Name: 脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカ ウイルス感染症をモデル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶ幹細胞由来脳オルガノイドを用いたジカウイルス感染モデル構築法。発達中の人間の脳における感染メカニズムと微小頭症との関連性を解明し、創薬スクリーニングや神経発達障害治療戦略の開発に貢献する。

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著者は、プリシラ ・ l ・ ヤンとハーバード大学医学部のドミニク ・ j. Burri を初期進展と ZIKV の定量化の助けに感謝します。我々 はまたナサニエル ・ d. カークパ トリックをイメージングのサポートに感謝したいと思います。けは、精神医学の研究とハーバード大学幹細胞研究所のスタンリー ・ センターによって支えられました。

1。 iPSC から脳オルガノイドの作成/hESC 2D 文化 (0 日) 注: このプロトコル幹細胞 (SC) メンテナンスはビトロネクチンまたは Geltrex と SCMM 培地で行われている前提としています。基板。代替、高蛋白質の幹細胞を培養メディアを使用している場合は organoid 形成を開始する前に移行 SC 文化 SCMM が少なくとも 2 つの通路のことをお勧めします。プロトコルはフィーダー ベース SC 文化方法でテストされていません。
<ol><li>による正規 SC メンテナンス方法 25 , 26, 50%-70% 合流する文化をもたらします。これは文化法および細胞ラインに依存することができますが、これは通常、通過後 3-4 日 。
	注:6 ウェル プレートから約 2 井戸オルガノイドの完全 96 ウェル プレートを生成する必要がある</li>。
	<li>検出の差別化の健康なコロニー形態を確保するための 10 の X-20 X 倍率で明視野顕微鏡を介して文化を検査します</li>。
	<li>(Rock 阻害剤) 湯浴で雪解け 50 μ L バイアル 50 mM Y-27632 の 37 ° C と室温に剥離酵素試薬の 2 mL をもたらす SCMM</li>。
	<li>、超低添付ファイル (ULA) U 下 96年ウェル プレート、マルチ チャンネル P200 ピペット 25 mL 試薬槽を準備します</li>。
	<li>SCMM 50 mL のコニカル チューブに分注 45 mL と 50 mM Y-27632 の 45 μ L を追加。Triturating で徹底的にミックスします</li>。
	<li>真空吸引 SCs を含む 2 つの井戸とも P1000 ピペットを使用してそれぞれに酵素無料剥離試薬 1 mL をすばやく追加。4 分の 37 ° C の定温器でプレートを孵化させなさい</li>
	<li>真空吸引扱われた井戸と P1000 ピペットを使用して各ウェルに酵素剥離試薬の 1 つの mL を追加します。
	<ol><li>加温追加 5 分の 37 ° C の定温器のプレート</li>
		<li>は、プレートを削除し、扱われた井戸を調べます。集計されたセルを分割するプレートを軽くタップします。大きな細胞塊がまだ表示されている場合インキュベート 37 でさらに 2 分間プレート ° C. 繰り返しクラスターが、肉眼では表示されなくなるまでこの手順します</li>。
	</ol></li> <li>セルは正しく解離、解離酵素を非アクティブ化する各ウェルに SCMM 1 mL を追加。50 mL コニカル チューブに細胞懸濁液 4 mL をプール、小さな細胞数の因数を取る。
	<ol><li>任意の残り、未処理井戸をメンテナンス プレートで 37 ° C の定温器に戻ります</li>。
	</ol></li> <li>、カウントしながら 300 x g で 5 分間の細胞懸濁液を遠心分離</li>
	<li>SCMM + Y-27632 の量を計算して、セルの合計数を決定する 60,000 セル/mL の懸濁液を達成するために必要となるソリューションです</li>。
	<li>掃除機で注意深く、上清を吸引し、SCMM + Y-27632 の計算された容積を追加ソリューション。5 〜 10 倍を混ぜて 5 mL ピペットを使い、均一な細胞の懸濁液を確保します</li>。
	<li>はすぐに試薬リザーバーに細胞懸濁液を転送し、マルチ チャンネル P200 ピペットを使用して ULA U 下 96年ウェル プレートの各ウェルに 150 μ L をピペットします。これは当初それぞれ 9,000 細胞から成る 96 の個々 オルガノイドを生成します</li>。
	<li>遠心分離機 150 x g で 1 分間でプレート</li>
	<li>37 ° C の定温器にプレートを置き、48 h. のプレートを邪魔しないで</li>
</ol> 2。脳におけるメンテナンス (日 2) 50 mL コニカル チューブ 50 mm Y-27643 <ol><li>SCMM 17 準備 17 mL μ L。SCMM + Y-27632 を暖かい湯浴で 37 ° c ソリューションです</li>。
	<li>は、インキュベーターから organoid プレートを取るし、最初の行の井戸の端から中をゆっくり描く P200 のマルチ チャンネル ピペット 75 μ L に設定を使用しています。媒体が描画されると、すぐにバラセルとオルガノイドを持ち上げるために媒体のバックを追放します。行ごとにこの手順を繰り返します 。
	注:この手法は、以下という、&#34;、分散 &#34; 懸濁液に細胞の残骸と、organoid を持ち上げます。メディア変更で削除することができます、懸濁液の中の小さい破片、organoid は急速に、井戸の底に沈みます。これは、培養中の細胞の残骸で休んでから、organoid を防ぐのに役立ちます。
	<ol><li>すべての井戸を分散している後は、待つ 15 s、オルガノイドを各ウェルの底に沈んでいることを確認します</li>。
	</ol></li> <li>ゆっくりと慎重にもマルチ チャンネル P200 ピペットを使用して各媒体の 75 μ L を吸引し、廃棄物の貯留層に分配します 。
	注:ほとんどのユーザーは、定期的にフィードの中に時折、organoid を吸い出しなさい。これは、時間の約 1% に発生します。十分な organoids が実験時点まで存続することを確認するそれに応じて計画してください</li>。
	<li>転送 SCMM + 試薬リザーバーに Y-27632 ソリューションおよびマルチ チャンネルの P200 ピペットを使用して各器官毛細に 150 μ L を分注します</li>。
	<li>37 ° C の定温器にバック プレートを配置します</li>。
</ol> 3。脳におけるメンテナンス (日 3) <ol><li>SCMM 37 ° C、この時間 のない Y-27643 に 17 mL をウォームします</li>。
	<li>マルチ チャンネルの P200 ピペット 100 μ L に設定と分散におけるプレートのすべての井戸 (手順 2.2 参照)。Organoids が、井戸の底に沈んでいるように待機 15 s.</li>
	<li>廃棄物の貯留層を準備し、ソースの貯留層に温めた SCMM を転送します</li>。
	<li>慎重に各ウェルから培地 125 μ L を吸引し、マルチ チャンネルの P200 ピペットを使用して新鮮な SCMM の 150 μ L に置き換えます</li>。
	<li>37 ° C の定温器にバック プレートを配置します</li>。
</ol> 4。脳におけるメンテナンス (日 4 +) 注: 感染まで毎日この定期的なメンテナンスを実施します。
<ol><li>4 日にフィードを開始する前に神経誘導 (NI) メディアの準備します。
	<ol><li>雪解けと共に 1 つ、2 mg/mL のヘパリンの 250 μ L 因数 5 mL バイアル 100 X N-2 サプリメント。ヘパリン、100 X N-2 の 5 mL と 100 の 5 mL を 250 μ l 添加 DMEM の 500 ml X MEM NEAA/f12 キー + GlutaMAX。無菌フィルター 500 mL フィルターで混合液 。
		注:使用しないときに 4 ° C で NI を維持します。NI 続く 2 週間前に新鮮な媒体を準備する必要があります</li>。
	</ol></li> <li>37 NI 中の 17 mL を暖かい ° C</li>
	<li>マルチ チャンネルの P200 ピペット 100 μ L に設定と分散におけるプレートのすべての井戸 (手順 2.2 参照)。Organoids が、井戸の底に沈んでいるように待機 15 s.</li>
	<li>廃棄物の貯留層を準備し、ソースの貯留層に暖められた NI を転送します</li>。
	<li>慎重に各ウェルから培地 125 μ L を吸引し、マルチ チャンネルの P200 ピペットを使用して新鮮な NI の 125 μ L に置き換えます</li>。
	<li>37 ° C の定温器にバック プレートを配置します</li>。
</ol> 5。ZIKV Organoid 感染 (〜 24 日) 注: 分化、そこの wi の約 3 週間後ll が大規模な上皮細胞内構造とロゼット ZIKV に高い感受性となる organoid 内に表示します。
<ol><li>をもたらすアール &#39; 湯浴で 37 ° c s 1 X バランスの取れた塩ソリューション (EBSS)、1 X PBS および NI</li>。
	<li>Dilute 対象感染症に 1 X EBSS で濃度既知の ZIKV の多様性感染症 (MOI). 
	注:異なるモアの滴定は、ウイルス性の用量反応を達成するために推奨されます。これはウイルスの系統によって異なる場合があります。ATCC VR 1838 年と 1843 ATCC VR、典型的な MOI 値 0.1 から 10 の間の範囲です).</li>
	<li>は、organoid 単一チャネル P200 ピペットを使用してからすべての媒体を慎重に取り外します。それぞれよく p200 でもマルチ チャンネル ピペット洗浄に使用、organoids に 1x PBS の 200 μ L をすばやく追加します</li>。
	<li>は、organoid 単一チャネル P200 ピペットを使用してからすべての媒体を慎重に取り外します。EBSS 専用 (モック感染) またはよくし、organoid は水没を確認 ZIKV ウイルス ソリューション X 1 の 50 μ L をすばやく追加するには。研究のために感染する、各器官毛細の繰り返し</li>。
	<li>2 h. の 37 ° C の定温器にバック プレートを置き 
	注:この期間する必要があります邪魔されず organoids に比べて成長に大きく影響しないために、モック感染オルガノイドをインキュベートします</li>。
	<li>ウイルス培養する前に約 30 分の 50 mL の円錐管に NI の完了した分注 25 mL、湯浴で 37 ° C にもたらします</li>。
	<li>ウイルス曝露後、各ウェルの 1x PBS の 200 μ L でオルガノイドを洗って、15 s とシングル チャネル P200 ピペットを使用して除去 1 × PBS に甘んじるオルガノイドを許可します</li>。
	<li>それぞれに新鮮な NI の追加 200 μ L とインキュベーターに戻します。
	<ol><li>オプション: 日 0 時間のポイントは、organoids は、感染後 1 時間にイメージを作成する場合があります</li>。
	</ol></li> <li>125 μ NI 分散法による他のすべての日を置き換えることによって文化を継続する (手順 4 を参照)。感染 ZIKV 粒子が含まれますために必ず使用済みメディアのヒントは、適切に処分しています</li>。
</ol>

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ZIKV 感染症を調査する人間の脳オルガノイドを利用する場合を考慮するいくつかの注意事項があります。1 つの重要な考慮事項は、における形成と構造は形成する幹細胞ラインに大きく依存。同質遺伝子組み換え系統; を含む細胞間を比較するときの世話します。結論は複数のサブクローンと理想的な複数の幹細胞ラインを使用してお勧めします。さらにこの細胞の違い、ため、オルガノイドの適切な分化が発生していることを確認するためのパイロット実験が推奨されます。上皮細胞内構造が明視野顕微鏡による目に見える中、PAX6 やリン酸化ビメンチンなど神経分化マーカーを参照する qRT PCR またはセクショニングの実験を行うことも勧めします。
1 つはまた同じセル行内オルガノイドの間でかなり変動を予測する必要があります。プロトコルの性質という数と上皮細胞内構造体のサイズは、個々 organoids によって異なります。通常、1 つは少なくとも 2 つが大きく期待できる (&gt; D24 による直径 200 μ m) あたり器官毛細神経ロゼット。このため、感染時におけるサイズの変化の観察などの縦方向の研究が特に啓発的です。バッチ間変動も生じる、この最も可能性の高い原因と不正確なセルをカウントまたは播種します。複数のカウントを実施する、細胞懸濁液は ULA U 下 96年-ウェル プレートに播種する前によく混合されていることを確認することをお勧めします。
オルガノイド ウーラ U 下 96年-ウェル プレートで培養、プレートの縁の周りのかなりの蒸散効果を見る予定です。PBS でこれらの井戸を埋めるし、センター 60 井戸でのみ動作に最適です。蒸発のため外側井戸オルガノイドを中心、彼らの成長と分化に影響を及ぼす可能性が高いものよりも異なる条件に公開されます。実験に必要となるオルガノイドの数を計画するときは、これにご検討ください。また、オルガノイド培養培地の変色のため表示されます約 30 日後 96 ウェル フォーマットにはびこるに始まります。過去 30 日間オルガノイドを取ることを計画する場合は、ウーラ 24 ウェル プレートに、オルガノイドを転送することをお勧めします。転送を実施するしには、開口部は organoids 自身よりもはるかに大きいので P1000 先端をカットするはさみを使用して、ピペッティングにより、オルガノイドを転送します。
人間の脳 organoids フィールドの神経発達や病気の理解を進める上で大きな可能性を保持します。研究者が必要に応じてプロトコルを変更することをお勧めします。たとえば、特定の解剖学的領域のウイルスの影響を探索する特定の細胞型への分化効率を改善するためにパターン形成要因を実装する 1 つ。ZIKV の神経発達の効果はまだよく理解されていない、しかし、この新しいアプローチは研究者に感染のメカニズムの調査の迅速なアクセス可能な高スループット方法を与えます。

ジカ (ZIKV) アメリカ、フランス領ポリネシア、ミクロネシアに急速に広がっているし、最近の十字このような神経疾患につながる発展途上の胎児の脳に感染する胎盤バリア1,2に示されています。小頭症3,4,5,6 。これらの患者の生活と治療の現在の不足に長期的な影響は、研究者や臨床医は、ZIKV の感染および複製の背後にあるメカニズムの理解を深めるためにスクランブルをかけることにつながっています。以前の調査された各種生理学的に関連する細胞の種類7,8,9、10と生体内での in vitroシステムの ZIKV 感染症免疫と免疫不全マウス11,12,13ヒト以外の霊長類14,,1516。これらの従来の技術に加えて、いくつかのグループは発展途上の人間の脳の ZIKV 感染症についての詳細を理解する幹細胞由来脳オルガノイドを実装しています。これらのグループは、小頭症の表現型17,18を確認、ウイルス エントリ19にリンクされている受容体を調査、感染症20生理学的反応を調べる人間の脳オルガノイドを利用して,21、および可能性のある薬物候補22の画面。ここで19、発展途上の人間の脳の ZIKV 感染症の理解を深めるために示したように、急速に生産と幹細胞由来脳オルガノイドを感染させるためのテクニックが記載されています。
Organoids は標準的な多能性幹細胞 (PSC) の培養から形成される、のでこの技法は発展途上の脳のウイルス感染について答えられる様々 な科学的な質問のできます。たとえば、CRISPR 工学はほとんど生体内で遺伝的研究19よりも速い速度で organoid 感染する前にこれらの PSC のラインを変更する使えます。さらに、標準の 2 次元 (2 D) 分化文化で違っても内因、にとって重要な複雑な細胞アーキテクチャ organoids 展示し、最近の研究は、このアーキテクチャが感染時に中断されることが示されています。21。最後に、オルガノイドを生成する比較的低コストにより高いスループット実験・検診体内モデルと比較した場合。その一方で、ZIKV を勉強するオルガノイドの使用率にいくつかの欠点があります。Organoids は 2D の文化よりもはるかに多く生体関連、オルガノイドの三次元 (3 D) 性質の評価において新たな課題があります。イメージングとオルガノイドの解離より多くの機器と標準的な 2 D の文化よりも資源の大規模な投資を伴う傾向があります。さらに、血管およびウイルス感染のさまざまな側面に興味がある研究者は、代替のプロトコルを追求する助言されるので生体内でモデルに存在している免疫のコンポーネント オルガノイドを欠いています。
人間オルガノイド培養、細胞の形成技術の数があり、彼らは通常パターンまたはというカテゴリに分類します。パターン化されたメソッドは、特定の系統23へ分化をプッシュする wnt シグナル、BMP、TGFβ、および他のシグナル伝達経路を調節する因子を実装します。ここで、説明などという方法を誘導多能性幹細胞 (Ips) のための傾向の活用しヒト胚性幹細胞 (hESCs) で神経系統に区別するために既定の24。分化の約 3 週間後、結果 organoids は初期の脳の発達で観察されるいくつかの細胞の種類を含む大規模なバイオミメティック上皮細胞内構造体で構成されます。
標準、無料のフィーダーの PSC 文化からオルガノイドの生産および ZIKV のこれらのオルガノイドを感染手法が完全に表示されます。フィーダー無料 Psc に必要な培養方法については、前の方法出版物25,26を参照してください。さらに、一貫性のある複数の実験のためにウイルス量を適用するために、事前に慣性モーメントを計算することが重要です。これは、オーバーレイ媒体、インキュベーション、免疫染色と治療が続きます、Vero 細胞への感染を行うことにより行われます。説明、このテクニックの方法は、前述の19,27をされています。
PSC 文化 50%-70% のターゲット合流点に達すると、細胞は、解離、超低添付ファイル 96 ウェル プレートに集約。セルは、xeno 無料幹細胞維持培地 (SCMM) で 3 日間維持して、文化の残りの部分の神経誘導メディアに変換されます。3 週間、オルガノイドを設けて、一度感染症が実施できます。日常的に感染症を次の週の間に撮影し、研究者は進歩的な細胞死と、organoid の混乱を確認します。研究者は可能性がありますもこの転写を行う時間やプロテオームのプロファイリングで、オルガノイドを切り離して考えます。イメージング、セクショニングおよび lightsheet メソッドが推奨され、研究者が感染症やウイルスの複製、オルガノイドの神経前駆細胞 (NPC) 集団の内で特に高いレベルを見ると期待できます。最終的には、このテクニックは、急速に低コストと限られた機器と人間の脳のウイルス感染のメカニズムを解明する研究者をことができます。

<table><tbody><tr><td>酵素フリー剥離試薬、ReLeSR</td><td>StemCell Technologies</td><td>5873</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン酸添加 DMEM/F12 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td>(+)2.438 g/L 重炭酸ナトリウム、(+)ピルビン酸ナトリウム</td></tr><tr><td>N-2 サプリメント (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必須アミノ酸 (MEM-NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30029.02</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Filter (500mL)</td><td>Millipore</td><td>220009-140</td><td></td></tr><tr><td>Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-well, Round Bottom</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL)</td><td>Integra</td><td>4312</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite マルチピペット L12-200XLS+</td><td>レイニン</td><td>17013810</td><td></td></tr><tr><td>大型遠心分離機、培養プレート対応</td><td>Thermo Scientific</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>培養プレート 遠心分離機 ローター</td><td>Thermo Scientific</td><td>75005706</td><td></td></tr><tr><td>Vero Cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>必要に応じてウイルス増殖用</td></tr><tr><td>ジカウイルス(ウガンダ株)</td><td>ATCC</td><td>VR-1838</td><td>他の株は、</td></tr><tr><td>ジカウイルス(プエルトリコ株)</td><td>ATCC</td><td>VR-1843</td><td>他の株は</td></tr><tr><td>、リン酸化ビメンチン</td><td>MBL</td><td>D076-3</td><td>マウスポリクローナル、&nbsp; 1:250</td>希釈</tr><tr><td>TBR2アブ</td><td>カム</td><td>ab23345</td><td>ウサギポリクローナル、1:300</td>希釈</tr><tr><td>MAP2</td><td>Novus</td><td>NB300-213</td>チキンを使用することができます<td>ポリクローナル、1:1500</td></tr>希釈<tr><td>GFAP</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>CST12389S</td><td>ウサギポリクローナル、1:200希釈</td></tr><tr><td>D1-4G2フラビウイルスエンベロープタンパク質</td><td>EMDミリポア</td><td>MAB10216</td><td>マウスモノクローナル、1:500</td></tr>希釈<tr><td>切断カスパーゼ-3</td>細胞<td>シグナル技術</td><td>9661</td><td>ウサギポリクローナル、1:200</td></tr>希釈<tr><td>488抗マウスIgG</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A-11001</td><td>ヤギ ポリクローナル、1:1000</td></tr><tr><td>594 抗ウサギ IgG</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A-11037</td><td>ヤギ ポリクローナル、1:1000 希釈</td></tr><tr><td>647 抗ニワトリ IgY</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A-21449</td><td>ヤギ ポリクローナル、1:1000 希釈</スパン></td></tr></tbody></table>

脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカ ウイルス感染症をモデル化

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

影響を受けやすい集団でジカ ウイルス (ZIKV) の最近の出現は、小頭症の急激な増加と新生児の神経発達等につながっています。蚊がウイルス感染の主なルートが、それはまた、性的接触と垂直の母-胎児感染を広めるため示されています。伝送、ZIKV の独自のウイルス親和性のための後者の場合、ウイルスでは、発展途上の脳の神経前駆細胞 (Npc) を主にターゲットと考えられます。
ここで ZIKV 感染、および結果の小頭症のモデリング手法、発生した人間脳オルガノイドを公開するとき説明されて ZIKV のライブです。オルガノイドの神経前駆細胞集団内でウイルスの高レベルを表示、時間をかけて深刻な細胞死と小頭症を展示します。この三次元脳におけるモデルでは、観察し、発展途上の人間の脳の ZIKV 感染症潜在的介入種照合実験を行う研究者をことができます。モデルは、標準的な二次元方法上関連性の向上を提供し、ひと特異細胞アーキテクチャと動物モデルでは不可能な蛋白質の表現が含まれています。

Organoid 成立の日、SC 文化する必要があります図 1(A ~ C)に示すように 50%-70% の合流を彼らログ成長期であります。文化は、明確なエッジを持つ丸みを帯びたコロニーを形作るべきである、井戸は図 1(D E)の分化の明確なはずです。差別化が発生している場合は、オルガノイドを作成する前に、少なくとも 1 日プレート内で影響を受ける領域をきれいにする - 削除する選択を実施することをお勧めします。文化の大部分は区別される場合は、余分な通路を実施、新しいバイアルを解凍または幹細胞の培養技術、organoids が純粋な幹細胞の培養によって形成されていることを確認するを変更する必要があります。
無料の酵素、酵素分離試薬処理の組み合わせによる解離は、カウント時に観測された細胞の小さな集合体がまだかもしれないけれどもほとんど単一のセルにつながるはずです。カウント精度に影響を与える可能性がありますが小さな集合体の存在は organoid 形成を妨害する表示をされません。複数のカウントは、1 サンプルあたりの作られています、さらに細胞を複数形に解離時間を増やす必要がありますカウント 20% 以上異なる場合は、それをお勧めします。
一度セルをシードして ULA U 下 96年ウェル プレート (図 2A) でスピンダウン、各井戸の底で細胞のフラット、高密度シートとして表示されます。セルは、次の 2 日にわたってゆっくりと集計されます。機械力が緩く形成された骨材を混乱させるようにこれらの 48 時間の間にプレートを邪魔しないようにお勧めします。最初の 10 日間、organoid 球状、大抵し、600 800 μ m (図 2B) に ~ 300 μ m からなります。10 日目と 20 日目 organoid に表示し始めるより多くの観察可能な構造 (図 2C E)。24 日までに、研究者が明視野顕微鏡 (図 2F) 経由でロゼットのような構造を観察するはずです。文化を続けながらこれらの上皮細胞内構造が数日間 (図 2G) 量およびサイズの増加します。フィードの中に研究者は特に文化の最初の 2 週間の間に各井戸の底に収集破片のかなりの量を注意してください。手順 2.2 で説明した分散技術は、複数のフィード (図 3A) 上の蓄積からアポトーシスの破片を防ぐためにこの細胞の破片のほとんどを削除します。この残骸は、イメージングを妨げることができることそれを観察し、感染で誘導される細胞死を定量化するが難しい、分化に影響を与えることができる近隣 organoid に非対称シグナリングを提供したり。分散技術が正しく行われている場合、これはする必要があります (図 3B C, 3 D 電子) を削減します。
凍結切片又は lightsheet イメージング、organoids 内に形成する皮質構造を検査することをお勧めします。日 25 オルガノイドのロゼット構造と心室のゾーンは DAPI (図 4A) とリン酸化ビメンチン (図 4B) 染色で明確に表示されます。TBR2 の存在 (図 4C) 外側の移行を示唆する形態と中間体の前駆を形成することを示します。MAP2 + (図 4D) ニューロンはそれぞれのロゼットの外側の領域を設定します。これらのタンパク質から 1 つは心室ゾーン (VZ) や脳室下帯 (SVZ)、中間帯 (IZ) 内各ロゼット皮質板 (CP) を可視化できる (図 4E、4 e ')。1 つは、開発の後の段階を観察するためにこれらのオルガノイドを文化を継続できます。皮質の階層化は organoid のこのタイプのように顕著ではない、これは生体内では同じよう gliogenesis に自然のスイッチは多く発生は。これは日 108 organoids、セルの大部分が MAP2 または GFAP を表現で観察できる (図 4F-私)。
ユーザーが organoids (図 5A B) に適用されるウイルスの慣性モーメントによって、ZIKV 感染後約 3 日間におけるサイズの違いを参照してくださいに望む可能性があります。これらの 3 日後があります増加細胞の残骸のモックの井戸に比較して感染した井戸。Organoid サイズのこの違いは、次の週、感染した organoids 開始を離れて (図 5C D) を破るまでに増加します。様々 なアッセイは、ウイルスの RNA の抽出およびセクショニング (材料のテーブルで報告された抗体を推奨) などの感染メカニズムを調査するためこの時点で使用可能性があります。セクショニング、時にユーザーは、上皮細胞内構造の根尖部におけるウイルスの大規模な存在観察し、神経前駆細胞 (Npc) の ZIKV 感染症 (図 6) の感受性を示唆しています。断面オルガノイドの蛍光も感染 organoids (図 7) 切断カスパーゼ 3 発現増加が表示されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig1.jpg"> 
図 1: Organoid 形成前に幹細胞コロニーの形態。 植民地は、一貫性のあるオルガノイドの数が多いを生成する解離の時に 50%-70% の合流をする必要があります。(A)スパース、最近シード文化に到達していないログ成長フェーズ、多く organoids は生成されません。(B)細胞が適切な合流点に達すれば、それらは、解離の準備ができて。これらの植民地が分化のクリアされることを確認する検査が重要です。(C)余りにずっと取られるコロニー上空の合流点に達するし、organoid 形成には推奨されません。この状態で文化はより細胞を含む可能性があります。(D)コロニー エッジは付けるべきである、中心部の丸い細胞の一貫した細胞の形態と若干延長端に向かって細胞。(E)最小限の分化は文化に存在する必要があります。大きく、平らにされた細胞の中心または植民地 (白い矢印) の枠で観察される文化の 1 割以上を占めて、ピックアップを削除または追加の通路が制服の幹細胞集団を形成するため行われているをお勧めします。<a href="//ecsourc%20href="></a>e.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig1large.jpg"ターゲット ="_blank"&gt; この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig2.jpg"> 
図 2: 時間の経過と共に脳における成長します。 
(A) 2 D から脳オルガノイドの生産のための図の Psc xeno フリー、フィーダー フリー培地で維持されます。(B)最初の 8 日間、organoids 残りますほとんどいくつかの検出機能を備えた球状。(C ・ E)は、500 μ m に 10 日目で約 300 μ m から、organoid の直径の範囲が、明確な地域、オルガノイドの周囲を検出が開始されます、球形の形を失います。彼らは、オルガノイドを生成する細胞ラインに大きく依存し、直径約 1 mm のサイズに増加していきます。(F)分化の約 20 日後ユーザーは、ほとんどオルガノイドの明確な周辺地域における上皮細胞内構造 (黒矢印) の形成を観察するが。これらは模倣して大脳皮質の樹状突起と基底構造を持つリングのような形態があります。(G)これらの上皮細胞内の構造は成長し、約 20-30 日間のサイズが増加していきます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig3.jpg"> 
図 3: 分散による細胞の残骸の清算フィード技術。 Organoid 成長中に大量の細胞死が予想される、organoid 基礎を取り巻く細胞の残骸の蓄積につながることができます。(A)描かれた分散技術は、各フィードの中にこの破片のほとんどを削除する研究者をことができます。マルチ チャンネル P200 ピペットを使用してこれを行うに使用される媒体をゆっくり引くし、急速に懸濁液に organoid や細胞の破片を持ち上げるそれを追放します。その時点で通常のフィードを行うことができる、井戸の底、organoid すぐにドロップします。(B)前に、とかなりゴミ削減を示しています(C)分散摂食後 6 日目 organoid の例です。日 18 organoid 前(D)に、と(E)分散供給後で示すように、これは数週間続きます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig4.jpg"> 
図 4: 免疫組織化学による脳オルガノイドのキャラクタリゼーション。 脳オルガノイドの Lightsheet 画像を形成する細胞アーキテクチャの例を提供するために表示されます。日 25、DAPI (A)蛍光体, (B)はそれぞれ個々 のロゼットと心室のゾーンを示すと。(C) TBR2 ラベルを外側に移行する中間の前駆細胞と MAP2 (D)ラベル ニューロン皮質板を形成しています。(E, E')これらのタンパク質の組み合わせは明らかに脳におけるモデルの皮質発達の反復を示します。(F-私)日ごとに 108, GFAP + と MAP2 +、organoid の多くを作成する細胞の混合物、gliogenesis が発生しました。VZ SVZ 心室ゾーンを = = 脳室下帯、IZ = 中間ゾーン、CP = 皮質板。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig5.jpg"> 
図 5: 感染したオルガノイドの劣化します。 
(A)明るいフィールド画像の嘲笑および MOI で ZIKV に感染した脳 organoids = 0.1 と 10。後に撮影されたすぐに感染 (0 日目) で、同様に 3 と 6 日感染後。(B ・ C)周囲のモック(B)と(C) MOI で ZIKV に感染した細胞の残骸の明視野画像 10 脳 organoids 3 日後感染を =。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig6.jpg"> 
図 6: Cryosection との感染 organoids 。 日 24 オルガノイドの MOI で ZIKV にさらされた = 0.1、および cryosectioned の 6 日後。この段階では、神経前駆細胞と放射状グリアが存在する、organoid の心室、脳室下帯、および中間ゾーンでウイルスの明確な存在です。(A)これらの上皮細胞内領域の染色性が核を経由で (白い矢印) により明確に表示が頂端表面のまわりのリングのような構造を形成する核の高密度。(B)ウイルスの封筒の染色に、1 つはこれらのロゼット構造 (白い矢印) ウイルスの比較的高いプレゼンスを観察できます。さまざまな正体不明の末梢細胞に存在するウイルスの少量があることに注意してください。(C ・ D)MAP2 または他のニューロン固有汚れを神経細胞に感染するウイルス ウイルスの汚れである場合に表示されない文化存在があること。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig7.jpg"> 
図 7: 感染した organoid のカスパーゼ 3 を蛍光抗体法を切断します。 感染後 1 つは、organoids 内に発生する細胞死のメカニズム解明のためアポトーシス指標を使用可能性があります。この例では、1 日 24 organoids MOI で ZIKV にさらされた = 0.1、および cryosectioned の 6 日後。感染していないオルガノイドを示さない(A)ウイルスの封筒 (4 2 蛋白質)、および組織で発生する恒常性のアポトーシスによる切断カスパーゼ 3 の最小量。(B)感染のロゼットは、アポトーシスの増加されたレベルを表示し始めます。(C) 4 2 また染色による重症感染症を示しているロゼットは、これらの地域に裂かれたカスパーゼ 3 の高レベルを示す傾向があります。感染症の重症度と感染したロゼット内切断カスパーゼ 3 式の直接的な相関関係があります。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルでは、発展途上の人間の脳のジカ ウイルス感染症をモデルに使用されるテクニックについて説明します。野生型または設計の幹細胞ラインを使用して、研究者は、様々 なメカニズムや初期の脳の感染症やジカ ウイルス感染胚の結果小頭症影響を与える治療法を明らかにするのにこの方法を使用可能性があります。

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

この手順の全体的な目標は、幹細胞由来の脳オルガノイドを使用して、発生中のヒト脳におけるジカウイルス感染をモデル化することです。この方法は、どの細胞が感染する能力があるのか、どのタンパク質が感染経路に関与しているのかなど、生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、初期のヒト感染を模倣し、ハイスループットアッセイに利用できること、およびCRISPRなどのフォーカス遺伝学的手法と組み合わせることができることです。この手法により、ジカウイルスの感染メカニズムを解明することができます。また、薬物スクリーニングやウイルスの擬似型分析など、他のシステムにも適用できます。通常の幹細胞維持法を使用して、培養物を50%から70%のコンフルエントにします。10倍から20倍の倍率で明視野顕微鏡を使用して培養物を検査し、コロニーが検出可能な分化のない健康な形態を有することを確認します。ゼノフリー幹細胞維持培地を温水浴で摂氏37度まで持ち込み、2ミリリットルの酵素剥離試薬とストックロックインヒビターの50マイクロリットルバイアルを室温で解凍します。次に、超低アタッチメントのUボトム96ウェルプレート、マルチチャンネルp200ピペット、25ミリリットルの試薬リザーバーを準備します。次に、45ミリリットルのメディアを50ミリリットルの円錐管に分注します。45マイクロリットルの岩石阻害剤を追加し、混合物を三量化して阻害剤を完全に混合し、続いて2〜4個をバージョンで混合します。幹細胞を含む6ウェルプレートの2ウェルを真空吸引し、各ウェルに1ミリリットルの酵素フリー剥離試薬を迅速に加え、プレートを摂氏37度で4分間インキュベートします。次に、処理したウェルを真空吸引し、各ウェルに1ミリリットルの酵素分離試薬を加えます。摂氏37度で5分間インキュベートした後、プレートをインキュベーターから取り出します。プレートを軽くたたいて、凝集した細胞を分割します。次に、顕微鏡で細胞を検査します。大きな細胞クラスターがまだ見える場合は、プレートを摂氏37度でさらに2分間インキュベートします。クラスターが肉眼で見えなくなるまで、この手順を繰り返します。細胞が適切に解離したら、各ウェルに1ミリリットルのゼノフリー幹細胞維持培地を添加して、解離酵素を不活性化します。細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐形チューブに引き込み、細胞計数用の小さな分注を取ります。遠心分離中に、細胞をカウントし、ミリリットル懸濁液あたり60, 000細胞を達成するために必要な再懸濁液量を決定します。慎重に上清を除去し、岩石阻害剤を含む培地で1ミリリットルあたり60, 000細胞で細胞を再懸濁します。5ミリリットルのピペットを使用して、細胞を5〜10回穏やかに混合し、均一な細胞懸濁液を確保します。すぐに細胞懸濁液を試薬リザーバーに加え、マルチチャンネルp200ピペットを使用して、超低アタッチメントの96ウェルプレートの各ウェルに150マイクロリットルを移します。次に、プレートを150 x Gで1分間遠心分離し、プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れます。プレートを48時間邪魔しないでください。2日目から、50ミリリットルの円錐管に17マイクロリットルのストックロック阻害剤を含む17ミリリットルの培地を準備します。混合物を温水浴で摂氏37度に温めます。インキュベーターからオルガノイドプレートを取り出し、マルチチャンネルp200ピペットを使用して、最初の列のウェルの端から75マイクロリットルの培地をゆっくりと引き出します。次に、すぐにウェルに戻し、緩んだ細胞やオルガノイドを持ち上げます。この分散プロセスを各行に対して繰り返します。オルガノイドが各ウェルの底に沈んだことを確認するために15秒待ってから、マルチチャンネルp200ピペットを使用して各ウェルから75マイクロリットルの培地をゆっくりと慎重に吸引し、廃棄物リザーバーに分注します。次に、岩石阻害剤を含む培地を試薬リザーバーに移し、150マイクロリットルの培地を各オルガノイドウェルに分注し、細胞を摂氏37度でインキュベートします。17ミリリットルの新鮮な培地を摂氏37度まで温めますが、今回は岩石阻害剤は含まれていません。100マイクロリットルに設定されたマルチチャンネルp200ピペットを使用して、前述の分散プロセスを繰り返し、オルガノイドがウェルの底に沈んだことを確認するために15秒待ちます。次に、各ウェルから125マイクロリットルの培地を慎重に吸引し、150マイクロリットルの温めた培地と交換します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れます。ここに示されているレシピに従って培地を準備し、混合溶液を500ミリリットルのフィルターで滅菌ろ過します。4日目から24日目頃に細胞が感染するまで、神経誘導培地を用いて1日おきに定期的なメンテナンスを行う。濾過したら、17ミリリットルの神経誘導媒体を摂氏37度まで温め、残りを摂氏4度で保存します。マルチチャンネルp200ピペットを使用して、100マイクロリットルに設定し、オルガノイドプレートのすべてのウェルを以前に示しました。オルガノイドがウェルの底に沈んでいることを確認するために15秒待ちます。各ウェルから125マイクロリットルの培地を慎重に吸引し、125マイクロリットルの新鮮な神経誘導培地と交換します。オルガノイドがジカウイルス感染の準備ができるまで、このネラル誘導の偉業を隔日で繰り返します。アールの1倍バランス塩溶液、1倍PBS、神経誘導培地を摂氏37度までの温水浴に入れます。次に、既知の濃度のジカウイルスを1x アール溶液中で、標的の感染多重度(通常は0.1〜10)に希釈します。p200ピペットを使用して、各オルガノイドウェルからすべての培地を慎重に取り出します。次に、オルガノイドを200マイクロリットルの温めた1x PBSですばやく洗浄します。各ウェルから培地を取り出すときは、オルガノイドに触れたり、ピペットに吸い込んだりしないことが重要です。これにより、オルガノイドに修復不可能な損傷を与える可能性があります。このような場合は、オルガノイドを廃棄するのが最善です。次に、シングルチャンネルp200ピペットを使用して、各オルガノイドウェルから残っているすべての液体を慎重に取り出します。次に、模擬感染用の1x earle's solutionまたはzika virus solutionのいずれかを50マイクロリットルすばやく各ウェルに加えます。終了したら、各オルガノイドが完全に沈んでいることを確認し、プレートを摂氏37度のインキュベーターに2時間戻します。ウイルス曝露が完了したら、オルガノイドの各ウェルを200マイクロリットルのPBSで洗浄します。オルガノイドを15秒間沈殿させてから、シングルチャンネルp200ピペットを使用してPBSを取り出します。最後に、200マイクロリットルの新鮮な神経誘導培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。DAPI、ホスホビメンチン、TBR2、MAP2による染色を組み合わせることで、オルガノイド内で形成される皮質構造を示すことができます。これらの構造には、各ロゼット内の心室ゾーン、心室下ゾーン、中間ゾーン、および皮質プレートが含まれます。オルガノイドを108日目まで培養すると、その後の発達段階を観察することができます。このタイプのオルガノイドでは皮質の層状化はそれほど目立ちませんが、神経膠形成への自然な切り替えは、生体内と同様に起こります。ジカウイルス感染の3日後、オルガノイドのサイズの違いが明らかになります。この差の規模は、オルガノイドに適用されるウイルス感染の多様性に依存します。このオルガノイドサイズの差は、感染したオルガノイドがバラバラになり始めるまで、次の週に増加します。3日後、感染したウェル内の細胞残骸も模擬ウェルと比較して増加します。この手順を試みる際には、生存可能な感染性物質が使用されているため、安全な実験室の慣行に従うことが重要です。この手順に続いて、免疫組織化学やRNACなどの他の方法を実行して、神経発生ジカウイルス感染に関与する生物学に関する追加の質問に答えることができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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胎児神経幹細胞のジカウイルス感染

ジカウイルス(ZIKV)は、新たな病原体であり、胎児の発育異常と小頭症に関連しています。効果的な感染性細胞培養システムの確立は、ZIKVの複製研究だけでなく、ワクチンや医薬品の開発にも重要です。この研究では、ZIKVに関連するさまざまなウイルス学的アッセイが示され、議論されています。...

ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

神経上皮組織の前例のない複雑さのために、人間の脳の発達をモデル化することが妨げられてきました。ここでは、ヒトの脳発生の初期のイベントを明らかにし、in...

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

脳内注入戦略を使用してジカ ウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

この記事は、ひと胎児脳神経幹細胞文化だけでなく、様々 な神経細胞やアストロ サイト、ジカ...

培養ひと胎児脳神経幹細胞の免疫細胞化学的解析のジカ ウイルス感染症

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。脳オルガノイドを大量に、高品質で得るために、自家製ミニバイオリアクターを使用しています。...

自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生

私たちは、人工多能性幹細胞(iPSC)由来の造血前駆細胞(HPC)をオルガノイド開発に組み込むことにより、常在性ミクログリアを持つヒト脳オルガノイドを生成するプロトコルを提示します。...

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

現在のビデオは、開発ゼブラフィッシュの脳内の個々の神経前駆細胞のライブイメージングを実行するためのエレクトロポレーション、共焦点顕微鏡の組み合わせを活用する方法を示しています。...

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

学ぶ幹細胞由来脳オルガノイドを用いたジカウイルス感染モデル構築法。発達中の人間の脳における感染メカニズムと微小頭症との関連性を解明し、創薬スクリーニングや神経発達障害治療戦略の開発に貢献する。

脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカウイルス感染症をモデル化

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脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカ ウイルス感染症をモデル化

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