チトクローム p450 によるニトロソアミンのIn Vitro代謝 Nitrosamide 形成を検出するための一般的な方法

この方法論の全体的な目標は、Cytochrome P450sがin vitroでn個のニトロソアミンをn個のニトサミドに処理的に酸化できるかどうかを判断することです。この方法は、ニトサミンが直接ニトロソアミドに代謝されるかどうかを評価することにより、毒物学分野に利益をもたらします。ニトロソアミドはアルキル酸DNA中で比較的安定しているため、発がんに関与している可能性があります。

この手法の主な利点は、高感度質量分析計を使用することで、同様のin vitroニトロソアミン代謝アッセイで以前に達成された検出限界よりも低い検出限界が得られることです。この手順を開始するには、マグネティックスターバーが入った25ミリリットルの丸底フラスコをオーブンに入れます。摂氏140度で16時間乾燥させます。

この後、フラスコをヒュームフードに移し、窒素ガスの流れの下で冷却します。フラスコに31.8ミリグラムのノルコチニン、5ミリリットルの無水酢酸、1ミリリットルの酢酸を加え、攪拌を開始します。フラスコを氷水浴に移します。

33.3ミリグラムの亜硝酸ナトリウムを加えます。2.5時間攪拌を続けてから、反応を18ミリリットルの氷冷水に注ぎ、反応を急冷します。直ちに溶液を18ミリリットルのDCMを含む分離漏斗に移し、水溶液を抽出します。

水層をさらに 2 回抽出し、毎回 9 ミリリットルの DCM を使用します。次に、プールした有機物を100ミリグラムの硫酸マグネシウムで2分間乾燥させます。ろ過後、ロータリーエバポレーターを使用して溶液を摂氏30度で濃縮し、粗黄色の油を生成します。

テキストプロトコルに概説されているように、カラムクロマトグラフィーを使用して粗化合物を精製します。この後、純粋な化合物を1ミリリットルの重水素化クロロホルムに溶解します。NMRを使用して、テキストプロトコルに概説されている溶液の構造とモル濃度を確認します。

この溶液は、必要になるまで暗所で摂氏2〜8度の温度で保管してください。次に、テキストプロトコルで概説されているように、正確な親質量を確認し、高分解能質量分析計に直接注入することにより、純粋なNNC溶液の製品イオン質量を決定します。まず、必要な試薬を摂氏80度の冷凍庫から取り出し、氷上で解凍します。

解凍した1つを、0.5強度の反応緩衝液を使用して、NADPH再生システム1-10および1-50のバキュロソームをそれぞれ1ミリリットルのチューブで希釈します。次に、0.5強度の反応バッファー97マイクロリットルを含む1ミリリットルのチューブに、3マイクロリットルのNADPストック溶液を追加します。インキュベーションごとに、反応バッファーで作製した4マイクロモルNNN溶液を40マイクロリットル加えて、1ミリリットルのチューブを調製します。

各チューブにP450 2A6の5つのピコモルを含む酵素溶液の50マイクロリットルを追加します。37度の水浴で2分間プレイインキュベートします。次に、希釈したNADP +溶液10マイクロリットルを各チューブに加えます。

摂氏37度で1〜30分間インキュベートします。この後、最初に10マイクロリットルの3.0正常硫酸亜鉛を追加し、次に10マイクロリットルの3.0正常水酸化バリウムを追加して反応を急冷します。溶液をボルテックスして白い沈殿物を形成します。

次に、8000Gで4分間遠心分離します。すぐに上清を収集し、液体クロマトグラフィー正のナノエレクトロスプレーイオン化高分解能タンデム質量分析法で2マイクロリットルを分析します。この研究では、ノルコチニンをNNCにクリーンかつ高収率でニトロソ化し、in vitro実験で使用するための標準物質を調製します。

この反応の成功は、高分解能タンデム質量分析を含む分光分析によって検証され、親の質量が理論値の5ppm以内であることが確認されました。次に、NNCのタンデム質量分析フラグメンテーションを使用して、最も存在量の多いプロダクトイオン質量を決定します。ご覧のとおり、最も存在量の多い2つのプロダクトイオンは134と162で、小数点以下5桁までの正確な質量検出が可能です。

合成されたNNCは、in vitro P450代謝アッセイの標準物質として利用されます。使用した条件下では、合成NNCは約17.5分で溶出し、親イオンチャネルと製品イオンチャネルの両方で十分に分離されたピークを示します。ポジティブコントロールに従って、NNC形成は1分、5分、および10分のインキュベーションで見られます。

適切に実施すれば、ニトロソアミド合成の検査分析は約6時間で完了します。同様に、複数回のインキュベーションによるin vitroアッセイも8時間以内で完了します。この手法の意味は、ニトロソアミド関連のバイオマーカーの測定が個々のニトロソアミンの活性化について有益である可能性があるため、タバコ関連のがんのリスク評価にまで及びます。

この手順を試みる際には、酵素インキュベーションを迅速に処理することを覚えておくことが重要です。ニトロソアミドはこれらの条件下で加水分解するため、質量分析の前に長く放置しないでください。このビデオを見れば、ニトロソアミド標準試料の調製方法と、適切なニトロソアミンシトクロムP450システムによってin vitroで形成されるかどうかを評価する方法について十分に理解できるはずです。

NNN、NNC、または関連する発がん性物質の取り扱いは危険な場合があることを忘れないでください。これらの化合物は、白衣、安全メガネ、手袋を着用しながら、常にドラフトで取り扱う必要があります。さらに、すべての発がん性廃棄物は適切に保管し、ラベルを付ける必要があります。