Name: ペプチドおよびタンパク質定量を使用して自動免疫-MALDI (iMALDI) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶ自動免疫-MALDI（iMALDI）を用いたペプチド・タンパク質定量法。複雑な生物試料から低豊度バイオマーカーを高感度・高精度に測定し、早期診断や治療モニタリングに応用可能です。

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ゲノム技術革新ネットワーク (ジン) をゲノム カナダ、操作 (204PRO) および技術開発 (214PRO) のゲノム ブリティッシュ コロンビア州からの資金援助に感謝いたします。撮影用飛行時間測定器の使用のマギル大学健康センター研究所薬剤発見プラットフォームをありがちましょう。H.L. 国立科学工学研究協議会のカナダ (レベル) からポスドク研究員プログラムからサポートに感謝です。C.H.B は最先端基金基金 (葉っぱ) からのサポートに感謝しています。えざるはマギル大学 (モントリオール, ケベック州, カナダ) 分子腫瘍学のシーガル マギル椅子からのサポートに感謝します。M.X.C. とえざるがユダヤ人の総合病院 (モントリオール, ケベック州, カナダ) にウォーレン Y. ソーパー慈善信託とアルヴィン シーガル家族財団から支援に感謝。

下記試薬の量は 20 の患者血漿検体の測定に基づいています。プロトコルはビクトリア大学のガイドライン以下提示 &#39; s 人間研究倫理委員会.
 1 アン世代ひと血漿中私 <ol><li>血漿検体を解凍 (&#8805; 200 μ l) の部屋で温度水は 5 分のお風呂と、完全に解凍するまで氷の上にサンプルを置く。</li>。
	<li>1.1 mL ディープウェル プレート (サンプル プレート) の井戸を分離し、遠心分離機の 2 ° C および 1278 x g で 10 分間遠心でプレートに手動で各血漿サンプルの転送 200 μ l</li>
	<li>リキッドハンド リング システムを使用して、連続希薄と鶏卵白アルブミン 6 校正ソリューションを準備する 500 fmol/μ L Ang I NAT の標準溶液 (0.1、0.2、0.6、1.9 5.7, 17.2 fmol/μ L).</li>
	サンプル プレートに <li>世代のも、125 μ L を各キャリブレータのピペット 200 μ L バッファーします 。
	注: CEWA のリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) バッファーは実験の日に新たに作成される必要があります</li>。
	<li>リキッドハンド リング システムを使用して、新しいプレートのミックス プラズマの培養上清中の 125 μ L または 125 μ L の PBS の CEWA のアンの 25 μ L で私世代バッファー 1 M トリス、0.2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、1 mM を含む特異フッ化物 (PMSF). 
	注: 準備、Ang 私 1 M トリス/0.2 mM EDTA 水系バッファーをミキシングによって生成バッファー (pH 5.5 に調整酢酸を使用して) そして PMSF ソリューション (メタノール 100 mM)。両方のソリューションで、実験の日に 4 ° c. のミックス 2 つのソリューションで 1 ヶ月格納できます</li>。
	<li>は、96 ウェル プレート、1 ソリューションにつき 3 複製、34 μ L/ウェルにソリューションを自動的に転送します。3 h の 37 ° C でプレートを孵化させなさい</li>
</ol> 2。アンの免疫強化私を使用して抗体をコートしたビーズ <ol><li>蛋白質 G 磁気ビーズに抗体の共役 注: ビーズを抗体の共役が 3 h アンの中に手動で実行される私の発生期、実験の日。その他の検体の共役ビーズ プロパティおよび抗体の安定性に応じて 3 ヵ月以上、4 ° C で 0.015% チャップス (きて) を含む PBS バッファーに格納することができるかもしれない。
	<ol><li>(20 のサンプルを測定し、6 点の標準曲線を作る十分な) ビーズ スラリーの転送 110 μ L 1.5 mL チューブに。ビーズ 7 回 1 mL 25% アセトニ トリル/きてときて 1 mL で 3 回洗います。各洗浄工程間ビーズをペレットにマグネット スタンドを使用します。最後のワシントン州後に洗浄バッファーを削除 
		注意: 洗浄 7 回 25% アセトニ トリル/きてはビーズ スラリー、Tween 20 MS 互換性のない添加物を除去するため重要です。選択したビーズではこのような添加剤は、この広範な洗浄工程必要がありますできません</li>。
		<li>きて、110 μ のビードを再停止しなさい、反中央の 110 μ L を追加私抗体 (最終的な抗体濃度: 100 μ g/mL)。ミックス ビーズとソリューションをピペッティングと、それらを 8 rpm で回転、1 時間室温でインキュベートします</li>。
		<li>3 回きて、1 mL でビーズを洗ってきて 1100 μ で再懸濁します 。
		注: 場合はビード ソリューションは、インキュベーション中にチューブのキャップに流れ込んできた、スピンダウン 2680 x g にベンチトップ遠心分離機を使用して、ソリューション</li>
		<li>は、96 ウェル プレート (ビーズ標準プレート) にビーズ ソリューションを手動で転送します。リキッドハンド リングの因数にシステム 120 μ L/ウェル同じ 96 ウェル プレートにビーズを使用して、</li></ol></li> <li>ビーズの免疫強化 <ol><li>後 3 h アン発生期培養プレートに。アン I. の生成を終了する 10 分の氷</li>
		<li>は自動的に SIS ペプチド原液 (10 pmol/μ L) を 100 倍希釈 PBS で、バッファーに格納し、自動的に更に因数 96 ウェル PCR プレートに安定した isoptope 標準的なペプチド希釈。培養プレートの各ウェルに 1.5 μ L (100 fmol 含む) 安定同位体標準 (SIS) ペプチド溶液を転送し、血漿検体または PBS バッファーで CEWA ミックスします</li>。
		<li>ビーズのソリューションは、ウェルあたり 10 mL に培養プレートの内容を転送、ミックスを自動的にします</li>。
		<li>1 h 4 ° C でプレートを 8 回転で回転させながらインキュベートします</li>。
		<li>ビーズにて 3 回洗浄自動的に 5 mM 重炭酸アンモニウム (アンビック) ソリューションでは、100 μ L/ウェル洗浄あたり。最後の洗浄後 5 mM 各ウェルに碧のソリューションの 7 μ L でビーズを再懸濁します。最後のワシントン州の後下部にビーズをプルする磁石を使用</li>
	</ol></li></ol> 3。MALDI ターゲット プレートと追加するマトリックス ソリューションにビーズの転送 <li>2,600 のスポット サイズと MALDI ターゲット プレートの上に自動的にビーズ スラリーの転送 7 μ <ol>μ m。ビーズが乾くみましょう 。
	注: 小型 USB 電源ファンはビーズ乾燥過程を加速するため使用できます</li>。
	<li>は自動的に α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (HCCA) の 2 μ L を追加-各サンプル ターゲット プレート上のスポットにはうまく行列から行列ソリューション (3 mg/mL HCCA、クエン酸アンモニウム 1.8 mg/mL、70% アセトニ トリル、0.1% トリフルオロ酢酸を含む).</li>
</ol> 4。MALDI TOF MS とデータ解析による買収を信号 正反射モードを使用して MALDI-TOF 楽器 <ol><li>分析サンプル スポット。内部校正、データの平滑化、およびベンダー固有のソフトウェアで自動的に基線の減算を実行します 。
	注: (正/負、線形/リフレクター) 選択したモード MALDI-TOF 測定対象のペプチッドまたは蛋白質によって異なります</li>。
	<li>相対応答比 (Nat/SIS 強度比) を計算して、アンの私を決定する標準的なカーブに各サンプルの濃度を比較すること。計算式 (1) を使用して、プラ Δt アン私世代 Ang i. の生成に使用される時刻を表す 
	プラ = [アン私]/Δt アン私世代 (1)</li></ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li>
<li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+J+%22Chemical+Genomics+and+Proteomics%3A+Reviews+and+Protocols%22">Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols</a>. Zanders, E. D. , Humana Press. 227-240 (2012).</li>
<li>Yergey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+sequencing+of+peptides+using+MALDI%2FTOF-TOF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).</li>
<li>Anderson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+decades+searching+for+meaning+in+the+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Six decades searching for meaning in the proteome.</a> J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).</li>
<li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li>
<li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li>
<li>Razavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+SISCAPA+Quantitation+of+Peptides+from+Human+Plasma+Digests+by+Ultrafast%2C+Liquid+Chromatography-Free+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).</li>
<li>Anderson, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SISCAPA+Peptide+Enrichment+on+Magnetic+Beads+Using+an+In-line+Bead+Trap+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).</li>
<li>Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+clinical+proteomics+-+a+review+and+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective.</a> The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).</li>
<li>Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+Development+of+an+Immuno+MALDI+%28iMALDI%29+Mass+Spectrometry+Assay+for+the+Diagnosis+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).</li>
<li>Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexed+iMALDI+for+the+detection+of+angiotensin+I+and+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II.</a> Methods. 56 (2), 213-222 (2012).</li>
<li>Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+immuno-MALDI+%28iMALDI%29+assay+for+angiotensin+I+and+the+diagnosis+of+secondary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension.</a> Clin. Proteomics. 10 (1), 20(2013).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+EGFR+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li>
<li>Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Immunoaffinity+Tandem+Mass+Spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+Detection+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+chimica+acta%22%5BJournal%5D)">An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis.</a> Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).</li>
<li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+%28iMALDI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li>
<li>Schoenherr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+monoclonal+antibodies+for+SISCAPA+assays+using+a+magnetic+bead+processor+and+liquid+chromatography-selected+reaction+monitoring-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry.</a> J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , US 7846748 B2 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , CA 2507864 C (2011).</li>
<li>Weiß, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li>
<li>Nelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+fragments%3A+Hope+and+hype%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Antibody fragments: Hope and hype.</a> mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS%3A+PCSK9+as+an+example+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li>
</ol>

C.H.B は、iMALDI 技術の特許を保持しています。

従来の MS を用いたタンパク質定量と比較して、iMALDI は、分析検体を豊かにし、したがって、それはタンパク質またはペプチド低濃度を定量化することが可能、複雑なサンプルからそれらを浄化する抗体を使用します。IMALDI プロトコルの重要なステップは、ターゲット ペプチドの免疫強化です。このため、高い特異性と親和性の抗体を選択してください。SISCAPA、内 10-9 M 以上で抗体の親和性が低い ng/mL21で高感度を達成するために必要になることが報告されています。さらに、高い抗体結合能とビーズは最適な濃縮に適しています。
また、比較的「クリーン」最小限のバック グラウンド レベルと標的分子スペクトルを生成することが重要です。高い信号対雑音比は、豊富なビーズ免疫濃縮のステップの後の洗浄で実現できます。また、我々 はその後追加しマトリックス ソリューションを乾燥することができますノイズ信号を大幅に削減し、信号対雑音比を向上させるターゲット板にビード スポットを洗浄を発見しました。
<p class="...

質量分析法による定量的プロテオミクスにおける必要不可欠なツールとなっています。質量分析法は、ターゲット蛋白質またはペプチッドの固まりを判断できます、したがって得られた試料信号することができます非常に具体的イムノアッセイと比較しています。エレクトロ スプレーと MALDI は、2 つのイオン化方法は、タンパク質・ ペプチド1,2,3、4を検出するためによく使用されます。MS を用いたタンパク質定量における大きな課題は、高豊富な蛋白質の存在下で ng/mL または pg/mL の濃度で複雑な試料中の低豊富なタンパク質の検出、ひと血漿中発見多く候補蛋白質バイオ マーカーこれの範囲の5を実行します。この問題は、本質的に広いダイナミック レンジおよび人間の proteome6の複雑さが主原因です。
ターゲット蛋白質または固体表面上にサンプル ソリューションからペプチドを豊かにする方法が免疫 MS 検出課題を克服するために開発されて、検体と MS 測定7,8の溶出順,9,10します。 複雑なサンプルから濃縮、免疫を介して、検体を精製し、他の分子からイオン抑制効果を最小化するため。固体の様々 なサポートの中では、扱いやすさと高い抗体結合能力の利点を有するので磁気ビーズは最も広く使用現在。別の functionalizations とサイズの磁気ビーズを開発し、免疫沈降実験のため商品化します。日には、ビーズに免疫強化をエレクトロ スプレー イオン化 (ESI) と MALDI MS タンパク質およびペプチドの測定のためインターフェースされてが。安定同位体標準および抗ペプチド抗体 (SISCAPA) 技術による捕獲は、免疫強化のための抗体をコートしたビーズと孵化によって続いて、試料中のタンパク質は消化されます。「古典的な」SISCAPA でキャプチャ proteotypic ペプチドが、ビーズから溶出し、測定による液体クロマトグラフィー-MS (LC-MS)、または直接注入 ESI 複数反応モニタリング MS (ESI MRM MS)11,12。免疫強化は、ng/mL の低範囲13に達する 3-4 桁 MRM アッセイ感度を向上します。
エレクトロ スプレー MS と比較して、MALDI MS の高速、かつを含まない洗浄と LC カラムの再平衡持ち越しと汚染の問題がないのでより高スループット研究14に適しています。ペプチッドおよび蛋白質 (proteotypic ペプチドの定量に基づく) の特異的かつ高感度定量 MALDI MS と免疫強化を結合する当研究室で開発した免疫 MALDI 技術15,16 ,17。免疫濃縮後 MALDI ターゲット プレートにビーズを堆積、マトリックス ソリューション ビーズに追加されます、乾燥後プレートは MALDI TOF MS による分析の準備ができて。ビーズからペプチドの溶出は別のステップとして実行されませんが、アフィニティ バインド analytes は MALDI のマトリックス ソリューションによって溶離されるビード スポット、サンプル準備を簡素化し、サンプルの損失を最小限に抑えることに追加するとき。IMALDI 技術適用されているさまざまなアプリケーション18,19で、最近自動化されアンジオテンシンを測定するために使用私 (Ang 私) 血漿レニン活性 (PRA)20を決定します。このプロトコルは、自動 iMALDI 分析を実行するための手順を説明します。例については、10% 未満の間日 CVs としてプラ アッセイを取って日20あたり 744 のサンプルを測定する機能を備えた、自動化によって達成されています。
本稿で示した iMALDI プラ アッセイはターゲット分子としてのタンパク質消化を必要としない (アン私) 1295.7 Da の分子量のペプチドです。C とそれを簡単に区別できるように 800 Da 以上の質量を持つ、ターゲット蛋白質に固有にする必要があります iMALDI の選択したペプチドその他試金蛋白質消化が必要あり、ペプチドはそのまま蛋白質の代理として使用される、MALDI のマトリックス ソリューションから 2・3 のノイズ。抗ペプチド抗体、ペプチドの免疫強化に必要です。PRA を測定 iMALDI 試金のためのプロトコルは 4 つのステップで構成されています: 1) アンの世代人間プラズマで2) 免疫-豊かなアンの私は抗体をコートしたビーズ; を使用して3) ビーズの MALDI ターゲット プレートと追加するマトリックス ソリューションへの転送・ 4) 信号集録 MALDI TOF MS とデータ解析20。

<table><tbody><tr><td>健康制御 ヒト血漿</td><td>バイオレクラメーション</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸アンモニウム二塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (>=98%)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>鶏卵白からのアルブミン (>98%)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフッ化物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>85172</td><td>LC-MS グレード</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フルーカ</td><td>34967</td><td>LC-MS グレードの</td></tr><tr><td>水</td><td>フルーカ</td><td>39253</td><td>LC-MS グレードの</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フルーカ</td><td></td><td>320099 LC-MS グレードの</td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン</td><td>ロシュ ダイアグノスティック 3118169001 ダイアグノビーズ ダイアグノ</td>スティックス <td>ダイ</td><td></td>ア</tr>グノスティック <tr><td>ダイアグナイズ プロテイン G 磁気ビーズ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10003D</td><td>2.8 &mu;m, 30 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-Ang I ヤギポリクローナル抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>NatおよびSIS Ang I</td> ビクトリア<td>大学で合成-ゲノム BCプロテオミクスセンター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動リキッドハンドリングシステム</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>Agilent Bravo ロボットワークステーション</td></tr><tr><td>マグネット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12321D</td><td>Invitrogen DynaMag-2 マグネット</td></tr><tr><td>チューブ ローテーター</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>ラボクエイク チューブ ローテーター</td></tr><tr><td>マグネット</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>12027</td><td>DynaMag-96 サイドスカートマグネット</td></tr><tr><td></td><td>マグネット VP サイエンティフィック</td><td>771RM-1</td> ビーズ<td>を井戸の底に引っ張るために使用されます</td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Bruker Bruker</td><td></td><td>Microflex LRF 機器</td></tr></tbody></table>

ペプチドおよびタンパク質定量を使用して自動免疫-maldi (imaldi)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

質量分析 (MS) は、各ターゲット分子の質量電荷比の直接検出の結果として優秀なアッセイの特異性と複雑な試料中のタンパク質を定量化するための最も一般的に使用される技術の一つです。しかし、他のほとんどの分析技術のような MS ベースのプロテオミクスは高豊富な検体を測定への偏り、検出限界は低い ng/mL のまたは pg/mL で複雑なサンプル、およびこれは多くの濃度範囲を達成するために困難ですのでひと血漿など生体の疾患関連蛋白質。低豊富な検体の検出を支援するには、免疫強化を集中し、MS の測定、アッセイの感度が大幅に向上する前に検体を浄化するアッセイに統合されています。この作品で、免疫-マトリックス レーザー脱離イオン化 (iMALDI) 技術がタンパク質及びペプチドの生体の定量化のために提示はビーズに免疫強化に基づく、事前の溶出なし MALDI MS 測定が続きます。抗ペプチド抗体は磁気ビーズの官能基化、サンプルと孵化させます。洗浄後、ビーズは MALDI ターゲット プレート上に直接転送し、マトリックス ソリューションがビーズに適用された後、飛行 (MALDI-TOF) 計器の MALDI 時間は信号を測定します。その他免疫 MS の試金に比較サンプルの準備の手順を簡略化し、MALDI の測定は高速。改善された分析の再現性と高スループット処理システム、液体全体サンプル準備が自動化されます。この記事で iMALDI 試金はペプチド アンジオテンシンを決定するため使用される私 (Ang 私) 原発性アルドステロン症 (PA) のスクリーニングのため血漿レニン活性の読み出しとして臨床的に使用されている血漿中濃度。

アンを測定するための自動 iMALDI 手順は図 1にされます。ターゲット ペプチド (内因性ペプチドまたは消化タンパク質由来のペプチド)、抗ペプチド磁気ビーズの濃縮し、MALDI 測定用ターゲット プレートにビーズを転送するし。追加ペプチド溶出のステップを必要とする他の免疫 MS 技術と比較して、全体の手順を簡略化します。IMALDI アッセイの自動化は、間日係数の変化 (CV) 10 20%以下のサンプルの多数の高いスループット分析のためことができます。アンを測定することによって得られる代表的なスペクトルひと血漿サンプルでは図 2のとおりです。SIS ペプチド ペプチド定量用内部標準物質として機能します。臨床 LC ・ MS/MS 手順17を使用して取得された PRA 値で自動 iMALDI 試金で得られた 188 患者サンプルから PRA 値の相関は<s...

自動免疫 MALDI (iMALDI) 技術を使用して複雑な体液でプロテインの定量のためのプロトコルが表示されます。

ペプチドおよびタンパク質定量を使用して自動免疫-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

この自動化イムノMALDIアッセイの全体的な目的は、複雑な生物学的流体中のペプチドおよび完全なタンパク質を、正確かつ高感度に定量することです。この手法は、診断のためのタンパク質レベルの定量や、患者の治療反応のモニタリングなど、定量プロテオミクス分野における重要な課題を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、複雑な試料からタンパク質レベルを非常に高感度かつ正確に定量できる点にあります。この手法では、アッセイの免疫濃縮ステップによって低発現のタンパク質およびペプチドバイオマーカーの定量が可能となるため、疾患の早期診断が可能です。本法は血漿レニン活性に関する知見を提供できるだけでなく、予後、診断、および治療管理のための癌関連タンパク質の定量など、他の疾患関連研究にも応用できます。本手順を開始するには、ヒト血漿サンプルを室温の水槽で5分間解凍してください。次に、完全に融解するまでサンプルを氷上に置きます。続いて、各血漿サンプル200 microlitersを、1.1 milliliterディープウェルプレートの別々のウェルに手動で分注します。プレートを2 °C、3,000 rpmで10分間遠心分離します。次に、Bravoを用いて500 femtomole per microliterのAng-1 NAT標準溶液を連続希釈し、鶏卵白蛋白を用いて6種類のキャリブレーター溶液を調製します。遠心分離後、各キャリブレーター200 microlitersとジェネレーションバッファー125 microlitersをサンプルプレートのウェルにピペッティングします。自動液体分注システムを用いて、血漿上清125 microlitersまたは鶏卵白蛋白溶液125 microlitersを、新しい1.1 milliliterディープウェルプレート内でアンジオテンシンIジェネレーションバッファー25 microlitersと混合します。次に、各溶液を96ウェルプレートに自動的に分注します。1溶液につき3連（triplicate）で、1ウェルあたり34 µLずつ分注してください。その後、プレートを37 °Cで3時間インキュベートします。抗体をProtein Gビーズに結合させるには、まず、あらかじめ調製したビーズスラリー78 µLを1.5 mLチューブに移します。磁気スタンドを用いて各洗浄の間にビーズをペレット化しながら、PBSC中の25%アセトニトリル1 mLで7回、次いでPBSC 1 mLで3回、ビーズを洗浄します。洗浄後、ビーズを110 µLのPBSCに再懸濁し、110 µLの抗アンジオテンシンI抗体を加えます。ピペッティングによりビーズと溶液を混合します。次に、ビーズを8 rpmで回転させながら室温で1時間インキュベートします。その後、1 mLのPBSCでビーズを3回洗浄します。最後に、ビーズを1,100 µLのPBSCに再懸濁します。次に、ビーズ溶液を96ウェルプレートに手動で移します。その後、Bravoを用いてビーズを同じ96ウェルプレートに分注します。3時間のアンジオテンシンI生成期間の後、インキュベーションプレートを氷上に10分間置いて、アンジオテンシンIの生成を停止させます。安定同位体標準ペプチドストック溶液を、PBSバッファーで自動的に100倍希釈します。さらに、安定同位体標準ペプチド希釈液を96ウェルPCRプレートに自動的に分注します。希釈したペプチド溶液を10 µLずつインキュベーションプレートの各ウェルに移します。希釈ペプチド溶液を血漿サンプルまたは鶏卵白蛋白溶液と混合します。サンプルまたは標準溶液をビーズ溶液に自動的に添加してインキュベーションプレートに移し、混合します。1時間インキュベートした後、5 mM 重炭酸アンモニウム溶液でビーズを自動的に3回洗浄します。各洗浄後、磁石を使用してビーズを底に集めます。最後の洗浄後、各ウェルに10 µLの炭酸水素アンモニウム溶液を加え、ビーズを再懸濁します。ビーズ懸濁液7 µLを、スポットサイズ2,600 µmのMALDIターゲットプレートに自動的に分注します。ビーズが乾燥した後、マトリックスウェルからあらかじめ調製したHCCAマトリックス溶液2 µLを、ターゲットプレート上の各サンプルスポットに自動的に添加します。その後、ポジティブリフレクターモードを用いたMALDI-TOF装置でサンプルスポットを分析します。ベンダー提供のソフトウェアを使用して、内部校正、データのスムージング、およびベースライン減算を行います。アンジオテンシンIを測定するための自動iMALDI手順により、日内変動係数10%以下という高い精度で、多数のサンプルのハイスループット分析が可能です。ここでは、ヒト血漿サンプル中のアンジオテンシンIを測定して得られた代表的なスペクトルを示します。自動iMALDIアッセイにより得られた188例の患者検体のPRA値と、臨床的なLC-MS/MSの手法を用いて得られたPRA値との相関をここに示します。これら2つの手法の相関係数は0.98であり、傾きの差は、異なる内部標準または異なる抗体を使用したことに起因すると考えられます。本アッセイの直線性と精度をここに示します。この手法に習熟すれば、約5時間で実施可能です。本手順を行う際は、チップヘッドと液体ハンドリング速度を適切に調整してください。本手順の後、経口食塩負荷試験や生理食塩水注入試験などの追加手法を用いて、患者の原発性アルドステロン症を確認することができます。自動化されたiMALDI法を用いることで、患者検体を含む生物学的試料から、疾患関連タンパク質やペプチドを高スループットかつ特異的、正確に定量スクリーニングすることが可能です。このビデオを視聴することで、質量分析に基づいたタンパク質およびペプチド定量のための自動iMALDIアッセイの実施方法を十分に理解できるはずです。ヒト血漿などの生物学的試料の取り扱いは極めて危険であるため、手順の遂行中は常に必要な安全上の予防措置を講じてください。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

安定同位体の標準と抗ペプチド抗体（SISCAPA）によって、それぞれのタンパク質の代用物としてのペプチドの定量的な測定を提供するために、安定同位体希釈質量分析法（MRM -...

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

我々は、ヒト血清からの低分子量タンパク質およびペプチドの選択的回収のためのメソポーラスシリカ薄膜に基づいて技術を開発しました。私たちのメソポーラスチップの物理化学的性質を細かくペプチド濃縮の実質的な制御を提供し、その結果、診断のため血清プロテオームのプロファイリングをするように調整されました。...

バイオマーカー探索のためのメソポーラスシリカ薄膜の低分子量蛋白質の濃縮

還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。...

安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

このプロトコルは、選択された反応モニタリングを使用して、複雑な生物学的サンプル内の標的タンパク質の絶対定量アッセイを実行する方法を説明しています。これは、マウスマクロファージ走化性シグナル伝達経路のタンパク質を正確に定量するために使用されました。標的ペプチドの選択、アッセイ開発、定性的および定量的アッセイについて詳しく説明します。...

絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

ここでは、高解像度 (〜 30,000) の MS モノクローナル抗体のスパイク ペプチド水準の定量化のためのペプチド断片の検出続くペプチド前駆体のイオン移動度分離と相まってガスクロマト...

液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ

ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織サンプルに興味の蛋白質を定量化するための手段として画像解析と相まって蛍光組織学を検証する定量的免疫ブロットの使用について述べる。ルーチン生検試料中のバイオ マーカー...

ルーチン組織試料中のバイオ マーカー タンパク質を定量化するため, 蛍光抗体法を検証するための標準として細胞の定量的免疫ブロット

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。...

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。...

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

前駆体同位体標識とアイソバリックタグ(cPILOT)は、利用可能なアイソバリックタグで同時に分析できるサンプル数を増やすことができる、強化されたサンプル多重化戦略です。ロボットプラットフォームの組み込みにより、実験のスループット、再現性、定量的精度が大幅に向上しました。...

組み合わせ前駆体等位同位体ラベリングとアイソバリックタギング(cPILOT)を使用した自動サンプル多重化

ここでは、高品質な免疫ペプチド化データを提供するマウスおよびヒト細胞株からのMHCクラスIおよびクラスIIペプチド複合体の精製プロトコルを提示する。プロトコルは、市販の抗体を使用したサンプル調製に焦点を当てています。...

免疫ペプチドミクス:マウスとヒトMHCクラスI-およびII関連ペプチドの分離による質量分析

ここでは、さまざまな細胞タイプの細胞表面プロテオームの特性評価のためのプロテオミクスワークフローについて説明します。このワークフローには、細胞表面タンパク質の濃縮、その後のサンプル調製、LC-MS/MSプラットフォームを使用した分析、および専用ソフトウェアによるデータ解析が含まれます。...

細胞表面プロテオームのラベルフリー定量のための「Cell Surface Capture」ワークフロー

学ぶ自動免疫-MALDI（iMALDI）を用いたペプチド・タンパク質定量法。複雑な生物試料から低豊度バイオマーカーを高感度・高精度に測定し、早期診断や治療モニタリングに応用可能です。

ペプチドおよびタンパク質定量を使用して自動免疫-MALDI (iMALDI)

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