水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

この組織学的およびイメージングプロトコルの全体的な目標は、皮膚のエピトール抗原性と構造的完全性を維持する堅牢なシステムを提示することです。これにより、共焦点イメージングモダリティを最大限に活用できます。この方法は、複雑な3次元組織構造内の任意のタイプの細胞の性質を調べる必要がある重要な質問に答えるのに役立ちます。標準的な組織学的手法と比較したこの技術の主な利点は、堅牢で実行が容易であることです。

さらに、このプロトコルは、共焦点顕微鏡での3次元分析を完全に補完します。まず、マウスの背側内側領域から採取した皮膚を長方形にトリミングします。各ピースは、クライオモールドの底に収まるようにサイズ設定する必要があります。

ここでは、22 mm x 30 mm x 20 mm のクライオモールドに収まる背側の皮膚の 1 平方センチメートルの領域を示しています。固定後、洗浄したスキンをOCT充填型の底に押し込み、底と同じ高さになるようにします。クライオスタットカットの向きを決定するため、クライオモールドで毛包の向きをマークします。

クライオブロックをマイナス80度の冷凍庫で金属板に移し、組織の浮遊や脱臼を防ぎます。目に見えない気泡が皮膚をクライオモールドの表面に浮かび上がらせる可能性があるため、凍結プロセスを監視して、クライオモールドの底でスキンの向きを維持します。まず、凍結したクライオブロックを、切片面に沿ったクライオモールドに示されているように、毛包の向きでクライオスタットのステージに固定します。

クライオスタット上での正確な毛包の向きを適切に調整することは、このステップが毛包の全長をそのままに皮膚スライスを生成する断面を決定するため、非常に重要です。クライオスタットを使用して、100ミクロンの切片を切断します。鉗子で埋め込まれた皮膚片の周りのOCTをつかみ、クライオスタットから切片をPBSで満たされた100ミリメートル培養に移します。

室温では、PBSはOCTを溶解し、鉗子で扱いやすい皮膚スライスを残します。切片化後、鉗子を使用して、浮遊皮膚切片を2.5ミリリットルのPBSを含む12ウェルプレートのウェルに移します。免疫蛍光標識を開始するには、まず500マイクロリットルのPBバッファーを標識した1.5ミリリットルの微量遠心チューブに添加します。

鉗子を慎重に使用して、12ウェルプレートからスキンスライスをチューブに移し、ブロッキングします。すべてのスキンスライスが完全に水没していることを確認してください。微量遠心チューブをシーソーロッカーに1分間10振動以下で、室温で1時間置きます。

各皮膚切片に1.5ミリリットルの微量遠心チューブを別々にラベル付けし、適切な量の一次抗体を含む500マイクロリットルのPBバッファーを追加します。1時間のブロッキング後、抗体を含む新たに調製したチューブに皮膚スライスを移します。スライスをロッカーで低速で摂氏4度で一晩インキュベー

翌日、スライスを500マイクロリットルのPBSが入った1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、ロッカーで室温で1時間洗浄します。次に、スライスを、適切な濃度の二次抗体とDAPIを含む500マイクロリットルのPBバッファーを含む別々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。必要に応じて、室温で1時間ロッキングしながらインキュベートし、サンプルはさらに処理するまで摂氏4度で最大4日間保存できます。

イメージングに先立ち、皮膚切片を500マイクロリットルのPBSが入った別々の微量遠心チューブに移し、二次抗体とDAPIを洗浄します。次に、22ミリリットル×50ミリリットルのカバースリップを、解剖顕微鏡の下の暗い背景に置きます。次に、先端の端を切り取った1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、カバースリップに100%グリセロールの液滴を1滴加えます。

皮膚スライスを微量遠心チューブからグリセロール液滴に移します。次に、解剖顕微鏡を覗きながら、先のとがった鉗子を使用して、グリセロールに浮かんでいる間、それらを自然な形に戻すことにより、丸まった皮膚スライスを慎重にほどきます。スライスを不自然に矯正すると、組織に損傷を与える可能性があるため、無理に矯正しないでください。

セクションの全長が適切な向きになり、カバースリップ上で平らになったら。通常の顕微鏡スライドに組織をマウントすると、このステップにより皮膚スライスがさらにまっすぐになります。次の2日以内にグリセロールに取り付けられた皮膚切片をイメージしてください。

この画像は、インテグリン α 6 とインテグリン α 8 で標識された厚さ 10 ミクロンの古典的な皮膚凍結切片を示しており、表皮コンパートメントと腸毛筋をそれぞれ視覚化しています。この厚さ100ミクロンの3D組織断面も同様に標識しました。表示されている画像は、大きな z スタックの最大投影です。

ここでは、両方の画像の詳細を並べて比較しますが、古典的な凍結切片では、インテグリンα6で視覚化されたほとんどの毛包は全長に沿って切片化されておらず、水平全体のマウントと比較して、セクションごとに主に不完全な毛包が生成されました。無傷の毛包と無傷の直立筋は、古典的および水平のホームマウントセクションの両方で定量化されました。生物学的複製の1つの切片が定量化され、ここで見られるように、マウント切片全体で無傷の卵胞と直立筋の割合が高くなっています。

このクライオセクショニング技術を習得すると、毎分15切片以上の速度で実行でき、取り付けが正しく行われていれば、サンプルの向きを完璧に調整できます。このビデオを見れば、3次元環境で厚い組織断面を処理および分析する方法を十分に理解できるはずです。