも考慮してください。

この大幅に改良された手法は、前臨床および臨床研究において、酸化ストレスのバイオマーカーとしての 3-nitrotyrosine の役割を評価するのに非常に適しています。