破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発

このプロトコルでは、生体外で人間前臨床モデルの末梢血単球培養がん細胞破骨細胞の相互作用を模倣する乳房癌細胞から破骨細胞形成の開発について説明します。モデルは、骨転移形成の理解を深めると治療オプションの改善される可能性があります。

乳がん細胞株と培養した末梢血単球(PBMC)に由来する破骨細胞形成のこのin vitroヒト前臨床モデルの全体的な目標は、がん細胞の破骨細胞相互作用を模倣することです。この方法は、骨微小環境内でのがん細胞と骨細胞の相互作用の影響に関する骨転移の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、完全にヒトの前臨床モデルであることです。

また、この方法は骨転移についての洞察を提供することができます。また、骨粗鬆症などの他の骨関連の病理学的メカニズムの研究にも適用できます。この方法に不慣れな個人は、健康なドナー間のばらつきや適切なPBMC細胞密度の選択に苦労する可能性があります。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、PBMCの選択と播種手順が習熟度を達成する前に手動の経験が必要であることを確認する必要があるため、非常に重要です。まず、EDTAで少なくとも20ミリリットルの健康なドナーの全血をPBSで1対1の比率で希釈します。.十分に混合した後、血液溶液を50ミリリットルの円錐管で30ミリリットルのアリコートに分割します。

15ミリリットルのリンパ球分離培地を各チューブの底に慎重に下敷きします。密度勾配遠心分離により細胞を分離します。そして、バフィーコートを含む白い単核細胞を新しい15ミリリットルのチューブに引き込みます。

採取した細胞を1回の洗浄につき20ミリリットルのPBSで2回洗浄し、続いて5ミリリットルの赤血球溶解緩衝液で赤血球を氷上で3〜5分間溶解します。20ミリリットルのPBSで反応を停止し、遠心分離により白血球を採取します。ペレットを再懸濁し、alpha M-E-Mを完成させて計数します。

次に、24ウェルプレートの各ウェルで10の5倍10の5PBMC濃度で細胞をプレートし、摂氏37度およびCO2の5%でインキュベーションします。約3時間後、上清、破片、付着していない細胞、および未溶解の赤血球を培養物から取り除きます。そして、MCSFを添加した新鮮な培地を追加します。

播種後14日後、細胞をPBSで2回洗浄し、室温で20分間4パーセントパラホルムアルデヒドに固定します。トラップ染色は、メーカーの指示に従って行ってください。破骨細胞様細胞は、少なくとも 4 つの核を持つ TRAP 陽性になります。

破骨細胞様細胞を顕微鏡で10倍の倍率で手動でカウントします。がん細胞が破骨細胞の分化を誘発するためには、がん細胞が90%のコンフルエントに達すると、トリプシン化によって剥離され、新鮮なアルファMEMの1平方センチメートルあたり3細胞の濃度の4倍でゼロポイント4マイクロメートルの細孔インサートに播種されます。翌日、播種したインサートを完全α M-E-M中の未分化1日播種単核細胞培養物にかけ、2〜3日ごとに培地を交換します。

次に、共培養の開始から11日後に、インサートを目的のダウンストリーム分析に適した試薬を含む新しいプレートに移します。乳がん細胞は、がん細胞によって誘導されたウェル内の破骨細胞の数が、ポジティブ成長因子コントロールウェルで得られたものと類似しているため、破骨細胞形成を維持することができます。ただし、すべての培養物で観察される破骨細胞の数は、細胞を抗腫瘍薬で処理すると減少します。

興味深いことに、成長因子に由来する成熟した破骨細胞の表面積は、がん細胞によって誘導されるものよりも大きい。この効果は、抗腫瘍薬で処理した培養物では観察されません。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、7時間8時間で完了することができます。

この手順に続いて、遺伝子発現解析、ウェスタンブロット、免疫蛍光解析、またはELISAなどの追加のダウンストリーム解析を実施して、がん細胞/骨細胞の相互作用や抗腫瘍薬のメカニズムに関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、骨転移の分野の研究者が、完全にヒトの前臨床モデルで骨微小環境を研究するための道を開きます。このビデオを見た後、単球の共培養方法、がん細胞との分化の方法についてよく理解できるはずです。

生物学的サンプルや薬物の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には手袋や白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。