Ivacaftor、主要な代謝産物および嚢胞性線維症患者の体液中の Lumacaftor の臨床サンプルの高スループット分析のための最適化された LC-MS/MS 法
2017年10月15日
Ivacaftor と ivacaftor lumacaftor の組み合わせは、2 つの新しい CF 薬です。ただし、まだ自分の PK/PD と薬理学の理解の不足があります。Ivacaftor 主要な代謝物と lumacaftor の同時解析のために最適化された HPLC MS 技術を提案します。
これは、血漿アッセイのサンプル調製のためのプロトコルです。その完全性を確保するために、すべてのサンプルと標準試料は、収集および処理中に摂氏2〜8度に保つ必要があることに注意してください。取り扱いが完了したら、すべてのサンプルをマイナス20度で保管します。
標準的な調製では、各アニリド、イバカフトール、M1代謝物、M6代謝物、およびルマカフトールの2つの独立した原液をメタノール中に100マイクログラム/ミリリットルおよび10マイクログラム/ミリリットルで調製します。コンパウンドはベンチトップで10日後に有効期限が切れることに注意してください。標準試料としては、100マイクロリットルのヒト血漿を1.5ミリリットルのポリプロピレン製微量遠心チューブに移します。
他のすべてのサンプルについても、この操作を続けます。次に、各チューブに内部標準を追加します。たとえば、準備された標準から0.01マイクログラム/ミリリットルを選択します。
現在、このチューブには内部標準がスパイクされた血漿が含まれています。他のすべての標準では、このように進めます。スタンダードを取り、数秒間回転させて、すべての液体がチューブの底にあることを確認します。
40の基準すべてに対してこれを続けます。患者サンプルについては、患者サンプルチューブから100マイクロリットルをマイクロ遠心チューブに移します。実際の患者サンプルには内部標準がスパイクされていません。
患者サンプルを数秒間回転させ、すべての液体がチューブの底にあることを確認します。次のステップは、サンプルと標準の両方に対して設計されています。アセトニトリル中の0.1%ギ酸を200マイクロリットルを各サンプルチューブに加えて、血漿タンパク質を沈殿させます。
すべての標準試料と患者サンプルについて、引き続きこの作業を行います。各サンプルを約15秒間激しくボルテックスします。すべての標準試料と発生したサンプルについて、この操作を続けます。
降水を促進するために冷蔵庫で10分間放置します。デモンストレーションの目的で、1つのサンプルと1つの標準のみを遠心分離します。私たちは、エッペンドルフ遠心分離機5430で10分間、10、000rpmで4度で遠心分離しています。
次に、上清をPhenomenexバイアルにろ過します。このために、米国から購入した0.45マイクロメートルのナイロングレースフィルターを備えた13ミリメートルシリンジフィルターを使用し、1.5ミリリットルを含むことができるHPLCバイアルにろ過しています。ろ過後、100マイクロリットルの上清をLC/MSバイアルに移し、LC/MS分析を行います。
これで、このサンプルを解析する準備が整いました。あとは、すべてのサンプルをバイアルラックに入れるだけです。島津製作所の8030 LC/MSシステムとトリプル四重極質量分析計を組み合わせて使用しています。
分析する前にシステムを平衡化させます。平衡化が完了したら(約15分かかります)、スタートボタンを押すだけです。各代謝物について、アニライドのピーク面積比とキャリブレーション標準の公称濃度をプロットして、検量線を作成します。
検量線の回帰式を使用して、発生したサンプル中のアニライドの濃度を計算します。この図に典型的なクロマトグラムを示します。100% アセトニトリルと 0.1% ギ酸の移動相を水に溶かし、Phenomenex Kinetex C8 カラムでグラジエント溶出を行った場合、クロマトグラフィー分離能の最適化が得られました。
LC保持時間は以下の通りである。M6の場合は1分。M1の場合、1.3分。
ivacaftorの場合、1.55分。lumacaftorの場合、2.3分。すべてのブランク血漿サンプルにおいて、いずれのアニライドの保持時間にも干渉は観察されず、イバカフトールとルマカフトールの組み合わせによる干渉も検出されませんでした。
大量の患者サンプルのハイスループット分析を通じて、現在のアイソクラティック溶出の代わりに、より小さなポアサイズの逆相クロマトグラフィーカラムであるPhenomenex C8カラムとグラジエント溶媒システムを使用して、報告された方法を最適化しました。これにより、洗浄段階を含め、サンプルあたりの分析時間が6分に短縮されます。この信頼性の高い新しい方法は、イバカフトールおよびイバカフトール-ルマカフトールの組み合わせおよび体液の治療薬モニタリングのためのシンプルで高感度かつ迅速なアプローチを提供します。
薬物の有効性を最大化し、医療費を抑えるために曝露と反応の関係を構築する必要があることを考えると、提案された分析方法を臨床薬物動態および薬力学研究に適用 CF.By 苦しむ患者に対して、臨床医がエビデンスに基づく治療およびハイスループット分析技術を使用するのを支援するために、より感度の高いツールを開発および検証する必要があります。イバカフトールの薬物動態学的パラメーターをさらに調査する機会が生じます。より大きな患者集団でのivacaftor-lumacaftorの組み合わせ。
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概要
この記事では、イバカフトルとその主要代謝物、およびルマカフトルの同時分析のための最適化されたHPLC-MS技術を紹介します。これらの新たな嚢胞性線維症治療薬の薬物動態と薬力学は十分に解明されておらず、分析方法の改善が必要であることを示しています。
主要な研究要素
科学の分野
- 薬理学
- 分析化学
- 嚢胞性線維症研究
背景
- イバカフトルとルマカフトルは嚢胞性線維症の新しい治療薬です。
- その薬物動態と薬力学については限られた知識しかありません。
- 薬物分析の最適化された方法は、その効果を理解するために不可欠です。
- HPLC-MSは薬物分析の強力な技術です。
研究の目的
- イバカフトルとルマカフトルを分析するための信頼性の高い方法を開発すること。
- イバカフトルとその代謝物の薬物動態を評価すること。
- 薬物相互作用と効果の理解を深めること。
使用された方法
- 血漿アッセイのためのサンプル調製。
- 制御温度でのサンプルの保管。
- メタノールでのストック溶液の調製。
- HPLC-MSの同時分析での使用。
主要な結果
- 最適化されたHPLC-MS技術の開発に成功しました。
- イバカフトルとその代謝物の分析が可能になりました。
- 薬物動態研究のための方法の信頼性が実証されました。
- 嚢胞性線維症治療薬の薬理学に関する洞察が得られました。
結論
- 最適化された方法は薬物挙動の理解に役立ちます。
- 薬力学の探索にはさらなる研究が必要です。
- 改良された分析技術は薬物開発にとって重要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accelerated pharmacokinetic profiling of CFTR modulators is critical for optimizing dosing regimens and understanding exposure-response relationships in cystic fibrosis. This high-throughput LC-MS/MS method enables rapid quantification of ivacaftor, its metabolites, and lumacaftor, supporting larger-scale clinical studies and de-risking translational development. Reduced analysis time from 15 to 6 minutes per sample enhances laboratory throughput, facilitating population PK/PD investigations and portfolio-level decision-making for CF therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise measurement of drug and metabolite concentrations to interrogate CFTR modulation mechanisms and pathway engagement.
- Operational Value: Provides reproducible quantitative outputs for assessing target exposure in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers sensitive, selective detection of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological matrices.
- Operational Value: Gradient elution on sub-2µm C8 column ensures chromatographic resolution and assay robustness for high-throughput workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports exposure-response modeling by generating reliable PK data from CF patient samples.
- Operational Value: Enables scalable sample processing for clinical PK studies, bridging discovery to clinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-translational continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and quantitative readouts for preclinical and clinical PK evaluation.
- Discovery Biology: Facilitates target engagement assessment through accurate metabolite profiling in biological systems.
- Screening: Ensures assay standardization and reproducibility for reliable compound evaluation across sample sets.
- Analytics: Provides peak area ratio-based quantification and calibration curves for precise concentration determination.
- Translational Research: Connects analytical output to clinical exposure metrics, enabling PK/PD correlation in patient populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform for CFTR modulator programs, reducing method redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in drug exposure assessment, reduction of PK uncertainty in CFTR modulator studies.
- Operational Value: High-throughput capability, method sensitivity, and rapid turnaround for large sample cohorts.
- Strategic Value: Informed go/no-go decisions based on exposure data, improved capital efficiency in clinical development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of CF drug candidates using robust PK/PD datasets.
Implementation Considerations
- Expertise in LC-MS/MS method development and biological sample handling.
- Access to triple-quadrupole mass spectrometry and gradient HPLC systems.
- Standardization of sample preparation, protein precipitation, and filtration protocols.
- Adaptation considerations for different biological fluids (e.g., plasma, sputum) and stability monitoring.
- Requirement for controlled storage conditions (−20°C) and fresh standard preparation within 10-day stability window.
