臨床応用のためのヒト尿中の3-ニトロチロシンの小型化固相抽出およびLC-MS / MS検出の統合

この小型固相抽出とLC-MS/MSアッセイの組み合わせの全体的な目標は、臨床応用のためにヒト尿中の遊離3-ニトロチロシンを正確に定量することです。遊離3-ニトロチロシンは、収量を助け、酸化ストレスのバイオマーカーとなります。しかし、生物学的な緊急時に3-ニトロチロシンを正確に定量することは、感度や選択性が不十分で、サンプル調製が面倒なため、臨床応用では依然として特別な課題です。

この手法は、高感度のLC-MS / MS相互作用に効果的な固相抽出を組み込んでおり、体質や2次元LCを必要とせずに、ヒト尿中の低レベルの内因性3-ニトロチロシンを迅速、特異的、かつ正確に測定できます。この技術の意味は、抗酸化物質によって3-ニトロチロシンレベルを下げることができるため、抗酸化治療の有効性の監視に拡張できます。この手順を開始するために、ボルテックスは事前に調製し、尿サンプル、標準試料、およびQCサンプルを解凍しました。

ボルテックス後、各サンプルと標準試料の250マイクロリットルを、清潔な2ミリリットルの96ウェル収集プレートの32ウェルに加えます。事前に調製した内部標準液50マイクロリットルを、ダブルブランクサンプルウェルを除く各ウェルに加えます。次に、50 μL の LC-MS グレードの水と 0.01% のギ酸をダブルブランクサンプルウェルに加えます。

これに続いて、0.1% のギ酸を含む 250 マイクロリットルの LC-MS グレードの水をウェルに加えます。次に、8チャンネルピペットで溶液を3回混合し、SPEがロードされるまでプレートを覆います。次に、ミックスモード陽イオン交換96ウェル抽出マイクロプレートと収集リザーバーを陽圧プロセッサ上に置きます。

ミックスモード陽イオン交換マイクロプレートを用いた固相抽出により、1回の抽出でサンプルのクリーンアップと3-ニトロチロシンの濃縮を同時に行うことができます。吸着剤を介して200マイクロリットルのLC-MSグレードのメタノールを流すことにより、抽出プレートをコンディショニングします。陽圧プロセッサの圧力調整ノブを回して、混合物が吸着剤をゆっくりと流れるように低正圧を設定し、必要に応じて圧力を調整します。

200 μリットルの LC-MS グレードの水と 2% ギ酸を吸着剤に流して平衡化します。8チャンネルピペットを使用して、事前に混合した各サンプルの全容量を前処理された抽出プレートに慎重にロードします。陽圧プロセッサの正圧を低く設定して、混合物が吸着剤をゆっくりと流れるようにし、必要に応じて圧力を調整します。

その後、吸着剤に 200 μL の LC-MS グレードの水と 2% ギ酸を流してウェルを洗浄します。200マイクロリットルのメタノールと水で洗浄した後、井戸を乾燥させるために陽圧プロセッサを高圧に設定します。ウェルが乾いたら、リザーバーを清潔な2ミリリットルの96ウェルコレクションプレートと交換します。

次に、50マイクロリットルの25ミリモル酢酸アンモニウム溶液を塗布して、抽出プレートから保持された分析種と内部標準をゆっくりと溶出します。次に、50 マイクロリットルの LC-MS グレードの水と 5% ギ酸を加えて、溶離液を中和します。3-ニトロチロシンの溶出にマイルドな酢酸アンモニウム溶液を適用すると、選択性と感度が大幅に向上します。

液体クロマトグラフィータンデム質量分析の準備のために、8チャンネルピペットでサンプルを3回混合します。LC-MS/MS 装置をセットアップした後、3-ニトロチロシン LC-MS/MS 分析法を LC グラジエント溶出液で 10 分間平衡化します。分析法を平衡化することにより、LC グラジエントは初期グラジエント溶出液まで平衡化されます。

オートサンプラーの温度は摂氏4度、オーブンの温度は摂氏30度に設定されます。尿サンプル、標準試料、QCサンプルを含むバッチリストを作成します。次に、準備したサンプルを注入してバッチを開始します。

すべての注入が完了したら、3-ニトロチロシンおよび内部標準のピーク面積比と公称3-ニトロチロシン濃度の線形回帰による3-ニトロチロシン定量のための10〜2, 500ピコグラム/ミリリットルの範囲の標準曲線を確立します。最後に、確立された標準曲線を使用して他のすべてのサンプルを定量し、QCサンプルが確立された範囲内にあるかどうかを判断します。ヒト尿サンプルのLCデータは、3-ニトロチロシンが最適化された条件下で他の構造的に類似したチロシン類似体からクロマトグラフィーで分離され、これらの非常に過剰な化合物による共溶出干渉を排除し、その結果、アッセイの選択性が向上することを示しています。

ダブルブランクサンプルの多重反応モニタリングクロマトグラムでは、3-ニトロチロシンシグナルは観察されず、プロセス全体で3-ニトロチロシンが形成されていないことを示しています。ここでは、3-ニトロチロシンの代表的な多重反応モニタリングクロマトグラムと健康な人の内部標準を示します。3-ニトロチロシンと内部標準の保持時間では干渉シグナルは観察されませんでした。

代表的な標準曲線を以下に示します。検出限界は、S/N比が3より大きい最低濃度として定義され、1ミリリットルあたり2ピコグラムであると決定されました。定量下限は 10 ピコグラム/ミリリットルと決定され、S/N 比が 10 を超える不正確かつ正確度の 20% 以内の最低濃度として定義されます。

微調整された統合アッセイにより、特異性、感度、スループットが大幅に向上し、マトリックス効果、吸着剤の使用量、および廃棄物処理が削減されます。このシンプルで迅速なアッセイにより、尿サンプルを24時間以内に処理することができます。非侵襲的で安価な尿サンプリングを考慮に入れてください。

この著しく改善された方法は、前臨床および臨床研究における酸化ストレスバイオマーカーとしての3-ニトロチロシンの役割を評価するのに適しています。