Ivacaftor、主要な代謝産物および嚢胞性線維症患者の体液中の Lumacaftor の臨床サンプルの高スループット分析のための最適化された LC-MS/MS 法

これは血漿アッセイの試料調製プロトコルです。完全性を確保するため、すべての試料および標準物質は、採取および処理中に2～8°Cで保持してください。取り扱いが完了したら、すべての試料を-20°Cで保存してください。

標準試料の調製には、各アニリド、ivacaftor、M1代謝物、M6代謝物、およびlumacaftorについて、100 µg/mLおよび10 µg/mLの濃度でメタノールを用いて独立したストック溶液を2種類ずつ調製します。なお、これらの化合物はベンチトップでの保存期間が10日間であることに注意してください。標準試料として、100 µLのヒト血漿を1.5 mLポリプロピレン製マイクロ遠心チューブに移します。

他のすべてのサンプルに対しても同様の操作を続けてください。その後、各チューブに内部標準物質を加えます。例えば、調製した標準溶液から0.01 µg/mLを選択します。

これで、このチューブには内部標準物質を添加した血漿が入りました。他のすべての標準試料についても同様の手順で進めてください。標準試料を遠心分離機にかけ、数秒間スピンダウンして、すべての液体がチューブの底に集まっていることを確認します。

これを40個すべての標準試料に対して同様に行います。患者検体については、患者検体チューブから100 µLをマイクロ遠心チューブに移します。実際の患者検体には内部標準物質は添加されていません。

患者試料を数秒間遠心分離し、すべての液体がチューブの底に集まっていることを確認します。次の手順は、試料と標準品の両方に共通して行います。血漿タンパク質を沈殿させるため、各試料チューブに0.1% formic acidを含むacetonitrileを200 µL加えます。

すべての標準試料および患者検体に対して同様の操作を繰り返します。各試料を約15秒間激しくボルテックスします。すべての標準試料および実検体についても同様に操作してください。

沈殿を促進させるため、冷蔵庫内に10分間静置します。デモンストレーションのため、ここではサンプル1つと標準品1つのみを遠心分離します。Eppendorf Centrifuge 5430を用い、4°C、10,000 rpmで10分間遠心分離を行います。

次に、上清をPhenomenex製バイアルにろ過します。ここでは、米国で購入した0.45 µmナイロン膜の13 mmシリンジフィルター（Grace社製）を使用し、1.5 mL容量のHPLCバイアルにろ過します。ろ過後、上清100 µLをLC/MS分析用のLC/MSバイアルに移します。

これでサンプルの分析準備が整いました。すべてのサンプルをバイアルラックに入れてください。本手順では、トリプル四重極質量分析計を接続したShimadzu 8030 LC/MSシステムを使用しています。

分析前にシステムを平衡状態にします。約15分後に平衡状態に達したら、Startボタンを押してください。各代謝物について、アニリドのピーク面積比を検量標準物質の公称濃度に対してプロットし、検量線を作成します。

検量線の回帰式を用いて、実試料中のアニリド濃度を算出します。代表的なクロマトグラムをこの図に示します。Phenomenex Kinetex C8カラムを用い、100%アセトニトリルと0.1%ギ酸水溶液を移動相とした勾配溶出により、最適化されたクロマトグラフィー分離能が得られました。

LC保持時間は以下の通りであった。M6は1分、M1は1.3分であった。

Ivacaftorでは1.55分、lumacaftorでは2.3分であった。すべてのブランク血漿試料において、いずれのアニリドの保持時間に対する干渉は認められず、ivacaftorとlumacaftorの組み合わせによる干渉も検出されなかった。

大量の患者検体のハイスループット分析を通じて、我々は既報の手法を最適化し、従来のアイソクラティック溶出の代わりに、より小さな孔径の逆相クロマトグラフィーカラムであるPhenomenex C8カラムとグラジエント溶媒システムを採用しました。これにより、洗浄工程を含めた1検体あたりの分析時間を6分に短縮しました。この信頼性が高く斬新な手法は、生体試料中のivacaftorおよびivacaftor-lumacaftor併用療法の治療薬物モニタリングに対する、簡便かつ高感度で迅速なアプローチを提供します。

薬効を最大化し、同時に医療コストを抑制するための曝露量-反応関係を構築する必要があるため、CF（嚢胞性線維症）患者に対するエビデンスに基づいた治療およびハイスループット分析手法を臨床医が活用できるよう、より感度の高いツールの開発と検証が求められています。提案された分析法を臨床的な薬物動態および薬力学研究に適用することで、より大規模な患者集団において、ivacaftorまたはivacaftor-lumacaftor併用療法の薬物動態パラメータをさらに詳細に調査することが可能になります。