水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール
August 2nd, 2017
この研究は、共焦点イメージングモダリティの完全な利用を可能にする、厚い3次元組織断面分析のための新規な処理およびイメージングプロトコルを提示する。このプロトコールは抗原性を保持し、皮膚組織学および潜在的に他の組織型を分析するための堅牢なシステムを表す。
この組織学的およびイメージングプロトコルの全体的な目標は、皮膚のエピトール抗原性と構造的完全性を維持する堅牢なシステムを提示することです。これにより、共焦点イメージングモダリティを最大限に活用できます。この方法は、複雑な3次元組織構造内の任意のタイプの細胞の性質を調べる必要がある重要な質問に答えるのに役立ちます。標準的な組織学的手法と比較したこの技術の主な利点は、堅牢で実行が容易であることです。
さらに、このプロトコルは、共焦点顕微鏡での3次元分析を完全に補完します。まず、マウスの背側内側領域から採取した皮膚を長方形にトリミングします。各ピースは、クライオモールドの底に収まるようにサイズ設定する必要があります。
ここでは、22 mm x 30 mm x 20 mm のクライオモールドに収まる背側の皮膚の 1 平方センチメートルの領域を示しています。固定後、洗浄したスキンをOCT充填型の底に押し込み、底と同じ高さになるようにします。クライオスタットカットの向きを決定するため、クライオモールドで毛包の向きをマークします。
クライオブロックをマイナス80度の冷凍庫で金属板に移し、組織の浮遊や脱臼を防ぎます。目に見えない気泡が皮膚をクライオモールドの表面に浮かび上がらせる可能性があるため、凍結プロセスを監視して、クライオモールドの底でスキンの向きを維持します。まず、凍結したクライオブロックを、切片面に沿ったクライオモールドに示されているように、毛包の向きでクライオスタットのステージに固定します。
クライオスタット上での正確な毛包の向きを適切に調整することは、このステップが毛包の全長をそのままに皮膚スライスを生成する断面を決定するため、非常に重要です。クライオスタットを使用して、100ミクロンの切片を切断します。鉗子で埋め込まれた皮膚片の周りのOCTをつかみ、クライオスタットから切片をPBSで満たされた100ミリメートル培養に移します。
室温では、PBSはOCTを溶解し、鉗子で扱いやすい皮膚スライスを残します。切片化後、鉗子を使用して、浮遊皮膚切片を2.5ミリリットルのPBSを含む12ウェルプレートのウェルに移します。免疫蛍光標識を開始するには、まず500マイクロリットルのPBバッファーを標識した1.5ミリリットルの微量遠心チューブに添加します。
鉗子を慎重に使用して、12ウェルプレートからスキンスライスをチューブに移し、ブロッキングします。すべてのスキンスライスが完全に水没していることを確認してください。微量遠心チューブをシーソーロッカーに1分間10振動以下で、室温で1時間置きます。
各皮膚切片に1.5ミリリットルの微量遠心チューブを別々にラベル付けし、適切な量の一次抗体を含む500マイクロリットルのPBバッファーを追加します。1時間のブロッキング後、抗体を含む新たに調製したチューブに皮膚スライスを移します。スライスをロッカーで低速で摂氏4度で一晩インキュベー
トします。翌日、スライスを500マイクロリットルのPBSが入った1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、ロッカーで室温で1時間洗浄します。次に、スライスを、適切な濃度の二次抗体とDAPIを含む500マイクロリットルのPBバッファーを含む別々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。必要に応じて、室温で1時間ロッキングしながらインキュベートし、サンプルはさらに処理するまで摂氏4度で最大4日間保存できます。
イメージングに先立ち、皮膚切片を500マイクロリットルのPBSが入った別々の微量遠心チューブに移し、二次抗体とDAPIを洗浄します。次に、22ミリリットル×50ミリリットルのカバースリップを、解剖顕微鏡の下の暗い背景に置きます。次に、先端の端を切り取った1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、カバースリップに100%グリセロールの液滴を1滴加えます。
皮膚スライスを微量遠心チューブからグリセロール液滴に移します。次に、解剖顕微鏡を覗きながら、先のとがった鉗子を使用して、グリセロールに浮かんでいる間、それらを自然な形に戻すことにより、丸まった皮膚スライスを慎重にほどきます。スライスを不自然に矯正すると、組織に損傷を与える可能性があるため、無理に矯正しないでください。
セクションの全長が適切な向きになり、カバースリップ上で平らになったら。通常の顕微鏡スライドに組織をマウントすると、このステップにより皮膚スライスがさらにまっすぐになります。次の2日以内にグリセロールに取り付けられた皮膚切片をイメージしてください。
この画像は、インテグリン α 6 とインテグリン α 8 で標識された厚さ 10 ミクロンの古典的な皮膚凍結切片を示しており、表皮コンパートメントと腸毛筋をそれぞれ視覚化しています。この厚さ100ミクロンの3D組織断面も同様に標識しました。表示されている画像は、大きな z スタックの最大投影です。
ここでは、両方の画像の詳細を並べて比較しますが、古典的な凍結切片では、インテグリンα6で視覚化されたほとんどの毛包は全長に沿って切片化されておらず、水平全体のマウントと比較して、セクションごとに主に不完全な毛包が生成されました。無傷の毛包と無傷の直立筋は、古典的および水平のホームマウントセクションの両方で定量化されました。生物学的複製の1つの切片が定量化され、ここで見られるように、マウント切片全体で無傷の卵胞と直立筋の割合が高くなっています。
このクライオセクショニング技術を習得すると、毎分15切片以上の速度で実行でき、取り付けが正しく行われていれば、サンプルの向きを完璧に調整できます。このビデオを見れば、3次元環境で厚い組織断面を処理および分析する方法を十分に理解できるはずです。
概要
この研究は、共焦点イメージングモダリティを最大限に活用できる、厚い三次元組織断面解析のための新しい処理およびイメージングプロトコルを提示しています。このプロトコルは抗原性を保持し、皮膚組織学および他の組織タイプを分析するための堅牢なシステムを提示しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 組織学
- イメージング技術
- 共焦点顕微鏡
背景
- 標準的な組織学的技術は組織の構造的完全性を保持しない可能性があります。
- 共焦点イメージングは詳細な三次元分析を可能にします。
- 効果的な組織分析には堅牢なプロトコルが必要です。
- この研究はモデルとして皮膚組織に焦点を当てています。
研究目的
- 皮膚の抗原性と構造的完全性を維持するプロトコルを開発する。
- 複雑な三次元組織構造の分析を容易にする。
- 既存の組織学的技術を改良する。
使用された方法
- マウスから皮膚サンプルのトリミングと固定。
- クライオスタットを使用して組織を100ミクロンのスライスに切断。
- 一次および二次抗体による免疫蛍光ラベリング。
- 共焦点顕微鏡を用いた組織切片のイメージング。
主な結果
- 新しいプロトコルは毛包と毛立て筋の完全な可視化を可能にします。
- 全マウント切片は古典的な切片と比較して、より高い割合の完全な構造を示します。
- この技術は毎分15セクション以上を達成し、迅速に実行できます。
- 組織学における三次元分析の有効性を示しています。
結論
- このプロトコルは共焦点イメージングのための組織処理において重要な進歩です。
- 複雑な組織構造の研究能力を向上させます。
- 将来的には皮膚を超えて他の組織タイプにも応用される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Robust three-dimensional tissue imaging is critical for accurate target validation and mechanistic de-risking in early-stage dermatological and tissue biology research. The horizontal whole mount protocol enables high-fidelity visualization of intact skin microarchitecture, supporting predictive confidence in phenotypic and cellular analyses. This capability strengthens translational continuity from discovery through preclinical model development in skin and potentially other tissue systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular and structural targets within preserved three-dimensional tissue architecture.
- Supports biological de-risking by maintaining antigenicity and structural integrity for functional target validation.
- Improves predictive confidence in the assessment of mesenchymal and epithelial cell populations.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated thick tissue sections for downstream immunofluorescence and confocal imaging workflows.
- Enhances assay reproducibility and standardization by preserving intact tissue structures across samples.
- Provides quantitative outputs for intact hair follicles and arrector pili muscles, enabling reliable comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant tissue models by preserving complex skin microenvironments for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery imaging to preclinical validation of tissue-based endpoints.
- Reduces risk of artifactual findings by maintaining native tissue context in thick sections.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling high-content imaging and quantitative analysis of tissue architecture for target validation and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization of intact cellular structures.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for comparative studies and assay development.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as intact follicle and muscle counts for statistical analysis.
- Translational Research: Maintains disease-relevant tissue context for biomarker alignment and preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable to various tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-based studies.
- Operational Value: Streamlines sample preparation, enhances reproducibility, and supports high-throughput sectioning.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative imaging data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on high-quality tissue analysis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and immunofluorescent labeling for optimal results.
- Demands access to confocal microscopy and compatible analytical infrastructure.
- Benefits from cross-team standardization of sectioning and imaging protocols.
- Adaptable to other tissues with similar structural and antigenic preservation needs.
- Section thickness and orientation must be carefully controlled to ensure data consistency.
