ウェル プレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法

このプロトコルの全体的な目標は、小さなメンブレンインサートシステムにおける3D皮膚モデルの透過性と拡散係数を決定することです。これらの問題は、透過性と拡散係数が重要な品質要因である医薬品および化粧品用途の3D皮膚組織工学に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、小さなマルチウェルインサート内でこれらの係数を直接測定できることです。

シミュレーションの小さなメンブレンインサートシステムは、船の装置やメンブレンインサートシステムを使用する他のアプリケーション上の臓器で使用するためにさらに変更することができます。アガロースゲルを調製するには、まず、新たに調製した80°Cの液体アガロースゲル28.6マイクロリットルを96ウェルメンブレンインセットシステムの各メンブレンに塗布します。10分後、ゲルは固化し、透過性アッセイに使用できます。

コラーゲン細胞モデルを調製するには、まず125マイクロリットルのHBSSと1ミリリットルのコラーゲンR溶液を氷上で混合し、続いて水酸化ナトリウムで中和します。次に、完全培地に懸濁した125マイクロリットルの一次線維芽細胞を混合物に加えます。そして、得られた細胞溶液の28.6マイクロリットルを、新しい96ウェルメンブレンインセットシステムの各ウェルに加えます。

細胞培養インキュベーターで30分後、75マイクロリットルの完全培地をゲルの表面に加え、300マイクロリットルの完全培地を各ウェルの底に加えて、細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。翌日、培地を75マイクロリットルのヒト成体低カルシウム高温ケラチノサイトと交換し、各コラーゲン細胞モデルにプレートを細胞培養インキュベーターに戻してさらに3日間。4日目に、細胞モデルの表面から培地を吸引し、プレートをさらに7日間インキュベーターに戻します。

透過性アッセイを行うには、75マイクロリットルのドナー物質を目的のスモールウェルインサートモデルシステムに分注し、各ウェルの底部に300マイクロリットルのアクセプター物質を追加します。プレートを摂氏37度、湿度95%、約480RPMのシェーカーに5時間置き、メンブレンインサートシステムを1時間に1回空の96ウェルプレートに移し、プレートリーダーで実験プレートの底ウェル内の拡散蛍光を測定します。透過性実験の最後に、適切なモデリングソフトウェアを開き、新しいモデルを開始します。

[モデル ウィザード] と [3D モデル] を選択します。「Transport of Diluted Species」を追加し、「study」をクリックします。次に、[時間依存]を選択し、[完了]をクリックします。

[グローバル定義]で、右クリックしてパラメータを追加し、ジオメトリパラメータと物理パラメータをグリッドに入力します。実験からメンブレンインサートシステムのジオメトリを設定し、[定義]を右クリックして2つのドメインプローブを追加し、1つのプローブをアクセプタードメインとして、もう1つのプローブをドナードメインとして選択します。両方のドメインを平均に設定し、式 C と mols per meter の単位を 3 乗にして設定します。

そして、拡散係数を輸送特性1と希釈種の輸送の下に設定します。「transport of diluted species」を右クリックして、2 つ目の輸送特性 2 を追加し、ドメイン選択で 2 つ目のバリアを選択します。希釈された種の輸送では、初期値 1 について、濃度を 0 と定義します。

希釈された種の輸送を右クリックして、2番目の初期値2を追加し、3番目のドメインとしてドナーを選択します。蛍光ドナー物質の初期濃度として濃度を設定します。[希釈種の輸送]を右クリックして対称性1を追加し、ジオメトリ全体を反映する境界選択のすべてのサーフェスを選択します。

メッシュを右クリックして2つの自由な四面体を追加し、2番目のバリアをドメインとして設定します。free tetrahedral oneを右クリックして、事前定義されたメッシュのサイズをextra-fineに追加します。2 番目の自由四面体で、アクセプターとドナーをドメインとして設定し、事前定義されたメッシュを finer に設定します。

次に、スタディ 1 で [計算] をクリックしてシミュレーションを開始します。拡散シミュレーションによって生成されたデータに拡散係数を適合させるには、サイキックの追加メニューを開き、数学を選択します。最適化と感度を特定します。

「optimization」を選択し、「add to component」をクリックします。次に、定義を右クリックして変数を追加し、表 3 の変数を手動で入力します。次に、コンポーネント結合メニューで定義を右クリックし、平均 1 を追加し、次にアクセプターをオペレーター名として手動で追加し、ドメイン 1 を選択します。

実験データを新しいテキストドキュメントにエクスポートします。セミコロンを使用してデータを列に分割し、改行を使用してデータを行に分割します。optimizationを右クリックして、グローバル最小二乗目標を追加し、実験データにテキストドキュメントを添付します。

[グローバル最小二乗目標]をクリックして、最初の列を時間列1として定義し、2番目の列を値列1として定義します。「expression of value」列に変数「C」を入力します。「optimization」を右クリックして、グローバル制御変数を1つ追加します。また、D アンダースコア検索を、初期値が 1、下限が 0、上限が 1, 000 の変数として宣言します。

スタディ 1 を右クリックして、最適化を追加します。そして、最適化ソルバーの手法としてSNOPTを選択します。最適性の許容誤差を 1 から -8 の累乗に設定します。

次に、バリアの拡散係数をDに設定します。検討中のシミュレーション時間をゼロ秒から22,000秒に100秒間隔で設定し、計算をクリックしてパラメータの最適化を開始します。コラーゲン細胞モデルの組織学的解析により、中央マトリックス内の線維芽細胞のわずかな染色が明らかになりました。コラーゲンマトリックスの上部には、ヒトの成体である低カルシウム、高温のケラチノサイトからなると思われる多くの核を含む層が観察できます。

フルオレセインナトリウム塩とフルオレセインイソチオシアネートデキストランを使用して、拡散物質の分子サイズの影響を確認すると、分子サイズが小さい場合、シミュレーションと実験データは両方の分子でよく一致していることが明らかになります。ただし、分子サイズが大きいほど、シミュレーションの曲線進行の偏差が大きくなり、グラフの最初で遅延が発生し、グラフの後半でより強く上昇することが示されています。実際、透過係数は分子サイズが大きくなるにつれて減少し、シミュレートされた係数は実験の透過係数と同様に動作します。

注目すべきは、ヒトの成人低カルシウム高温ケラチノサイトを使用するほとんどのモデルは、ヒトの成人低カルシウム高温ケラチノサイトを使用しないモデルと比較して、透過係数と拡散係数が低いことです。コラーゲンsimモデルは11〜12日で確立でき、適切に行えば浸透測定は6時間で完了します。手順を実行する際には、透過係数の変動を減らすために、温度、充填量、適用物質の濃度、湿度、膜プロセスなどの境界条件を一定に保つことが重要です。

このモジュールシミュレーションの助けを借りて、実験の労力を削減し、長時間の性能を予測することができます。また、他の透過装置や臓器所有システムにも適応させることができます。この技術は、医薬品および化粧品用途の研究者だけでなく、組織工学における相互作用開発の研究者が人工組織における拡散浸透プロセスを探求するための道を開きます。