消化管オルガノイドの遺伝子工学のための汎用的かつ効率的なエレクトロポレーションプロトコル
February 18th, 2020
このプロトコルは、より大きなプラスミドを有する4つの異なる胃腸オルガノイドエンティティのトランスフェクションのための効率的なエレクトロポレーション法を記述する(10kBの範囲)。それは1日以内に行うことができるし、広範な準備または特別な、費用を要するエレクトロポレーションの緩衝液を必要としない。
オルガノイドなどの3D細胞培養を効率的にトランスフェクションできる。遺伝子工学の様々な応用が容易にすることができる。プロトコルは普遍的であり、1日以内に実行することができます。
それは広範な準備または特別な、費用のかかるエレクトロポレーションの緩衝を必要としない。このトランスフェクション法は、腫瘍や健康なオルガノイドで実証されましたが、スフェロイドや2D細胞培養にも調整できます。このプロトコルを初めて実行する場合、個々の増殖と解離反応のためにオルガノイドを注意して扱うことが重要です。
全体の手順の間に顕微鏡でそれらを監視します。エレクトロポレーション後の播種のために摂氏37度で48ウェルプレートを盛り付けてから始め、原稿の指示に従って基底および有機体培養固有の培地を調製します。48ウェルプレートでエレクトロポレーションサンプルごとにオルガノイドの5つのウェルを栽培し、1ウェルあたり10マイクロモルY-27632で230マイクロリットルの解離試薬を調製します。
顕微鏡下でオルガノイドを監視します。ウェルから培養培地を取り出し、調製した解離混合物中で有機体を機械的に解離する。エレクトロポレーションサンプルあたり5つの井戸を15ミリリットルチューブにプールします。
渦を混ぜてチューブの内容物を混合し、10〜15細胞のクラスターが発生するまで摂氏37度で5〜15分間インキュベートし、顕微鏡で解離を確認します。抗生物質なしで基礎培地の10ミリリットルまでを追加することによって消化を停止します。チューブを450回gで5分間遠心し、上清を捨て、4ミリリットルのエレクトロポレーションバッファーで細胞を2回洗浄します。
遠心分離機を、各洗浄後に上清を捨てます。この後、30マイクログラムのプラスミドDNAを用いて100マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーにオルガノイドペレットを再懸濁させる。完全なDNA-オルガノイド混合物をエレクトロポレーションキュベットに分配する。
気泡を避けるようにしてください。テキスト原稿に記載されているようにエレクトロポレーションパラメータを設定し、指でキュベットをタップして細胞を穏やかに混ぜます。キュベットをキュベット室に入れ、エレクトロポレーターのインピーダンスボタンを押してインピーダンス値をメモします。
開始ボタンを押してエレクトロポレーションプログラムを開始し、表示される電流、電圧、およびエネルギーの値を制御します。エレクトロポレーション後、抗生物質を含まない培地500マイクロリットルを細胞に直ちに加え、上下にピペットを混ぜて混合する。サンプルを新しい15ミリリットルチューブに移し、残りの細胞を収集するために基底培地でキュベットを洗い換え、室温で40分間培養します。
細胞を450回gで5分間遠心し、上清を捨てる。ペレットを100マイクロリットルの地下マトリックスに再懸濁し、20マイクロリットルのシード滴を温めた48ウェルプレートに入れ直します。重合のために37°Cでプレートを10分間インキュベートし、Y-27632とCHIR99021を添加した培養培地250マイクロリットルを井戸ごとに加えます。
トランスフェクション効率を決定するには、24~48時間後に顕微鏡下でトランスフェクションコントロールの蛍光を確認します。FACS分析では、先に説明したとおりに細胞を収穫し、単一細胞が存在するまで10〜20分間消化する。PBSを最大10ミリリットル加え、細胞を450倍gで5分間遠心分離し、吸引して上清を捨てます。
生きた細胞を判別するには、PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、適切な抗体またはヨウ化プロピジウムを添加する。細胞をタップして穏やかに混合し、暗闇の中で30分間室温でインキュベートします。インキュベーション後、細胞を10ミリリットルのPBSで洗浄し、次いで遠心分離機を使用して上清を捨てます。
200マイクロリットルのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、100マイクロメートルのストレーナーを通してFACSチューブに懸濁液をろ過します。適切な格言戦略を使用してFACSマシンで細胞を分析し、トランスフェクション効率を決定します。4つの異なる癌体のオルガノイドは、小さなプラスミドまたは大きなプラスミドの30マイクログラムを使用して少なくとも3回電気電解された。
エレクトロポレーション後48時間のフローサイトメトリーで解析し、細胞形状、単細胞、生細胞、およびeGFP発現にゲートを付けた。4つのオルガノイドエンティティすべてにおいて、小さなプラスミドは、より大きなプラスミドよりも高い効率でトランスフェクションされた。小さなプラスミドの最も効率的なトランスフェクションは、92.1%GFP陽性細胞を有するPDACオルガノイドで到達した、 大きなプラスミドは46.7%の効率でトランスフェクションされたのに対し、より大きなプラスミドは平均効率53.4%のCRCオルガノイドにトランスフェクトされ、小さなプラスミドは平均効率84.3%でトランスフェクションされたのが最も困難な組織は胃癌オルガノイドであった。、これは両方のプラスミドの最も低いトランスフェクション効率を実証した。
概念実証として、ヒト正常胃オルガノイドは、TP53を標的とするCas9、GFP、および2sgRNA用のプラスミドコードを用いて電気電解した。クローンはNutlin3投与により選択され、TP53ノックアウトは対立胞のシーケンシングによって確認された。ヒト胃オルガノイドで実証したように、効率的なエレクトロポレーションは、ノックアウトやノックインなどのオルガノイド培養物のCRISPR Cas9ベース操作を可能にするため、異なる疾患をモデル化することができます。
概要
このプロトコルは、より大きなプラスミドで消化器官オルガノイドをトランスフェクトするための効率的なエレクトロポレーション法を説明しています。この方法は迅速で、広範な準備や高価なバッファーは必要ありません。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 遺伝子工学
背景
- オルガノイドのような3D細胞培養のトランスフェクションは困難です。
- 遺伝子操作のための効率的な方法が必要です。
- このプロトコルは様々なタイプのオルガノイドに適用可能です。
- 手順中のオルガノイドの慎重な取り扱いが重要です。
研究の目的
- オルガノイドのための信頼できるエレクトロポレーション法を開発すること。
- オルガノイド培養における遺伝子工学応用を促進すること。
- 異なるオルガノイドタイプ間でのトランスフェクション効率を評価すること。
使用された方法
- オルガノイドの解離とエレクトロポレーション混合物の調製。
- プラスミドDNAのための特定のパラメータによるエレクトロポレーション。
- 蛍光とFACS分析によるトランスフェクション効率のモニタリング。
- オルガノイドにおける遺伝子編集のためのCRISPR-Cas9の適用。
主要な結果
- より小さなプラスミドで高いトランスフェクション効率が観察されました。
- PDACオルガノイドが小さなプラスミドに対して最も高い効率を示しました。
- 胃がんオルガノイドは最も低いトランスフェクション率を示しました。
- 正常な胃オルガノイドで遺伝子編集の成功が実証されました。
結論
- このエレクトロポレーション法は様々なオルガノイドタイプに効果的です。
- 疾患モデリングのための効率的な遺伝子操作を可能にします。
- 将来の応用には、より広範なCRISPRベースの技術が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient genetic engineering of patient-derived gastrointestinal organoids is critical for translational disease modeling and target validation in early drug discovery. This universal electroporation protocol enables rapid, reproducible transfection of diverse organoid types, supporting high-confidence functional genomics and CRISPR-based manipulation. The method streamlines genetic perturbation workflows, reducing technical barriers and accelerating preclinical hypothesis testing across oncology and regenerative medicine portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust genetic perturbation of organoids for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by facilitating CRISPR-mediated knockout and knockin studies.
- Improves predictive confidence in disease-relevant 3D models for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, genetically modified organoids for downstream phenotypic screening.
- Delivers reproducible transfection efficiencies quantified by FACS, supporting assay reliability.
- Facilitates scalable preparation of engineered organoid systems for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Enables modeling of patient-specific mutations and disease states in organoid cultures.
- Provides continuity from discovery-stage genetic manipulation to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Supports alignment with translational biomarkers through precise genome editing.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless transition from genetic hypothesis testing to functional validation in disease-relevant organoid systems.
- Discovery Biology: Facilitates rapid null hypothesis testing and pathway interrogation in 3D models.
- Screening: Provides reproducible, quantitative transfection outputs for assay development.
- Analytics: Delivers FACS-based efficiency metrics for cross-condition comparison and optimization.
- Translational Research: Bridges engineered organoid models to preclinical disease studies and biomarker exploration.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse organoid and spheroid systems across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with minimal preparation and no need for specialized buffers.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling rapid genetic manipulation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture and handling to ensure viability and reproducibility.
- Needs access to standard electroporation equipment and FACS analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of gating strategies and transfection efficiency metrics.
- Adaptable to various organoid types and potentially to spheroids and 2D cultures with protocol adjustments.
- Efficiency may vary by organoid entity and plasmid size, requiring empirical optimization.
