破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発
2017年9月13日
このプロトコルでは、生体外で人間前臨床モデルの末梢血単球培養がん細胞破骨細胞の相互作用を模倣する乳房癌細胞から破骨細胞形成の開発について説明します。モデルは、骨転移形成の理解を深めると治療オプションの改善される可能性があります。
乳がん細胞株と培養した末梢血単球(PBMC)に由来する破骨細胞形成のこのin vitroヒト前臨床モデルの全体的な目標は、がん細胞の破骨細胞相互作用を模倣することです。この方法は、骨微小環境内でのがん細胞と骨細胞の相互作用の影響に関する骨転移の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、完全にヒトの前臨床モデルであることです。
また、この方法は骨転移についての洞察を提供することができます。また、骨粗鬆症などの他の骨関連の病理学的メカニズムの研究にも適用できます。この方法に不慣れな個人は、健康なドナー間のばらつきや適切なPBMC細胞密度の選択に苦労する可能性があります。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、PBMCの選択と播種手順が習熟度を達成する前に手動の経験が必要であることを確認する必要があるため、非常に重要です。まず、EDTAで少なくとも20ミリリットルの健康なドナーの全血をPBSで1対1の比率で希釈します。.十分に混合した後、血液溶液を50ミリリットルの円錐管で30ミリリットルのアリコートに分割します。
15ミリリットルのリンパ球分離培地を各チューブの底に慎重に下敷きします。密度勾配遠心分離により細胞を分離します。そして、バフィーコートを含む白い単核細胞を新しい15ミリリットルのチューブに引き込みます。
採取した細胞を1回の洗浄につき20ミリリットルのPBSで2回洗浄し、続いて5ミリリットルの赤血球溶解緩衝液で赤血球を氷上で3〜5分間溶解します。20ミリリットルのPBSで反応を停止し、遠心分離により白血球を採取します。ペレットを再懸濁し、alpha M-E-Mを完成させて計数します。
次に、24ウェルプレートの各ウェルで10の5倍10の5PBMC濃度で細胞をプレートし、摂氏37度およびCO2の5%でインキュベーションします。約3時間後、上清、破片、付着していない細胞、および未溶解の赤血球を培養物から取り除きます。そして、MCSFを添加した新鮮な培地を追加します。
播種後14日後、細胞をPBSで2回洗浄し、室温で20分間4パーセントパラホルムアルデヒドに固定します。トラップ染色は、メーカーの指示に従って行ってください。破骨細胞様細胞は、少なくとも 4 つの核を持つ TRAP 陽性になります。
破骨細胞様細胞を顕微鏡で10倍の倍率で手動でカウントします。がん細胞が破骨細胞の分化を誘発するためには、がん細胞が90%のコンフルエントに達すると、トリプシン化によって剥離され、新鮮なアルファMEMの1平方センチメートルあたり3細胞の濃度の4倍でゼロポイント4マイクロメートルの細孔インサートに播種されます。翌日、播種したインサートを完全α M-E-M中の未分化1日播種単核細胞培養物にかけ、2〜3日ごとに培地を交換します。
次に、共培養の開始から11日後に、インサートを目的のダウンストリーム分析に適した試薬を含む新しいプレートに移します。乳がん細胞は、がん細胞によって誘導されたウェル内の破骨細胞の数が、ポジティブ成長因子コントロールウェルで得られたものと類似しているため、破骨細胞形成を維持することができます。ただし、すべての培養物で観察される破骨細胞の数は、細胞を抗腫瘍薬で処理すると減少します。
興味深いことに、成長因子に由来する成熟した破骨細胞の表面積は、がん細胞によって誘導されるものよりも大きい。この効果は、抗腫瘍薬で処理した培養物では観察されません。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、7時間8時間で完了することができます。
この手順に続いて、遺伝子発現解析、ウェスタンブロット、免疫蛍光解析、またはELISAなどの追加のダウンストリーム解析を実施して、がん細胞/骨細胞の相互作用や抗腫瘍薬のメカニズムに関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、骨転移の分野の研究者が、完全にヒトの前臨床モデルで骨微小環境を研究するための道を開きます。このビデオを見た後、単球の共培養方法、がん細胞との分化の方法についてよく理解できるはずです。
生物学的サンプルや薬物の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には手袋や白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
本プロトコルでは、乳がん細胞株と共に培養した末梢血単球からの破骨細胞分化を用いた、in vitroにおけるヒト前臨床モデルの開発について記述します。これにより、がん細胞と破骨細胞の相互作用を模倣することが可能です。本モデルは、骨転移に関する重要な課題の解明や、治療法の改善に寄与します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 破骨細胞分化
- 骨転移
- がん細胞相互作用
背景
- このモデルでは末梢血単核細胞（PBMC）を使用します。
- がん細胞と破骨細胞の間の相互作用を再現することを目的としています。
- 本研究は、骨に関連する病理の理解において重要です。
- 健康なドナー間の個体差が結果に影響を及ぼす可能性があります。
研究目的
- がん細胞と破骨細胞の相互作用を模倣するため。
- 骨微小環境におけるこれらの相互作用の影響を調査するため。
- 骨転移および関連疾患に関する知見を得るため。
使用した手法
- 乳がん細胞株を用いたPBMCの共培養。
- 破骨細胞分化の評価。
- がん細胞と骨細胞の相互作用の評価。
- PBMC細胞密度の変動解析。
主な結果
- 本モデルは、がん細胞と破骨細胞の相互作用を良好に模倣しています。
- 得られた知見は、骨転移の治療戦略に役立てることができます。
- 潜在的な応用範囲は、他の骨関連疾患にも及びます。
- 課題としては、ドナー間の個体差や細胞密度の選択が挙げられます。
結論
- このヒト前臨床モデルは、骨転移の研究において有用です。
- これにより、骨微小環境におけるがん細胞の相互作用への理解が深まります。
- 今後の研究では、このモデルを活用することで、骨病理学におけるより幅広い応用に繋げることができます。
よくある質問
業界における重要性
この完全ヒト前臨床モデルは、生理学的に関連のあるシステム内でがん細胞と破骨細胞のクロストークを再現することにより、骨転移における破骨細胞分化経路のメカニズム的なリスク低減を可能にします。また、破骨細胞の分化と機能の定量的な読み出しを提供することで、抗腫瘍治療薬のターゲット検証およびアッセイ開発を支援します。本モデルは、薬物治療条件下での両細胞種の相互作用の直接観察とダウンストリーム解析を可能にすることで、リード化合物同定における予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索とターゲットバリデーション
- 科学的価値：腫瘍誘発性の破骨細胞分化に関する治療仮説の検証および、骨微小環境におけるパスウェイの解明を可能にします。
- 運用の価値：規定の共培養条件下でヒト原代単球からの破骨細胞分化をモデル化することにより、生物学的リスクの低減および機能的なターゲットバリデーションを支援します。
- 科学的価値：成長因子のコントロール群に対するがん細胞刺激による破骨細胞形成を定量化することで、予測精度の向上とポートフォリオの優先順位付けを促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： RANKLおよびMCSFを用い、PBMCから標準化された破骨細胞分化を行うことで、後続のワークフローに向けた検証済みの生物学的システムを調製します。
- 運用的価値： 固定された細胞密度での播種（7.5×10⁵ PBMC/cm²）と、期間を定めた分化（14日間）、およびTRAPベースの破骨細胞定量化により、アッセイの標準化と再現性を実現します。
- 科学的価値： 間接共培養（条件培地）および直接共培養の両形式で破骨細胞形成に対する薬物効果を検証することにより、信頼性の高い化合物評価を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：破骨細胞分化誘導アッセイを適応させることで、骨粗鬆症やその他の骨疾患に関する疾患関連モデリングをサポートします。
- 運用的価値：完全にヒト由来の細胞を使用することでトランスレーショナルな連続性を確保し、前臨床から臨床への外挿における種差による翻訳リスクを低減します。
- 科学的価値：破骨細胞の数および表面積の変化を薬効の薬力学的バイオマーカーとして測定することで、リスク調整済みの開発進展判断を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
このモデルは、ターゲットのバリデーションからリード化合物の同定、そして前臨床薬効試験に至る創薬のコンティニュアムに適合しており、特に骨標的治療薬や骨微小環境調節剤の開発に適しています。
- 探索生物学：がん細胞由来因子による破骨細胞活性化の仮説検証、およびRANKL非依存的な破骨細胞誘導メカニズムの経路解明を支援します。
- スクリーニング：標準化された単球の分離、分化、および透過性インサート上での乳がん細胞株との共培養を通じて、パラクリンおよびジャクスタクリンシグナリング研究のためのアッセイ準備を提供します。
- 分析：TRAP染色、多核細胞計数、および形態計測分析（表面積）による定量的な破骨細胞の読み取りを行い、実験条件間の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：臨床的に関連のある乳がん細胞株を用いて、転移性骨微小環境における薬剤の効果を研究することを可能にし、前臨床段階への継続性を繋げます。
- エンタープライズでの再利用：乳がん以外の複数のがん種や骨病変における破骨細胞調節を研究するための、再利用可能なプラットフォームとして機能します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値：破骨細胞とがん細胞の相互作用におけるメカニズム的な曖昧さを軽減することで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を提供します。
- 運用的価値：定義されたPBMC分離、播種密度、およびサイトカイン補充プロトコルを通じて、標準化と再現性を確保します。
- 戦略的価値：破骨細胞の形成および機能に対する薬剤効果の早期評価を可能にすることで、go/no-go判断を改善し、骨転移プログラムにおける後期の生物学的リスクを軽減します。
- ポートフォリオへの影響：化合物の破骨細胞分化能を定量化し、骨微小環境の調節に基づいた推進を導くことで、リスク調整後の優先順位付けをサポートします。
実施上の考慮事項
- PBMC分離や単球の接着を含む、ヒト一次細胞の分離、培養、および分化誘導技術に関する専門知識が必要です。
- 細胞計数、遠心分離、顕微鏡観察（破骨細胞計数用の10倍率）、およびインキュベーション（37°C, 5% CO₂）のための機器に依存します。
- ばらつきを最小限に抑えるため、PBMCドナーの選定、細胞密度の最適化（7.5×10⁵ PBMC/cm²）、および共培養のタイミング（がん細胞播種後11日）について、チーム間での標準化が必要です。
- 乳がん以外の細胞株への拡張や、RANKL/MCSF以外の代替的な破骨細胞刺激因子を使用する場合、適応に関する検討が必要となります。
- 破骨細胞への分化能におけるドナー間の個体差や、PBMCの播種および共培養セットアップにおける手技の習熟度といった実用上の制限が含まれます。
