脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカ ウイルス感染症をモデル化

この手順の全体的な目標は、幹細胞由来の脳オルガノイドを使用して、発生中のヒト脳におけるジカウイルス感染をモデル化することです。この方法は、どの細胞が感染する能力があるのか、どのタンパク質が感染経路に関与しているのかなど、生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、初期のヒト感染を模倣し、ハイスループットアッセイに利用できること、およびCRISPRなどのフォーカス遺伝学的手法と組み合わせることができることです。

この手法により、ジカウイルスの感染メカニズムを解明することができます。また、薬物スクリーニングやウイルスの擬似型分析など、他のシステムにも適用できます。通常の幹細胞維持法を使用して、培養物を50%から70%のコンフルエントにします。

10倍から20倍の倍率で明視野顕微鏡を使用して培養物を検査し、コロニーが検出可能な分化のない健康な形態を有することを確認します。ゼノフリー幹細胞維持培地を温水浴で摂氏37度まで持ち込み、2ミリリットルの酵素剥離試薬とストックロックインヒビターの50マイクロリットルバイアルを室温で解凍します。次に、超低アタッチメントのUボトム96ウェルプレート、マルチチャンネルp200ピペット、25ミリリットルの試薬リザーバーを準備します。

次に、45ミリリットルのメディアを50ミリリットルの円錐管に分注します。45マイクロリットルの岩石阻害剤を追加し、混合物を三量化して阻害剤を完全に混合し、続いて2〜4個をバージョンで混合します。幹細胞を含む6ウェルプレートの2ウェルを真空吸引し、各ウェルに1ミリリットルの酵素フリー剥離試薬を迅速に加え、プレートを摂氏37度で4分間インキュベートします。

次に、処理したウェルを真空吸引し、各ウェルに1ミリリットルの酵素分離試薬を加えます。摂氏37度で5分間インキュベートした後、プレートをインキュベーターから取り出します。プレートを軽くたたいて、凝集した細胞を分割します。

次に、顕微鏡で細胞を検査します。大きな細胞クラスターがまだ見える場合は、プレートを摂氏37度でさらに2分間インキュベートします。クラスターが肉眼で見えなくなるまで、この手順を繰り返します。

細胞が適切に解離したら、各ウェルに1ミリリットルのゼノフリー幹細胞維持培地を添加して、解離酵素を不活性化します。細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐形チューブに引き込み、細胞計数用の小さな分注を取ります。遠心分離中に、細胞をカウントし、ミリリットル懸濁液あたり60, 000細胞を達成するために必要な再懸濁液量を決定します。

慎重に上清を除去し、岩石阻害剤を含む培地で1ミリリットルあたり60, 000細胞で細胞を再懸濁します。5ミリリットルのピペットを使用して、細胞を5〜10回穏やかに混合し、均一な細胞懸濁液を確保します。すぐに細胞懸濁液を試薬リザーバーに加え、マルチチャンネルp200ピペットを使用して、超低アタッチメントの96ウェルプレートの各ウェルに150マイクロリットルを移します。

次に、プレートを150 x Gで1分間遠心分離し、プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れます。プレートを48時間邪魔しないでください。2日目から、50ミリリットルの円錐管に17マイクロリットルのストックロック阻害剤を含む17ミリリットルの培地を準備します。

混合物を温水浴で摂氏37度に温めます。インキュベーターからオルガノイドプレートを取り出し、マルチチャンネルp200ピペットを使用して、最初の列のウェルの端から75マイクロリットルの培地をゆっくりと引き出します。次に、すぐにウェルに戻し、緩んだ細胞やオルガノイドを持ち上げます。

この分散プロセスを各行に対して繰り返します。オルガノイドが各ウェルの底に沈んだことを確認するために15秒待ってから、マルチチャンネルp200ピペットを使用して各ウェルから75マイクロリットルの培地をゆっくりと慎重に吸引し、廃棄物リザーバーに分注します。次に、岩石阻害剤を含む培地を試薬リザーバーに移し、150マイクロリットルの培地を各オルガノイドウェルに分注し、細胞を摂氏37度でインキュベートします。

17ミリリットルの新鮮な培地を摂氏37度まで温めますが、今回は岩石阻害剤は含まれていません。100マイクロリットルに設定されたマルチチャンネルp200ピペットを使用して、前述の分散プロセスを繰り返し、オルガノイドがウェルの底に沈んだことを確認するために15秒待ちます。次に、各ウェルから125マイクロリットルの培地を慎重に吸引し、150マイクロリットルの温めた培地と交換します。

プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れます。ここに示されているレシピに従って培地を準備し、混合溶液を500ミリリットルのフィルターで滅菌ろ過します。4日目から24日目頃に細胞が感染するまで、神経誘導培地を用いて1日おきに定期的なメンテナンスを行う。

濾過したら、17ミリリットルの神経誘導媒体を摂氏37度まで温め、残りを摂氏4度で保存します。マルチチャンネルp200ピペットを使用して、100マイクロリットルに設定し、オルガノイドプレートのすべてのウェルを以前に示しました。オルガノイドがウェルの底に沈んでいることを確認するために15秒待ちます。

各ウェルから125マイクロリットルの培地を慎重に吸引し、125マイクロリットルの新鮮な神経誘導培地と交換します。オルガノイドがジカウイルス感染の準備ができるまで、このネラル誘導の偉業を隔日で繰り返します。アールの1倍バランス塩溶液、1倍PBS、神経誘導培地を摂氏37度までの温水浴に入れます。

次に、既知の濃度のジカウイルスを1x アール溶液中で、標的の感染多重度(通常は0.1〜10)に希釈します。p200ピペットを使用して、各オルガノイドウェルからすべての培地を慎重に取り出します。次に、オルガノイドを200マイクロリットルの温めた1x PBSですばやく洗浄します。

各ウェルから培地を取り出すときは、オルガノイドに触れたり、ピペットに吸い込んだりしないことが重要です。これにより、オルガノイドに修復不可能な損傷を与える可能性があります。このような場合は、オルガノイドを廃棄するのが最善です。

次に、シングルチャンネルp200ピペットを使用して、各オルガノイドウェルから残っているすべての液体を慎重に取り出します。次に、模擬感染用の1x earle's solutionまたはzika virus solutionのいずれかを50マイクロリットルすばやく各ウェルに加えます。終了したら、各オルガノイドが完全に沈んでいることを確認し、プレートを摂氏37度のインキュベーターに2時間戻します。

ウイルス曝露が完了したら、オルガノイドの各ウェルを200マイクロリットルのPBSで洗浄します。オルガノイドを15秒間沈殿させてから、シングルチャンネルp200ピペットを使用してPBSを取り出します。最後に、200マイクロリットルの新鮮な神経誘導培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。

DAPI、ホスホビメンチン、TBR2、MAP2による染色を組み合わせることで、オルガノイド内で形成される皮質構造を示すことができます。これらの構造には、各ロゼット内の心室ゾーン、心室下ゾーン、中間ゾーン、および皮質プレートが含まれます。オルガノイドを108日目まで培養すると、その後の発達段階を観察することができます。

このタイプのオルガノイドでは皮質の層状化はそれほど目立ちませんが、神経膠形成への自然な切り替えは、生体内と同様に起こります。ジカウイルス感染の3日後、オルガノイドのサイズの違いが明らかになります。この差の規模は、オルガノイドに適用されるウイルス感染の多様性に依存します。

このオルガノイドサイズの差は、感染したオルガノイドがバラバラになり始めるまで、次の週に増加します。3日後、感染したウェル内の細胞残骸も模擬ウェルと比較して増加します。この手順を試みる際には、生存可能な感染性物質が使用されているため、安全な実験室の慣行に従うことが重要です。

この手順に続いて、免疫組織化学やRNACなどの他の方法を実行して、神経発生ジカウイルス感染に関与する生物学に関する追加の質問に答えることができます。