消化管オルガノイドの遺伝子工学のための汎用的かつ効率的なエレクトロポレーションプロトコル

オルガノイドなどの3D細胞培養を効率的にトランスフェクションできる。遺伝子工学の様々な応用が容易にすることができる。プロトコルは普遍的であり、1日以内に実行することができます。

それは広範な準備または特別な、費用のかかるエレクトロポレーションの緩衝を必要としない。このトランスフェクション法は、腫瘍や健康なオルガノイドで実証されましたが、スフェロイドや2D細胞培養にも調整できます。このプロトコルを初めて実行する場合、個々の増殖と解離反応のためにオルガノイドを注意して扱うことが重要です。

全体の手順の間に顕微鏡でそれらを監視します。エレクトロポレーション後の播種のために摂氏37度で48ウェルプレートを盛り付けてから始め、原稿の指示に従って基底および有機体培養固有の培地を調製します。48ウェルプレートでエレクトロポレーションサンプルごとにオルガノイドの5つのウェルを栽培し、1ウェルあたり10マイクロモルY-27632で230マイクロリットルの解離試薬を調製します。

顕微鏡下でオルガノイドを監視します。ウェルから培養培地を取り出し、調製した解離混合物中で有機体を機械的に解離する。エレクトロポレーションサンプルあたり5つの井戸を15ミリリットルチューブにプールします。

渦を混ぜてチューブの内容物を混合し、10〜15細胞のクラスターが発生するまで摂氏37度で5〜15分間インキュベートし、顕微鏡で解離を確認します。抗生物質なしで基礎培地の10ミリリットルまでを追加することによって消化を停止します。チューブを450回gで5分間遠心し、上清を捨て、4ミリリットルのエレクトロポレーションバッファーで細胞を2回洗浄します。

遠心分離機を、各洗浄後に上清を捨てます。この後、30マイクログラムのプラスミドDNAを用いて100マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーにオルガノイドペレットを再懸濁させる。完全なDNA-オルガノイド混合物をエレクトロポレーションキュベットに分配する。

気泡を避けるようにしてください。テキスト原稿に記載されているようにエレクトロポレーションパラメータを設定し、指でキュベットをタップして細胞を穏やかに混ぜます。キュベットをキュベット室に入れ、エレクトロポレーターのインピーダンスボタンを押してインピーダンス値をメモします。

開始ボタンを押してエレクトロポレーションプログラムを開始し、表示される電流、電圧、およびエネルギーの値を制御します。エレクトロポレーション後、抗生物質を含まない培地500マイクロリットルを細胞に直ちに加え、上下にピペットを混ぜて混合する。サンプルを新しい15ミリリットルチューブに移し、残りの細胞を収集するために基底培地でキュベットを洗い換え、室温で40分間培養します。

細胞を450回gで5分間遠心し、上清を捨てる。ペレットを100マイクロリットルの地下マトリックスに再懸濁し、20マイクロリットルのシード滴を温めた48ウェルプレートに入れ直します。重合のために37°Cでプレートを10分間インキュベートし、Y-27632とCHIR99021を添加した培養培地250マイクロリットルを井戸ごとに加えます。

トランスフェクション効率を決定するには、24~48時間後に顕微鏡下でトランスフェクションコントロールの蛍光を確認します。FACS分析では、先に説明したとおりに細胞を収穫し、単一細胞が存在するまで10〜20分間消化する。PBSを最大10ミリリットル加え、細胞を450倍gで5分間遠心分離し、吸引して上清を捨てます。

生きた細胞を判別するには、PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、適切な抗体またはヨウ化プロピジウムを添加する。細胞をタップして穏やかに混合し、暗闇の中で30分間室温でインキュベートします。インキュベーション後、細胞を10ミリリットルのPBSで洗浄し、次いで遠心分離機を使用して上清を捨てます。

200マイクロリットルのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、100マイクロメートルのストレーナーを通してFACSチューブに懸濁液をろ過します。適切な格言戦略を使用してFACSマシンで細胞を分析し、トランスフェクション効率を決定します。4つの異なる癌体のオルガノイドは、小さなプラスミドまたは大きなプラスミドの30マイクログラムを使用して少なくとも3回電気電解された。

エレクトロポレーション後48時間のフローサイトメトリーで解析し、細胞形状、単細胞、生細胞、およびeGFP発現にゲートを付けた。4つのオルガノイドエンティティすべてにおいて、小さなプラスミドは、より大きなプラスミドよりも高い効率でトランスフェクションされた。小さなプラスミドの最も効率的なトランスフェクションは、92.1%GFP陽性細胞を有するPDACオルガノイドで到達した、 大きなプラスミドは46.7%の効率でトランスフェクションされたのに対し、より大きなプラスミドは平均効率53.4%のCRCオルガノイドにトランスフェクトされ、小さなプラスミドは平均効率84.3%でトランスフェクションされたのが最も困難な組織は胃癌オルガノイドであった。、これは両方のプラスミドの最も低いトランスフェクション効率を実証した。

概念実証として、ヒト正常胃オルガノイドは、TP53を標的とするCas9、GFP、および2sgRNA用のプラスミドコードを用いて電気電解した。クローンはNutlin3投与により選択され、TP53ノックアウトは対立胞のシーケンシングによって確認された。ヒト胃オルガノイドで実証したように、効率的なエレクトロポレーションは、ノックアウトやノックインなどのオルガノイド培養物のCRISPR Cas9ベース操作を可能にするため、異なる疾患をモデル化することができます。