ウェル プレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法
2018年2月23日
膜の透磁率の定量方法挿入ウェル プレート用システム、インシリコパラメーターの最適化シミュレーションを用いた拡散係数の計算が表示されます。
このプロトコルの全体的な目標は、小さなメンブレンインサートシステムにおける3D皮膚モデルの透過性と拡散係数を決定することです。これらの問題は、透過性と拡散係数が重要な品質要因である医薬品および化粧品用途の3D皮膚組織工学に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、小さなマルチウェルインサート内でこれらの係数を直接測定できることです。
シミュレーションの小さなメンブレンインサートシステムは、船の装置やメンブレンインサートシステムを使用する他のアプリケーション上の臓器で使用するためにさらに変更することができます。アガロースゲルを調製するには、まず、新たに調製した80°Cの液体アガロースゲル28.6マイクロリットルを96ウェルメンブレンインセットシステムの各メンブレンに塗布します。10分後、ゲルは固化し、透過性アッセイに使用できます。
コラーゲン細胞モデルを調製するには、まず125マイクロリットルのHBSSと1ミリリットルのコラーゲンR溶液を氷上で混合し、続いて水酸化ナトリウムで中和します。次に、完全培地に懸濁した125マイクロリットルの一次線維芽細胞を混合物に加えます。そして、得られた細胞溶液の28.6マイクロリットルを、新しい96ウェルメンブレンインセットシステムの各ウェルに加えます。
細胞培養インキュベーターで30分後、75マイクロリットルの完全培地をゲルの表面に加え、300マイクロリットルの完全培地を各ウェルの底に加えて、細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。翌日、培地を75マイクロリットルのヒト成体低カルシウム高温ケラチノサイトと交換し、各コラーゲン細胞モデルにプレートを細胞培養インキュベーターに戻してさらに3日間。4日目に、細胞モデルの表面から培地を吸引し、プレートをさらに7日間インキュベーターに戻します。
透過性アッセイを行うには、75マイクロリットルのドナー物質を目的のスモールウェルインサートモデルシステムに分注し、各ウェルの底部に300マイクロリットルのアクセプター物質を追加します。プレートを摂氏37度、湿度95%、約480RPMのシェーカーに5時間置き、メンブレンインサートシステムを1時間に1回空の96ウェルプレートに移し、プレートリーダーで実験プレートの底ウェル内の拡散蛍光を測定します。透過性実験の最後に、適切なモデリングソフトウェアを開き、新しいモデルを開始します。
[モデル ウィザード] と [3D モデル] を選択します。「Transport of Diluted Species」を追加し、「study」をクリックします。次に、[時間依存]を選択し、[完了]をクリックします。
[グローバル定義]で、右クリックしてパラメータを追加し、ジオメトリパラメータと物理パラメータをグリッドに入力します。実験からメンブレンインサートシステムのジオメトリを設定し、[定義]を右クリックして2つのドメインプローブを追加し、1つのプローブをアクセプタードメインとして、もう1つのプローブをドナードメインとして選択します。両方のドメインを平均に設定し、式 C と mols per meter の単位を 3 乗にして設定します。
そして、拡散係数を輸送特性1と希釈種の輸送の下に設定します。「transport of diluted species」を右クリックして、2 つ目の輸送特性 2 を追加し、ドメイン選択で 2 つ目のバリアを選択します。希釈された種の輸送では、初期値 1 について、濃度を 0 と定義します。
希釈された種の輸送を右クリックして、2番目の初期値2を追加し、3番目のドメインとしてドナーを選択します。蛍光ドナー物質の初期濃度として濃度を設定します。[希釈種の輸送]を右クリックして対称性1を追加し、ジオメトリ全体を反映する境界選択のすべてのサーフェスを選択します。
メッシュを右クリックして2つの自由な四面体を追加し、2番目のバリアをドメインとして設定します。free tetrahedral oneを右クリックして、事前定義されたメッシュのサイズをextra-fineに追加します。2 番目の自由四面体で、アクセプターとドナーをドメインとして設定し、事前定義されたメッシュを finer に設定します。
次に、スタディ 1 で [計算] をクリックしてシミュレーションを開始します。拡散シミュレーションによって生成されたデータに拡散係数を適合させるには、サイキックの追加メニューを開き、数学を選択します。最適化と感度を特定します。
「optimization」を選択し、「add to component」をクリックします。次に、定義を右クリックして変数を追加し、表 3 の変数を手動で入力します。次に、コンポーネント結合メニューで定義を右クリックし、平均 1 を追加し、次にアクセプターをオペレーター名として手動で追加し、ドメイン 1 を選択します。
実験データを新しいテキストドキュメントにエクスポートします。セミコロンを使用してデータを列に分割し、改行を使用してデータを行に分割します。optimizationを右クリックして、グローバル最小二乗目標を追加し、実験データにテキストドキュメントを添付します。
[グローバル最小二乗目標]をクリックして、最初の列を時間列1として定義し、2番目の列を値列1として定義します。「expression of value」列に変数「C」を入力します。「optimization」を右クリックして、グローバル制御変数を1つ追加します。また、D アンダースコア検索を、初期値が 1、下限が 0、上限が 1, 000 の変数として宣言します。
スタディ 1 を右クリックして、最適化を追加します。そして、最適化ソルバーの手法としてSNOPTを選択します。最適性の許容誤差を 1 から -8 の累乗に設定します。
次に、バリアの拡散係数をDに設定します。検討中のシミュレーション時間をゼロ秒から22,000秒に100秒間隔で設定し、計算をクリックしてパラメータの最適化を開始します。コラーゲン細胞モデルの組織学的解析により、中央マトリックス内の線維芽細胞のわずかな染色が明らかになりました。コラーゲンマトリックスの上部には、ヒトの成体である低カルシウム、高温のケラチノサイトからなると思われる多くの核を含む層が観察できます。
フルオレセインナトリウム塩とフルオレセインイソチオシアネートデキストランを使用して、拡散物質の分子サイズの影響を確認すると、分子サイズが小さい場合、シミュレーションと実験データは両方の分子でよく一致していることが明らかになります。ただし、分子サイズが大きいほど、シミュレーションの曲線進行の偏差が大きくなり、グラフの最初で遅延が発生し、グラフの後半でより強く上昇することが示されています。実際、透過係数は分子サイズが大きくなるにつれて減少し、シミュレートされた係数は実験の透過係数と同様に動作します。
注目すべきは、ヒトの成人低カルシウム高温ケラチノサイトを使用するほとんどのモデルは、ヒトの成人低カルシウム高温ケラチノサイトを使用しないモデルと比較して、透過係数と拡散係数が低いことです。コラーゲンsimモデルは11〜12日で確立でき、適切に行えば浸透測定は6時間で完了します。手順を実行する際には、透過係数の変動を減らすために、温度、充填量、適用物質の濃度、湿度、膜プロセスなどの境界条件を一定に保つことが重要です。
このモジュールシミュレーションの助けを借りて、実験の労力を削減し、長時間の性能を予測することができます。また、他の透過装置や臓器所有システムにも適応させることができます。この技術は、医薬品および化粧品用途の研究者だけでなく、組織工学における相互作用開発の研究者が人工組織における拡散浸透プロセスを探求するための道を開きます。
概要
このプロトコルは、小型メンブレン挿入システムを使用して3D皮膚モデルの透過性と拡散係数を決定する方法を説明しています。この技術は、製薬および化粧品応用における3D皮膚組織工学を進歩させるために重要です。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 組織工学
背景
- 透過性と拡散係数を理解することは、皮膚モデルを評価するために不可欠です。
- 3D皮膚組織工学は、製薬および化粧品応用にとって重要です。
- 小型メンブレン挿入システムは、これらの係数の直接測定を可能にします。
- この方法は、オンチップ器官デバイスに適応できます。
研究目的
- 3D皮膚モデルにおける透過性と拡散係数を測定すること。
- 拡散シミュレーションのパラメータを最適化すること。
- 皮膚組織工学応用の品質を向上させること。
使用された方法
- 96ウェルメンブレン挿入システムでアガロースゲルとコラーゲン細胞モデルの準備。
- ドナーおよびアクセプター物質を使用した透過性アッセイの実施。
- シミュレーションとパラメータ最適化のためのモデリングソフトウェアの使用。
- 細胞モデルの完全性を評価するための組織学的分析。
主要な結果
- 3D皮膚モデルにおける拡散係数の測定に成功。
- 透過性に対する分子サイズの影響の検証。
- 正確な拡散シミュレーションのためのパラメータの最適化。
- 組織学的分析は適切な細胞モデルの特性を示しました。
結論
- メンブレン挿入システムは透過性アッセイに効果的です。
- この方法は組織工学の様々な応用に適応できます。
- さらなる最適化により拡散係数計算の精度を向上させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables direct measurement of permeability and diffusion coefficients in 3D skin models using a small membrane insert system, addressing a key bottleneck in early-stage substance screening. By providing quantitative, reproducible data in a multi-well format, it supports target validation and assay development for topical and systemic drug candidates. The integrated simulation capability reduces experimental burden while enhancing predictive confidence in permeation behavior across molecular sizes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying substance permeation through skin-equivalent models.
- Operational Value: Provides functional validation of barrier properties in 3D tissue models without requiring large-scale Franz diffusion cells.
- Predictive Value: Supports lead identification by ranking compounds based on permeability coefficients derived from empirical data.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized, quantitative permeability outputs suitable for high-throughput screening in 96-well formats.
- Reproducibility: Ensures consistent diffusion measurements through controlled boundary conditions and normalized acceptor/donor domain probing.
- Scalability: Adaptable to different insert diameters (4.26 mm and 12.2 mm) and extensible to organ-on-a-chip configurations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses collagen-cell models with fibroblasts and keratinocytes to mimic human skin architecture for mechanistic de-risking.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by simulating long-term permeation profiles from short-term assays.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables permeability-based go/no-go criteria prior to in vivo testing, reducing late-stage attrition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early biological screening to lead optimization, particularly for dermal and transdermal drug delivery programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on barrier function and molecular transport in engineered tissues.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible fluorescence-based quantification in acceptor chambers.
- Analytics: Generates time-resolved concentration data for diffusion coefficient optimization via global least squares fitting.
- Translational Research: Connects short-term permeability measurements to predictive modeling of long-term substance retention.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable simulation-experimental workflow applicable across multiple permeation devices and tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in permeation pathways by correlating molecular size with diffusion behavior.
- Operational Value: Standardizes permeability testing across laboratories via defined gel preparation, incubation, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing reagent use and instrument time through simulation-guided experimentation.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization of topical formulations based on validated permeability thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, fluorescence-based assays, and computational modeling (e.g., COMSOL).
- Depends on plate readers, shakers with precise RPM control, and membrane insert systems compatible with 96-well formats.
- Necessitates cross-team standardization of substance concentration, temperature, humidity, and incubation timing.
- Involves adaptation considerations when extending to complex models such as organ-on-a-chip or multi-layered tissues.
- Limited by simulation accuracy for substances exceeding 14 x 10^-10 m Stokes radius, as noted in divergence between model and experimental data.
