ペプチドおよびタンパク質定量を使用して自動免疫-MALDI (iMALDI)

この自動免疫MALDIアッセイの全体的な目標は、複雑な体液中のペプチドとインタクトタンパク質を正確かつ高感度に定量することです。この方法は、診断や治療に対する患者の反応のモニタリングのためのタンパク質レベルの定量化など、定量的プロテオミクス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、複雑なサンプルからタンパク質レベルを非常に高感度かつ正確に定量できることです。

この手法では、アッセイの免疫濃縮ステップにより、存在量が少ないタンパク質およびペプチドバイオマーカーの定量が可能になるため、疾患の早期診断が可能になります。この方法は血漿レニン活性に関する洞察を提供しますが、予後、診断、治療管理のためのがん関連タンパク質の定量化など、他の疾患関連研究にも適用できます。この手順を開始するには、ヒト血漿サンプルを室温の水浴で5分間解凍します。

次に、完全に解凍されるまでサンプルを氷の上に置きます。次に、各血漿サンプルの200マイクロリットルを、1.1ミリリットルの深さのウェルプレートの別々のウェルに手動で移します。プレートを摂氏2度、3,000rpmで10分間遠心分離します。

次に、Bravoを使用して、1マイクロリットルあたり500フェムトモールのAng-1 NAT標準溶液を連続希釈し、鶏卵白アルブミンを含む6つのキャリブレーター溶液を調製します。遠心分離後、各キャリブレータの200マイクロリットルをウェルにピペットで、125マイクロリットルの生成バッファーをサンプルプレートにピペットで固定します。自動リキッドハンドリングシステムを使用して、125マイクロリットルの血漿上清または125マイクロリットルの鶏卵白アルブミン溶液を25マイクロリットルのアンジオテンシンI生成バッファーと新しい1.1ミリリットルのディープウェルプレートに混合します。

次に、溶液を96ウェルプレートに自動的に移し、溶液ごとに3回の繰り返しを行い、ウェルごとに34マイクロリットルの溶液を充填します。次に、プレートを摂氏37度で3時間インキュベートします。抗体とプロテインGビーズを標識するには、まず、あらかじめ調製した78 μリットルのビーズスラリーを1.5 mLのチューブに移します。

ビーズをPBSCで1ミリリットルの25%アセトニトリルで7回、1ミリリットルのPBSCで3回洗浄し、各洗浄の間に磁気スタンドを使用してビーズをペレット化します。ビーズを洗浄した後、ビーズを110マイクロリットルのPBSCに再懸濁し、110マイクロリットルの抗アンジオテンシンI抗体を添加します。ビーズと溶液をピペッティングで混合します。

その後、ビーズを室温で1時間インキュベートし、8rpmで回転させます。これに続いて、ビーズを1ミリリットルのPBSCで3回洗浄します。次に、ビーズを1, 100マイクロリットルのPBSCに再懸濁します。

次に、ビーズ溶液を96ウェルプレートに手動で移します。次に、Bravoにビーズを同じ96ウェルプレートに分注してもらいます。3時間のアンジオテンシンI生成期間の後、インキュベーションプレートを氷上に10分間置き、アンジオテンシンI.安定同位体標準ペプチドストック溶液をPBSバッファーで100倍に自動的に希釈します。

さらに、安定同位体標準ペプチド希釈液を96ウェルPCRプレートに自動的に分注します。希釈したペプチド溶液10マイクロリットルをインキュベーションプレートの各ウェルに移します。希釈したペプチド溶液を血漿サンプルまたは鶏卵白アルブミン溶液と混合します。

ビーズ溶液にサンプルまたは標準溶液をインキュベーションプレートに自動的に加え、混合します。1時間のインキュベート後、ビーズを5ミリモルの重炭酸アンモニウム溶液で3回自動的に洗浄します。洗濯のたびに磁石を使ってビーズを底に引っ張ります。

最後の洗浄後、10マイクロリットルの重炭酸アンモニウム溶液を各ウェルに追加して、ビーズを再懸濁します。7マイクロリットルのビーズスラリーを、スポットサイズ2, 600マイクロメートルのMALDIターゲットプレートに自動的に移します。ビーズが乾燥したら、あらかじめ調製したHCCAマトリックス溶液2マイクロリットルをマトリックスウェルからターゲットプレートの各サンプルスポットに自動的に加えます。

これに続いて、ポジティブリフレクターモードを使用してMALDI-TOF装置でサンプルスポットを分析します。内部キャリブレーション、データの平滑化、ベースラインの減算をベンダー固有のソフトウェアで実行します。アンジオテンシンIを測定するための自動化されたiMALDI手順により、日中の変動係数が10%未満の多数のサンプルのハイスループット分析が可能になりますヒト血漿サンプル中のアンジオテンシンIを測定することによって得られた代表的なスペクトルがここに表示されます。

ここでは、自動iMALDIアッセイで得られた188の患者サンプルのPRA値と、臨床LC-MS/MS手順を使用して得られたPRA値の相関を示します。2つの方法の相関係数は0.98であり、傾きの違いは、異なる内部標準または異なる抗体の使用によるものである可能性があります。ここには、アッセイの線形範囲とアッセイの精度が表示されます。

このテクニックを習得すると、約5時間で実行できます。この手順を試行するときは、チップヘッドと液体の取り扱い速度を適切に調整することを忘れないでください。この手順の後、経口塩負荷や生理食塩水注入試験など、患者の原発性アルドステロン症を確認するための追加の方法を使用できます。

自動化されたiMALDI技術により、疾患関連タンパク質またはペプチドについて、患者サンプルを含む生物学的サンプルの特異的かつ正確な高スループット定量的スクリーニングが可能になります。このビデオを見れば、質量分析ベースのタンパク質およびペプチド定量のための自動iMALDIアッセイの実行方法について十分に理解できるはずです。ヒトの血漿などの生物学的サンプルの取り扱いは非常に危険であり、手順を実行する際には常に必要な安全対策を講じる必要があることを忘れないでください。