Name: 水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶ マウス皮膚の水平全マウント法による厚い3次元組織の処理と共焦点顕微鏡画像化プロトコール。抗原性と構造の完全性を保持し、毛包や立毛筋の立体構造を解析できます。

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著者らはThermo-Fisher Scientificのスポンサーシップを認め、共焦点画像取得中のサポートのためにKings College LondonのNikon Imaging Centerに感謝しています。

すべての動物実験は、地元の倫理的承認の対象となり、英国政府のホームオフィスライセンスの条件で実施されました。 1.スキンハーベストと凍結保存<ol><li> 準備。 <ol><li> 1％リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）25 mLを含む25 mLの4％PFAと2つの100 mm培養皿で100 mm培養皿1枚を調製します。 </li><li>最適切断温度化合物（OCT）を用いて長方形のピールアウェイクライオールドを3分の2で満たす。 </li><li>クライオブロックを後のステップに置くことができる金属板を-80°Cの冷凍庫に置きます。 </li></ol></li><li> 皮膚収穫、固定および凍結保存。 <ol><li>乾燥した電気シェーバーで動物の死体の背部をクリップする。 注：この例では、生後21日の野生型マウスを使用した。 </li><li>皮膚の関心領域を収穫します。 注：マウス皮膚の背側領域（ <stron図1a）は、均等に間隔をあけて位置合わせされた毛包の割合が最も高く、これにより、セクション分けのための最適な方向付けが可能になる。下にある非皮膚組織の除去は必要ではないが、必要に応じて行うことができる。 </li><li>収穫した皮膚をクライオモールドの底に収まるように適切な大きさの長方形の部分に切り取って、毛包穀物の方向性の成長を考慮してください。 注：小さなスキンスライスは、インキュベーションやマウントプロセス中につまずく可能性が少ないため、初心者にとっては扱いやすいかもしれません。ここに示されている例は、背部皮膚の約1cm 2の領域であり、22×30×20mmのクライオブラッドに収まる（ 図2a ）。 </li><li>皮膚サンプルの厚さに応じて、室温で4％PFA 25 mLで10-30分間固定します（ 図1b ）。 </li><li> 25mLのPBSで皮膚サンプルを2回洗浄するそれぞれ少なくとも5分間（ 図1b ）。 </li><li>凍結過程で結晶化を起こし、凍結切片の結果に影響を与える可能性のある余分なPBSの組織を慎重に排水するために、ペーパータオル上で皮膚サンプルを拭く。 注：標準スクロース勾配は必要ありません。しかし、これはユーザーの裁量でプロトコルに組み込むこともできます。 </li><li>各皮膚サンプルの毛包の向きに注意してください。視覚援助のために解剖顕微鏡を使用してください（特にプロトコールを最初に行う人は誰でも）。 OCTで満たされたクライオブラントに皮膚サンプルを挿入し、鉗子を使用してクリッピングされた髪の表面に付着した気泡を除去することによって、皮膚のすべての領域をOCTで平衡させる（ 図2aおよび2b ）。 </li><li> OCTで満たされたブロックの底にスキンを押して、底と同じ面になるようにします。 注：皮膚は任意の方向に向けることができます。適切な切断手順のために毛包の穀粒が注目されている限り。ブロックが凍結切除のためにクライオスタットに取り付けられると、クライオチップは再配向される。クライオモールド上の毛包の向きをマークする。このステップは、クライオスタットカットのその後の向きを決定するためである。 </li><li>組織の浮遊と脱落を避けるため、クライオブロックを-80°Cフリーザーの金属板に移します。 </li><li>目に見えない気泡が皮膚をクライオブラントの表面に浮かせる原因となる可能性があるため、冷凍プロセスを監視してクライオブラッドの底にある皮膚の向きを維持します。 注：冷凍組織を含むクライオモールドは、-80℃で1年以上保存することができ、追加のセクションで再使用することができます。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig1.jpg" /> 図1.マウスの皮膚の収穫と固定。 </strong&gt; （ a ）動物の死体の背側領域から皮膚組織を採取した。この領域の毛包は、均等に間隔を置いて整列しているため、矢印で示すように、切開中の最適な向きを可能にする。 （ b ）クライオドールドに適合する適切なサイズの四角形を切断した後、皮膚組織を4％PFAで15分間固定し、PBSで5分間それぞれ2回洗浄した。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 2.厚い組織断面<ol><li> クライオスタットにマウントする準備と組織の向き。 <ol><li> 100mLの培養皿に15mLのPBSを調製する。クライオスタットの簡単にアクセス可能な領域に置きます。さらに、1ウェルあたり2.5mLのPBSを含む12ウェルプレートを調製する;の長期保存のためのサンプルに従ってラベル4℃でインキュベートする。セクションを処理するには、鉗子を使用します。 </li><li>クライオスタットの温度を-20℃に調整する。 注記：温度はセクショニングに影響することがありますが、-20℃で始めるのが良いガイドです。 </li><li>約2つの毛包の厚い切片を得るために、クライオスタットを150μm厚の切片を切断するように調節する。 注：セクションの厚さは、ユーザーのニーズと分析に使用される顕微鏡の限界に応じて変更できます。 注：サンプルの向きは、毛包が適切な向きである皮膚切片を得るために重要です。これは、クライオスタットブロックに適切に取り付けることによって達成される。セクション平面が毛包の向きと平行であることを確認します （ 図2c ）。前述のように、皮膚サンプル中の断面の正しい向きは、取得される画像の品質を決定する重要なステップです後のステップ。 </li></ol></li></ol><img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig2.jpg" /> 図2.埋め込み、凍結保存、および切片化。 （ a ） クライオモールド上の毛包（HF）方向を黒い矢印で示していることは、凍結切片作製中の正しい配向のために重要である。 （ b ）毛包の完全な長さが損なわれていない区画を生成するために、区画平面を毛包の配向と整列させる必要がある（ c ）区画を毛包の方向ごとに切断した。クライオモールド。 （ d ）厚い組織断面を金属鉗子で収集し、（ e ）1×PBSを含む100mm培養皿に移した。 （ f ）室温で、PBSはOCを溶解させる.T。白い矢印によって示されるように、厚い組織断面を囲む化合物。セクションは、PBS内で自由に浮遊します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="2"><li> 凍結切除。 <ol><li>クライオスタットを使用して切片を切る。鉗子を使用して、埋め込まれた皮膚を含むOCTを収集します（ 図2d ）。 注：最適な標本の位置決めのために、X、Y、およびZ軸に沿った独立した移動および調整が可能なクライオスタットを使用してください。これにより、理想的に位置合わせされた組織断面の生成が可能になる。 </li><li>クライオスタットから切片をPBSで満たした100mm培養皿に移し、次のスライスを続ける。サンプルをスライド上に集めないでください（ 図2e ）。 注：室温では、PBSは溶解しますOCTは、鉗子で扱いやすい皮膚スライスを残す（ 図2f ）。 注：厚さ100μmの多くの組織切片を溶解した後、新鮮なPBSが100mm培養皿に必要となり、それに応じて変更することができます。 </li><li> 2.5mLのPBS（ 図3a 、左）で満たされた12ウェルプレートで浮遊皮膚切片を正確に標識されたウェルに移すために鉗子を使用する。 注：4℃では、サンプルを少なくとも2日間保存することができます。切断後の皮膚含有OCTブロックの長期保存のために、新しいOCTの液滴で切断面をシールする。OCT液滴を凍結させた後、使用したOCTブロックをパラフィルムに包んで-80℃冷凍庫に戻す。 </li></ol></li></ol> 3.免疫蛍光標識。 <ol><li> PBSバッファー（0.5％脱脂粉乳、0.25％フィッシュスキンゼラチン、0.5％Triton X-100を補充したPBS）を調製する予めT 2時間、先に5記載の方法。 注：アジ化ナトリウムは、染色バッファーの繰り返し使用のための抗体保存のためにPBバッファーに添加することができます。 </li><li> 1.5 mLのマイクロ遠心チューブにラベルを貼り、チューブあたり500μLのPBバッファーを加えます。注意深く鉗子を使用して、PBSからの皮膚切片をPBS緩衝液を含む別々のチューブに移して遮断する（ 図3a 、右）。すべてのスキンスライスが完全に水没していることを確認してください。マイクロ遠心チューブを室温で1時間、組織の完全性を破壊しないで、毎分10回の振動以下の速度でシーソーロッカー上に置く。 注：シーソーロッカーでは、速度が絡まりを引き起こすため、毎分10回の振動を超えないことが重要です。 <ol><li>マイクロ遠心チューブごとに複数のスライスを追加することは可能ですが、抗体を保存するにはチューブごとにスライスを1つだけ配置します。抗体の使用を減らすには、ボリュームを使用してください250μLであった。 注：必要に応じて、マイクロ遠心チューブを、例えば96穴プレートに交換してください。しかしながら、1.5mLのマイクロ遠心チューブに厚い組織断面を配置することにより、液体の乱れが増強されたため、組織内への最も効果的な抗体の浸透が可能になる。 </li></ol></li><li>各皮膚スライスのために別々の1.5mLのマイクロ遠心チューブに標識し、500μLのPB緩衝液および適切な量の一次抗体を加える。ブロッキングの1時間後、抗体を含有する新たに調製したチューブに皮膚切片を移す。スライスを4℃で一晩インキュベートする。 注：この実施例では、以下の一次抗体を使用した：1：50の濃度のFITCラット抗ヒトCD49fおよび1：100の濃度のヤギ抗マウス/ラットインテグリンα8。 </li><li>翌日、試料あたり500μLのPBSを含む2つの別々の1.5mL微量遠心管を用意する。室温で1時間、皮膚切片を2回洗浄する。e。 </li><li>適用可能な二次抗体および4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）の適切な濃度のPB緩衝液500μLを含む別々の1.5mL微量遠心チューブを調製する。 注：この例で使用した二次抗体は、1：500の濃度のAlexa Fluor 488ロバ抗ラットIgGおよびAlexa Fluor 555ロバ抗ヤギIgGです。 DAPIを1：100の濃度で使用した。 </li><li>注意深く、皮膚サンプルを二次抗体およびDAPIを含有するPB緩衝液に移し、ローテーターまたはシェーカー上で室温で1時間、低速で皮膚切片をインキュベートする。 </li><li> 2次抗体とDAPIを含むPBバッファーに4℃で4℃で保存し、アジ化ナトリウムをPBSに加えた場合にはさらに長くしてください。 </li></ol><img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig3.jpg" /> 図3.免疫蛍光entラベリングとマウント。 （ a ）浮遊組織の断面は、4℃で少なくとも2日間12ウェルプレートに保存することができます。免疫蛍光（IF）ラベリングの前に、矢印1で示されるように、ブロッキングのためにPB緩衝液を含む1.5mLマイクロ遠心チューブに目的の組織断面を移す.IF標識のために、ステップ3で詳述された複数ステップ手順に従う。ステップ3の一部は、矢印2で示される、一次抗体溶液、二次抗体溶液、または洗浄バッファーを含有する新たに調製されたマイクロ遠心チューブに組織断面を注意深く移すことを必要とする。（ b ）IF標識後、解剖顕微鏡の助けを借りて、グリセロールの液滴中で切片を解き平滑化する。 （ c ）組織の断面がカバースリップの底に完全に平坦になると、通常の顕微鏡スライドを使用してセクションが取り付けられる。 <ahref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 4.顕微鏡視覚化のための取り付け<ol><li>イメージングする前に、二次抗体およびDAPIを洗い流すために、500μLのPBSを含む別々のマイクロ遠心チューブに皮膚切片を移す。 </li><li> 1,000μLのピペットを使用しますが、ピペットチップの最初の0.5cmを切り、高粘度のグリセロールを適切にピペッティングできるようにします。解剖顕微鏡（ 図3b ）の下に暗い背景に22 x 50 mmカバースリップを置きます。 </li><li> 100％グリセロールの1滴をカバースリップに添加する（ 図3b ）。マイクロ遠心チューブから皮膚切片をグリセロール液滴に移す。解剖顕微鏡と尖った鉗子を使用して、きつく巻いた皮膚のスライスを注意深く巻き戻します。 注：スライスがグリフ内で浮動するとそれは、正常な形状に戻るための組織の自然な傾向を癒すことによって絡み合うことができます。組織の損傷を引き起こす可能性があるので、スライスを不自然にまっすぐにしないでください。 </li><li>カバー部分には、皮膚部分の全長が適切に向き合って平坦になったら、ティッシュを取り付けます。通常の顕微鏡スライドを使用してください。このステップは、スキンスライスをさらにまっすぐにします。 注記：空気の閉じ込めを避けてください（ 図3c ）。 </li><li>次の2日以内に、グリセロールにマウントされた皮膚切片をイメージします。 注記：長時間の保管は、組織とイメージングの品質に悪影響を及ぼします。この例では、すべての画像を、20倍対物レンズを用いて直立共焦点顕微鏡で取得した。 </li></ol>

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<li>Sada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+cellular+lineage+hierarchy+in+the+interfollicular+epidermis+of+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).</li>
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<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li>
</ol>

著者らは、この原稿の刊行物がThermo-Fisher Scientific Inc.によって資金提供されたことを開示したいと考えている

ここでは、従来の凍結切片に比べていくつかの利点がある「水平ホールマウント」技術を紹介します。私たちの技術の利点の1つは、標準的な組織学装置と共焦点顕微鏡で簡単に実行できることです。第二に、標準的な凍結切片と比較して、組織の完全性が優れた方法で維持されます。たとえば、皮下層内の脂肪細胞(すなわち、真皮白色脂肪細胞(DWAT))9は、標準的な凍結切片ではひどく破壊され、脂肪を含んだ組織の研究は不可能になります。私たちの技術は、この層の脂肪細胞の完全な分析を可能にし、脂肪細胞含有量の高い他の組織に適応させる可能性があります。さらに、これにより、系統追跡研究における間葉系細胞の検出の改善が可能になります2,10。
標準的な凍結切片は、その性質上、共焦点顕微鏡で組織の真の3D側面を明らかにすることはできません。これは、毛包とその下部構造が従来の凍結切片で使用される標準的な厚さの10μmを超える深さを横断できるため、より厚い切片が皮膚の分析に有利であることを意味します。たとえば、腸や脳などの他の組織が、組織を3D構造として見ることに関して同様の課題を抱えていることに興味をそそられます2,7,11,12,13。興味深いことに、私たちの技術は、腸の特定の用途での使用に有益であることがすでに示されています14。私たちの水平ホールマウントプロトコルは、3D分析を必要とする他の組織に適用できる可能性があると考えています。

顕微鏡撮像装置の革命は、洗練された高解像度撮像装置を提供する。しかしながら、完全な三次元（3D）組織断面の顕微鏡画像を取得する場合、標本調製はかなりの課題を提示し、画像品質を限定する上での制約要因となり得る。個々のステップは、組織形態および標的タンパク質の抗原性を維持し、プロセシングに起因するアーティファクトを最小限にし、最終的な画像品質を最大にするために慎重に考慮する必要がある。例えば、皮膚の伝統的な分析は、皮膚のホメオスタシス1、2への幹細胞区画の貢献の解剖学的な解析を可能にし、適切に配向された毛包で、表皮と真皮の景色をイメージする必要があります。これは、皮膚がどのように埋め込まれ、切断されるかについて徹底的な集中を必要とする。重要なことに、毛包はより厚くなり得る大幅ホールマウントまたは厚い断面3、4、5と比較分析の低い標準をもたらす、標準パラフィンまたは凍結切片の厚さを超え100μm以下、。 総合すると、顕微鏡分析のための試料調製の各ステップは、画像分析に影響する重要な決定要因である。ここでは、「水平全面マウント」と呼ばれる、厚い3次元組織断面解析のための新しい処理プロトコルを紹介します。プロトコールは抗原性を高く保ち、標準的な共焦点イメージング装置を用いて皮膚の厚い部分の完全な利用を可能にする。これは、組織採取およびパラホルムアルデヒド（PFA）に基づく凍結保存（ステップ1）、クライオスタットによる厚さ100μmの組織断面の生成（ステップ1）を含む、厚い組織断面処理およびイメージングのための皮膚の使用に関する完全なガイドである。 2）、および免疫蛍光ラベリングおよびマウント（ステップ3および4）。代表的な結果は、このプロトコールの潜在的ユーザのための「水平全マウント」の利点を強調する2つの異なる組織学的調製技術（古典的な凍結切開および厚い3D組織横断）の共焦点画像を比較する。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>自家製</td></tr><tr><td>ゼラチン、冷水魚の皮</td><td>から シグマ</td><td>G7765</td><td>250ML</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>BDH研究所用品</td><td>444482V</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.コンパウンド</td><td>VWR化学薬品</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>ピール・ア・ウェイ埋め込み金型</td><td>シグマ</td><td>E6032-1CS</td><td>スクエアS-22</td></tr><tr><td>無脂肪粉ミルク</td><td>バイオ株式会社ベーシック</td><td>NB0669</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>500ML</td></tr><tr><td>4&prime;,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、ジ乳酸 (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Human CD49f</td><td>BD Pharmingen</td><td>555735</td><td></td></tr><tr><td>Mouse/Rat Integrin alpha 8 抗体</td><td>R&Dシステム</td><td>ズAF4076</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488ロバ抗ラットIgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555ロバ反ヤギIgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100mm 培養皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨てメス</td> ス<td>ワン・モートン</td><td>Ref 0501</td><td></td></tr><tr><td>先のとがった金属鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量遠心チューブ</td><td>VWR</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェルプレート</td><td>シグマ</td><td>CLS3513</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ul および 1000 ul ピペット</td><td>ギルソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000&micro;l XL目盛り付きTipOneフィルターチップ(滅菌)</td><td>スターラボ</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>20&micro;l 斜めチップフィルターチップ1個(滅菌)</td><td>Star Lab</td><td>S1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>ロッキングシェーカープレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド、menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>631-9483</td><td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>カバーグラス、Menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>MENZBB024060AB</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

科学的議論を支持する顕微鏡画像を生成する目的の組織を処理することは困難であり得る。高品質の顕微鏡画像の取得は、顕微鏡の品質だけでなく、しばしば複数の重要な動作またはステップを伴う組織処理の方法にも依存する。さらに、皮膚および他の組織における間葉系細胞タイプは、組織調製および画像化のための新たな課題を提示する。ここでは、組織収穫から顕微鏡検査までの完全なプロセスを提示します。 「水平マウント」と呼ばれる私たちの技術は、初心者がすばやく熟練することができ、クリオスタットで切断された厚さ60〜300μmの切片での抗原の保存と検出を可能にする技術です。この厚さのセクションは、3次元環境における組織のマイクロアーキテクチャの視覚化を向上させます。さらに、このプロトコールは、間葉細胞を、標準的なクライオスタットまたはパラフィン切片と比較して、それにより免疫染色の有効性および信頼性を増加させる。我々は、このプロトコールが、皮膚、おそらく他の組織および器官を視覚化するすべての実験室に有益であると考えている。

我々の技術の利点を強調するために、我々は、我々の太い3D組織横断技術「水平全体マウント」を古典的な凍結切片と比較した。古典的な凍結切片を前述のように切断した（ 5） 。顕微鏡画像における表皮の視覚的構造を提供するために、本発明者らは、基底膜6に表皮細胞を固定する成分であるインテグリンα6（Itga6）について免疫染色した。我々はまた、インテグリンアルファ-8 7で、（も「鳥肌」として知られている）立毛を担当して立毛筋（APM）を、ラベルされました。古典的な凍結切片では、Itga6で視覚化されたほとんどの毛包は、全体の長さに沿って切片化されず、横断全体のマウントと比較して、切片あたり主に不完全な毛包を生成した（ 図 4a〜4d </strong&gt;）。厚い組織断面は、従来の10μm断面と比較してより多くのZスタック層を獲得することを可能にし、より完全な3D画像を可能にする。これは、毛包および上層の基底膜に関連するAPMの完全性を研究するときにさらに明らかになる。古典的な凍結切片では、APMの膨大な部分が分画された（ 図 4a〜4d ）。さらに、低温保存区画の組織完全性は、凍結切片を暖かいガラススライドに付着させたときの脂肪細胞の破壊と比較して、水平な全体のマウントで保存されており（これは周知の凍結融解アーチファクトである（ 図4a - b 、領域） 8 。 <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig4.jpg" /> 図4.水平全体のモウ従来の凍結切片と比較してnt。 （ a ）厚さ10μmの古典的に得られた皮膚凍結切片および（ b ）厚さ100μmの3D組織断面を、インテグリンα-6（Itga6）およびインテグリンα-8（Itga8）で標識して、表皮区画および後肢筋肉を視覚化したそれぞれ、厚い組織断面の画像は、大きなZスタックの最大投影として表される。白い枠は、拡大された領域、（ c ）古典的な（ d ）水平のマウント部に表示されます。 （ e ）インタクトな毛包および（ f ）無傷の脱毛筋を、古典的および水平的な全マウント切片の両方で定量化した。スケールバーは100μmを示す。データは、平均値±標準誤差平均（SEM）として表される。生物学的反復（ n = 3）あたり1つのセクションを定量した。対になっていないt検定* P &lt;0.05、*** P &lt;0.0005。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

この研究は、共焦点イメージングモダリティの完全な利用を可能にする、厚い3次元組織断面分析のための新規な処理およびイメージングプロトコルを提示する。このプロトコールは抗原性を保持し、皮膚組織学および潜在的に他の組織型を分析するための堅牢なシステムを表す。

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

この組織学的およびイメージングプロトコルの全体的な目的は、皮膚のエピトープ抗原性と構造的完全性を維持する堅牢なシステムを提示し、共焦点イメージング手法を最大限に活用できるようにすることです。この手法は、複雑な三次元組織構造内におけるあらゆる種類の細胞の性質を調べる必要がある重要な課題を解決するのに役立ちます。標準的な組織学的手法と比較した本技術の主な利点は、堅牢であり、かつ実施が容易であることです。さらに、このプロトコルは共焦点顕微鏡による三次元解析を完璧に補完します。まず、マウスの背側正中領域から採取した皮膚を、長方形に切り出します。各ピースは、クライオモールドの底に収まるサイズに調整してください。ここでは、22 mm × 30 mm × 20 mmのクライオモールドに収まる、1平方センチメートルの背部皮膚領域を示します。固定後、洗浄した皮膚をOCT充填済みのモールドの底に押し込み、底面と密着させます。クライオスタットでの切片作成時の方向を決定するため、クライオモールドに毛包の向きを書き込んでください。組織の浮きや位置ずれを防ぐため、クライオブロックを-80°Cのフリーザー内にある金属プレート上に移動させます。目に見えない気泡によって皮膚がクライオモールドの表面まで浮き上がることがあるため、凍結過程を監視し、クライオモールド底部の皮膚の方向を維持してください。まず、クライオモールドに示された切断面に沿って、毛包の方向が正しくなるように、凍結したクライオブロックをクライオスタットのステージに固定します。毛包の全長を維持した状態で皮膚切片を作成するには、切断平面を決定するクライオスタット上での正確な毛包の方向調整が極めて重要です。クライオスタットを用いて100 µmの切片を作成します。ピンセットで皮膚標本を包んでいるOCTを掴み、切片をクライオスタットからPBSを満たした100 mm培養皿に転送します。室温でPBSを用いることでOCTが溶解し、ピンセットで扱いやすい皮膚切片が得られます。切片作成後、浮遊している皮膚切片をピンセットで、2.5 millilitersのPBSが入った12ウェルプレートのウェルへと移します。まず、ラベルを貼った1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに500 microlitersのPBバッファーを加え、免疫蛍光標識を開始します。ピンセットを用いて、12ウェルプレートからブロッキング用のチューブへ皮膚切片を慎重に移します。すべての皮膚切片が完全に浸っていることを確認してください。マイクロ遠心チューブをシーソーロッカーに設置し、室温で10回/分以下の振動で1時間振盪させます。各皮膚切片用に1.5 mLマイクロ遠心チューブにラベルを貼り、適切な量の一次抗体を含む500 µLのPBバッファーを加えます。1時間のブロッキング後、皮膚切片を抗体が入った新しく準備したチューブに移します。切片を4 °Cで、ロッカーを用いて低速で一晩インキュベートします。翌日、スライスを500 µLのPBSを含む1.5 mLマイクロセントリフュージチューブに移し、ロッカを用いて室温で1時間洗浄します。次に、スライスを、適切な濃度の二次抗体とDAPIを含む500 µLのPBバッファーが入った個別の1.5 mLマイクロセントリフュージチューブに移します。ロッキングを行いながら室温で1時間インキュベートします。必要に応じて、サンプルは次回の処理まで4 °Cで最大4日間保存可能です。イメージングの前に、皮膚切片を500 microlitersのPBSを含む個別のマイクロ遠心チューブに移し、二次抗体とDAPIを洗浄します。次に、解剖顕微鏡下で、22 milliliter by 50 milliliterのカバーガラスを暗い背景の上に置きます。次に、チップの先端を切断した1, 000 microliterピペットを使用して、カバーガラス上に100%glycerolを1滴滴下します。皮膚切片をマイクロ遠心チューブからグリセロール液滴の上に移動させます。次に、解剖顕微鏡で観察しながら、尖端鉗子を用いて、グリセロール中で浮遊している皮膚切片をなだめるようにして、丸まっている部分をゆっくりと本来の形状に戻します。組織を損傷させる可能性があるため、無理に直線状に伸ばそうとしないでください。セクションの全長がカバーガラス上で適切に方向付けされ、平らに広がったことを確認します。組織を通常の顕微鏡スライドにマウントします。この操作により、皮膚切片がさらに直線状に伸びます。グリセロールでマウントした皮膚セクションのイメージングは、2日以内に行ってください。この画像は、表皮層および立毛筋をそれぞれ可視化するために、integrin alpha sixおよびintegrin alpha eightで標識した、従来の手法で作成した厚さ10 micronの皮膚凍結切片を示しています。厚さ100 micronの3D組織横断切片についても同様に標識しました。表示されている画像は、大きなz stackの最大値投影（maximum projections）です。2つの画像の詳細をここで並べて比較しています。従来の凍結切片では、インテグリンα6で可視化されたほとんどの毛包が全長にわたって切断されておらず、水平全層標本と比較して、1切片あたりに不完全な毛包が多く生成されていました。従来の切片と水平全層標本切片の両方で、完全な毛包および完全な立毛筋を定量化しました。生物学的反復につき1つの切片を定量化したところ、ここに見られるように、全層標本切片の方が完全な毛包および立毛筋の割合が高くなっていました。この凍結切片作成の手法を習得すれば、マウントが正しく行われていればサンプルの方向を完全に揃えたまま、1分間に15切片以上の速度で作成することが可能です。このビデオを視聴することで、三次元環境における厚い組織横断切片の処理および解析方法について深く理解することができるはずです。

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Research

JoVE Journal

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