Name: ウェル プレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぼう、3次元皮膚モデルの透過性と拡散係数を測定する計算的手法。メンブレンインサートシステムを用いたシミュレーションにより、創薬・化粧品開発における組織工学の品質評価を効率化します。

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この作品は no. グラント ドイツ研究振興協会 (DFG) からの財政支援で作成されましたPO413/12-1 とラ 1028/7-1。

1. 透水性研究サンプルの準備
注: 透過計測とシミュレーションを確認するために agarose のゲルまたは皮膚モデルの栽培に基づく細胞マトリックス モデルで構成されるサンプルが使用されました。
<ol><li>Agarose のゲル
	<ol>
<li>(二重蒸留水) H2O の 10 mL の agarose 高分解能粉末の 0.2 g を溶解します。</li>
		<li>ソリューションをミックスし、80 ° C に加熱8 分間温度を維持します。</li>
		<li>96 ウェル膜挿入システム (4.26 mm 径) の膜に 28.6 μ L agarose のゲルを適用または使用 226 μ 12 よく膜挿入システム (直径 12 mm) (例えば、Transwell システム)。</li>
		<li>ゲルが固化するまでに 10 分を待ちます。</li>
	</ol></li>
	<li>コラーゲン ゲル 注: 無菌条件の下ですべての手順を実行、ソリューションがコラーゲン ・ ゲルの重合を遅く氷の上に保持されます。<ol>
<li>1 ml の 0.4% コラーゲン R ソリューション (ラット尾コラーゲン) のミックス 125 μ のハンクス平衡塩ソリューション (HBSS)。</li>
		<li>黄色から赤色に変わり、フェノールレッドの色まで 1 M NaOH (水酸化ナトリウム) (〜 6 μ L) でソリューションを滴定しなさい。</li>
		<li>コラーゲン ・ ゲルをダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) + 10% 牛胎児血清 (FCS) の 125 μ L を加え、ピペット チップを慎重に混ぜます。</li>
		<li>96 ウェル膜挿入システムまたは 12 ウェル膜挿入システムの 226 μ の膜にコラーゲン ・ ゲルの 28.6 μ L を適用します。</li>
		<li>30 分 (37 ° C、5% CO2) インキュベーターでゲルを残します。</li>
	</ol></li>
	<li>線維芽細胞とコラーゲン細胞モデル 注: すべての手順は、無菌条件の下で実行されます。<ol>
<li>実験の前に 5-7 日一次繊維芽細胞を準備します。DMEM + 細胞培養フラスコ (75 cm2 </li><li></li><li><li><li> </li><li><li><li></li><li><li></li><li><li></ol></li><li> <ol><li> </li><li></li><li><li> </li><li><li><li><li><li></li><li><li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li></li><li><li></li><li><li></li><li></li><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li> <ol><li></li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li><li> </li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56412/56412eq1.jpg"> </li><li></ol></li></ol><ol><li> <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56412/56412eq9.jpg"> <ol><li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li></li><li> </li><li><li> </li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li></ol></li><li> <ol><li><li> </li><li><li> </li><li><li><li> </li><li></ol></li></ol>

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</ol>

Uwe マルクスは社長や株主と逆流性食道炎リンドナー TissUse gmbh 社は、製造・建設技術を商業化会社の株主であります。他の著者は本稿の出版物に関する利益相反を宣言しません。

本研究は、組織構造の膜でエンジニア リングの透過特性を定量化する手法を説明します。Agarose のゲルを分子サイズが異なる物質の透過をテストおよび検証メソッドと対応するシミュレーション最初検討した.小さい分子浸透 (透過クロマトグラフィーによるゲル濾過の効果) を除いてマトリックス メッシュを速くことが知られています。似たような観測は、強膜26、ひと表皮膜27、人間の皮膚の17、およびラット皮膚28物質のサイズ排除実験で作られました。透水係数と対応するストークス半径 (説明、通常分子の有効な半径よりも小さい分子として同じ拡散速度を持つ移動剛体球の半径) の間の負の相関関係が示されています。26,28日と同様の関係は、分子サイズの異なる物質を用いた実験で観察されました。1/ストークス半径以上透水係数をプロットすることによって最小の分子サイズを 4 つのグループに線形相関が認められた (R2 = 0.93) (図 6)。これは提案法によるシミュレーションの透水係数は、現実的な範囲を示します。
実験では 46.15% のエラーはフランツ ・拡散セル システム10透水性実験の報告よりもやや大きい。1 つの可能な説明は、フルオレセイン-イソチオ シアン酸-デキストラン、後述のサイズ分布で可能性があります。
説明メソッドは利点フランツ拡散細胞システムを用いた方法と比較して重要であります。まず、セットアップがよりコンパクトです。実験は、商業のウェル プレート (∼ 13 cm × 8.5 cm) のスケールを持つ膜挿入システムで直接実行されます。別のフランツ ・拡散セルは各サンプルに必要なに対し、これにより、同時に実行する複数のサンプルです。第二に、栽培が行われる膜挿入皮膚モデルの透磁率を直接測定できます。フランツ ・拡散セルを使用して、サンプルにある撮影しは小さいサンプルのため手間がかかります、また時間がかかるシステムにマウントされています。
コラーゲン細胞マトリックスの透過実験セル シード システムにこのメソッドを正常に適用できることを示した。皮膚モデルにここに提示されたモデルを検証しましたただし、メソッドは、有機細胞培養、例えば腎臓や肝臓の他のタイプに適用できます。
本研究ではコラーゲン細胞モデルを用いて HaCaT 細胞が完全にモデルの表面をカバー (図 5参照)。これは、メソッドが HaCaT の層とコラーゲン細胞モデルと透水係数を区別するために十分に敏感であることを示す透水係数の削減につながった。理想的には、皮膚モデルは29の本当の皮膚の表皮に近づくと、バリアを構築する必要があります、したがって、実際に使用する前に皮膚モデルの質 (例えば真皮、表皮の建物) を検証する重要です。皮膚モデルの開発は、染色技術を可視化し、皮膚タンパク質とコラーゲン30,31,32の検出から定量化できます。透水係数は、皮膚モデルの開発を評価するための重要な要素もありますが、さらに、実験はこれを確認するために必要な。前述したように、このメソッドは、複数のサンプルを同時に実行できます。また、透磁率を測定し、それによって皮膚モデルのこのパラメーターの開発を観察する栽培中にサンプルを取ることが可能です。
それは、透磁率が同時にゲル/コラーゲン-セル-モデル、膜を通して測定されること注意してください。検出された透水係数は、システム固有という異なる皮膚モデルの結果のみ比較できます同じ膜挿入を使用する場合です。さらに、皮膚モデルは、モデルを介してのみ被験物質に浸透し、それに隣接していないと誘導するエラー測定透水性を確保するために全体の栽培面積をカバーする必要があります。今後の実験で考慮するべきもう一つの側面は、皮膚を取り巻く自然環境です。通常、皮膚表面の温度は透過条件に影響を与えることができます内側の地域と比較して低いです。
計算機シミュレーションと実験を配置するために応用シミュレーションにおけるパラメーター最適化を可能にする方法が発表されました。シミュレーションは、分子サイズの小さい物質の実験データとよく一致するように発見されました。ただし、シミュレーションと実験データの偏差は分子サイズの大きな物質の観察されました。大規模な多糖類分子は、摩擦を高めるし、ゲル内拡散プロセスを遅くできます。この効果により、実験間の偏差の原因である異常拡散とシミュレーション値33,34。別の説明は、フルオレセイン イソチオ シアン酸デキストランの小さいまたは大きい粒子の存在可能性があります。メーカーは、特定の範囲に存在するより小さくより大きい粒子を可能にすると平均サイズとして物質の分子量を指定します。ないもどれほど分散してこれらの物質は、小さい粒子浸透ゲルと流体チャネルを介してより速くです。これらの拡散と摩擦の影響を考慮するシミュレーションを拡張することが可能です。
透過性実験とシミュレーション 2 OC で使用するため開発されました。シミュレーションの助けを借りて、この実験法より洗練された実験的設定に直接転送することができます。たとえば、膜挿入システム シミュレーションは、2 OC のジオメトリまたは同様のセットアップで他のシステムに簡単に転送できます。今後の実験の設計をサポートする変調シミュレーションのこのオプションを使用できます。また、蒸発、異常拡散膜効果などの副作用は、シミュレーションの精度を向上させる統合できます。シミュレーション プログラムは、変更または皮膚モデルの開発の他の側面を調査するために他の物理モジュールを統合するシミュレーション式を改良する機会を与えます。1 つの例は、コラーゲン細胞モデルにおけるブドウ糖の消費量と乳酸の生産のシミュレーションです。
特に興味深い医療物質のテストでは、チップ上の器官システムで物質を分散する方法です。私の助けに答える質問物質がシステムに浸透する速さなどシミュレーションと透磁率のパラメーター多 organ チップで他の組織の濃度になりますだけでなく。このメソッドは、サポートし、そのような器官のオンチップ システムを開発およびテストを強化できます。

オルガノ典型的な 3 D 培養医薬品開発とテスト1の物質の強力なツールとなっています。この点で、ヒト皮膚モデルなど、化粧品業界の規制要件により特別な関心です。彼らはその後として独自の単一器官培養ウェル プレート、または追加臓器モデル、例えば、肝2との組み合わせで多 organ チップのいずれかの使用のための多数の 3 D 皮膚モデルの開発につながっています。
肌と同等の栽培に関して気液界面 (ALI) は、適切な表皮分化3の重要な要素です。下部に液体透過性膜で容器から成る細胞文化挿入は、アリを確立する通常使用されます。ALIs は、12 ウェル (径 12.2 mm) まで表皮4Phenion5Episkin6、96 ウェル (4.26 直径 mm) からサイズの皮膚モデルの文化など市販の皮膚モデルに広く使用されています。ここで説明したメソッドは、膜挿入における物質の透過を決定します。
透水係数、培養皮膚モデルは、ネイティブの皮膚5と比較しての品質を評価する重要なパラメーターであるし、どのように迅速に評価するために使用される活性物質が皮膚を通して移行します。薬や化粧品の製品は、皮膚に適用する必要があります、特に場合は、このパラメーターは正確に活性剤がそれを通過するときに理解しておく必要。シミュレーション システムの挙動を予測し、必要な時間のかかる実験努力を減らすに助けることができるさらに、物質が関与している大口の場合は特に。
フランツ ・拡散セルは、透過実験皮膚および皮膚モデル5,6,7,8,9に芸術の状態です。このデバイスは、固定サンプル (拡散障壁) と 2 つのコンパートメントの間で構成されます。テストする物質がサンプル (ドナー コンパートメント) の上部に直接適用され、反対 (受容体) のコンパートメントに浸透の化合物の濃度を検出できます。アクセプタ側では、一定の温度と同種の物質濃度は温度チャンバー、マグネチックスターラーを保障されます。サンプルは、アクセプタ側でフランツ ・ セルのサンプリング アームから撮影することができます。179 cm と 19 cm の高さ範囲でこのシステムは比較的大きい10,11です。ゲル状物質や組織の拡散係数測定のための別の方法は、縛る。この手法の原理を使用漂白蛍光粒子ゲルと、漂白の領域の回復時間を決定するラベルの付いた拡散係数12,13,14を計算します。
さらに、皮膚15,16物質の浸透過程を決定するために、赤外光の吸光度と粒子の動きを検出するフーリエ変換赤外線 (FTIR) 分光法を使用できます。ただし、これらやその他のイメージングの方法 (例えば、2 光子蛍光相関分光法17) 集中的な楽器の費用必要があります。
この記事で手法を提案直接測定する膜挿入システム内の障壁の透過性皮膚モデルが栽培することができます。このメソッドは、小さなサンプル (よく 4.26 mm までサイズ) の数が多いとコンパクトなシステムで実行される透過性実験できます。これはフランツ ・拡散セル、別のデバイスが、デバイスにマウントするには、それぞれのプローブが必要し、小さなサンプル (4.26 mm サイズ) を実現することは困難ですのとは対照的です。さらに、メソッドは、主要なインストルメンテーション (例えば、共焦点または多光子顕微鏡) を必要としない、時間とコストの削減が達成されました。
多孔膜の実験を行ったすべては agarose のゲルまたは膜上確立されたコラーゲン細胞モデルから成るシステム サンプル (バリア) を挿入します。分子サイズが異なる蛍光物質 (ドナー) は、サンプルの上部に適用され、蛍光プレート リーダーを使用して下部 (受容体) に浸透物質の濃度が検出されました (図 1参照)。メソッドを検証し、このシミュレーションの精度をテストするために agarose のゲルが生成され、障壁として使用します。ヒドロゲルは、一般的に生物科学13多孔質媒質中の拡散と浸透のプロセスの調査のために使用されます。簡略化された皮膚モデル18,19 である一次繊維芽細胞とひと成人低カルシウム高温ケラチノ サイト (HaCaT) 細胞 (細胞マトリックス モデル)、コラーゲン マトリックスから成るセル シード システムの試験方法.
さらに、浸透プロセス フロー数値流体力学シミュレーションによるシミュレートしました。パラメーター最適化による拡散係数が実験データから計算することが分かった。一般に、このシミュレーションは、異なるアプリケーションを提供しています例えば、短い実験に基づく透過過程を予測することが可能だし、シミュレーションが実験の数を大幅に削減できます。
具体的には、2 ・ オルガン ・ チップ (2 OC) が開発市販1,22、実験とシミュレーションがオルガン オンチップ システム1,20,21にアプリケーションの設計されていた 23,24,25。原則として、膜挿入システムに基づく任意の臓器モデルの浸透プロセスはこの方法で記述することができます。

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td>カールロス</td><td>K297.2</td><td>高分解能粉末</td></tr><tr><td>コラーゲン</td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>コラーゲン R 溶液 0.4 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ロンザ (Biozym Scientific GmbH)</td> <td>880010-12</td><td>高グルコース L-グルタミン</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S0615 0114F</td><td>子牛胎児血清</td></tr><tr><td>フルオレセイン ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46960-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート-デキストラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944-500MG</td><td>4000 g/mol</td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート-デキストラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S-250MG</td><td>10,000 g/mol</td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート-デ</td><td></td><td></td><td></td></tr>キスト<tr><td>ラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S-250MG</td><td>40 000 g/mol</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170120</td><td>カルシウム、マグネシウムなし、フェノールレッド</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.06467.9010</td><td>粒状</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>錠</td></tr><tr><td>トランズウェル細胞培養インサート</td><td>Corning</td><td>3391</td><td>96 well, 0.4 & micro;m細孔サイズ</td></tr><tr><td>トランズウェル細胞培養インサートコー</td><td>ニング(VWR)</td><td>734-1563</td><td>12ウェル、0.4&マイクロ;m細孔サイズ</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Biochrom GmbH</td><td>L2143EDTA</td><td>付き</td></tr></tbody></table>

ウェル プレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

皮膚モデルの in vitro栽培ますます関連、製薬および化粧品用となっている物質のテストし同様、医薬品の開発にも使われて.これらのモデルは主に不可欠な要因別の物質への透過性の膜挿入システムで耕されます。通常、これらのパラメーターを決定するための応用法は、通常大規模なサンプル サイズ (例えば、フランツ ・拡散セル) または骨の折れる機器 (例えば、(FRAP) 退色後蛍光回復) が必要です。本研究は 4.26 〜 12.2 mm (栽培面積) の直径サイズの膜挿入システムに直接透水係数を決定する方法を示します。メソッドは、アガロース、コラーゲン ・ ゲル、皮膚モデルを表すコラーゲン細胞モデルと検証されました。さまざまな分子サイズと異なる細胞モデル (HaCaT、線維芽細胞は、コラーゲン ・ ゲルから成る) の透過特性を持つ物質の浸透プロセスは、正確に記述されていた。
また、上記の実験的方法をサポートするため、シミュレーションが設立されました。ストークス半径 m 14 × 10-10に分子サイズが小さい物質についても実験データにフィットまでシミュレーション (4,000 MW)、されるため、システムを記述するための有望なツール。また、シミュレーション実験努力をかなり減らすことができます、拡張またはより複雑なセットアップに適合する十分な堅牢です。

シミュレーションの精度を評価するために障壁を行った 96 ウェル膜透過実験 2% アガロースゲル システムを挿入します。フルオレセイン ナトリウム塩 (NaFl) とフルオレセイン イソチオ シアン酸メンブラン (FD) は、45 × 10-10 m ストークス半径 (376.27 40,000 mol wt) を 5 × 10-10 m から拡散物質の分子の大きさの影響を確認する使用されました。シミュレーションのネイティブのパラメーター最適化シミュレーションを実験データに合うように使用されました。
そのために、シミュレートされた透磁率の線形部分だけの斜面は実験結果と比較しました。小さい分子サイズのシミュレーションと実験データよく一致した NaFl の 99.2% と FD 4,000 80.2% (図 4 aと4 b を図参照)。大きな分子サイズには、FD の 10,000 の 50.5%、FD 20,000 の 79.7%、FD 40,000 53.6% の相関を示す高い偏差が生成されます。シミュレーションでカーブ進行を示した (図 4 c-4e参照) グラフの一層のコースの強力な上昇そして初めに遅延。
透水係数とシミュレートされた拡散係数が表示されます表 4.透過係数は分子サイズの増加と共に減少します。標準偏差は 10-8 m/s × 0.47 0.08 × 10-8 m/s とあった (N = 7)、4.18% 46.15% の間の絶対的な誤差に対応しました。大きい分子の実験は誤差の絶対値の大きいを示した。シミュレートされた拡散係数は実験的透水係数に非常に同じように振る舞った。大きなストークス半径をもつ物質減少の拡散係数と 9.09%、18.46% の間であった絶対誤差を示した (N = 3)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

膜の透磁率の定量方法挿入ウェル プレート用システム、インシリコパラメーターの最適化シミュレーションを用いた拡散係数の計算が表示されます。

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

このプロトコルの全体的な目標は、小さなメンブレンインサートシステムにおける3D皮膚モデルの透過性と拡散係数を決定することです。これらの問題は、透過性と拡散係数が重要な品質要因である医薬品および化粧品用途の3D皮膚組織工学に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、小さなマルチウェルインサート内でこれらの係数を直接測定できることです。シミュレーションの小さなメンブレンインサートシステムは、船の装置やメンブレンインサートシステムを使用する他のアプリケーション上の臓器で使用するためにさらに変更することができます。アガロースゲルを調製するには、まず、新たに調製した80°Cの液体アガロースゲル28.6マイクロリットルを96ウェルメンブレンインセットシステムの各メンブレンに塗布します。10分後、ゲルは固化し、透過性アッセイに使用できます。コラーゲン細胞モデルを調製するには、まず125マイクロリットルのHBSSと1ミリリットルのコラーゲンR溶液を氷上で混合し、続いて水酸化ナトリウムで中和します。次に、完全培地に懸濁した125マイクロリットルの一次線維芽細胞を混合物に加えます。そして、得られた細胞溶液の28.6マイクロリットルを、新しい96ウェルメンブレンインセットシステムの各ウェルに加えます。細胞培養インキュベーターで30分後、75マイクロリットルの完全培地をゲルの表面に加え、300マイクロリットルの完全培地を各ウェルの底に加えて、細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。翌日、培地を75マイクロリットルのヒト成体低カルシウム高温ケラチノサイトと交換し、各コラーゲン細胞モデルにプレートを細胞培養インキュベーターに戻してさらに3日間。4日目に、細胞モデルの表面から培地を吸引し、プレートをさらに7日間インキュベーターに戻します。透過性アッセイを行うには、75マイクロリットルのドナー物質を目的のスモールウェルインサートモデルシステムに分注し、各ウェルの底部に300マイクロリットルのアクセプター物質を追加します。プレートを摂氏37度、湿度95%、約480RPMのシェーカーに5時間置き、メンブレンインサートシステムを1時間に1回空の96ウェルプレートに移し、プレートリーダーで実験プレートの底ウェル内の拡散蛍光を測定します。透過性実験の最後に、適切なモデリングソフトウェアを開き、新しいモデルを開始します。[モデル ウィザード] と [3D モデル] を選択します。「Transport of Diluted Species」を追加し、「study」をクリックします。次に、[時間依存]を選択し、[完了]をクリックします。[グローバル定義]で、右クリックしてパラメータを追加し、ジオメトリパラメータと物理パラメータをグリッドに入力します。実験からメンブレンインサートシステムのジオメトリを設定し、[定義]を右クリックして2つのドメインプローブを追加し、1つのプローブをアクセプタードメインとして、もう1つのプローブをドナードメインとして選択します。両方のドメインを平均に設定し、式 C と mols per meter の単位を 3 乗にして設定します。そして、拡散係数を輸送特性1と希釈種の輸送の下に設定します。「transport of diluted species」を右クリックして、2 つ目の輸送特性 2 を追加し、ドメイン選択で 2 つ目のバリアを選択します。希釈された種の輸送では、初期値 1 について、濃度を 0 と定義します。希釈された種の輸送を右クリックして、2番目の初期値2を追加し、3番目のドメインとしてドナーを選択します。蛍光ドナー物質の初期濃度として濃度を設定します。[希釈種の輸送]を右クリックして対称性1を追加し、ジオメトリ全体を反映する境界選択のすべてのサーフェスを選択します。メッシュを右クリックして2つの自由な四面体を追加し、2番目のバリアをドメインとして設定します。free tetrahedral oneを右クリックして、事前定義されたメッシュのサイズをextra-fineに追加します。2 番目の自由四面体で、アクセプターとドナーをドメインとして設定し、事前定義されたメッシュを finer に設定します。次に、スタディ 1 で [計算] をクリックしてシミュレーションを開始します。拡散シミュレーションによって生成されたデータに拡散係数を適合させるには、サイキックの追加メニューを開き、数学を選択します。最適化と感度を特定します。「optimization」を選択し、「add to component」をクリックします。次に、定義を右クリックして変数を追加し、表 3 の変数を手動で入力します。次に、コンポーネント結合メニューで定義を右クリックし、平均 1 を追加し、次にアクセプターをオペレーター名として手動で追加し、ドメイン 1 を選択します。実験データを新しいテキストドキュメントにエクスポートします。セミコロンを使用してデータを列に分割し、改行を使用してデータを行に分割します。optimizationを右クリックして、グローバル最小二乗目標を追加し、実験データにテキストドキュメントを添付します。[グローバル最小二乗目標]をクリックして、最初の列を時間列1として定義し、2番目の列を値列1として定義します。「expression of value」列に変数「C」を入力します。「optimization」を右クリックして、グローバル制御変数を1つ追加します。また、D アンダースコア検索を、初期値が 1、下限が 0、上限が 1, 000 の変数として宣言します。スタディ 1 を右クリックして、最適化を追加します。そして、最適化ソルバーの手法としてSNOPTを選択します。最適性の許容誤差を 1 から -8 の累乗に設定します。次に、バリアの拡散係数をDに設定します。検討中のシミュレーション時間をゼロ秒から22,000秒に100秒間隔で設定し、計算をクリックしてパラメータの最適化を開始します。コラーゲン細胞モデルの組織学的解析により、中央マトリックス内の線維芽細胞のわずかな染色が明らかになりました。コラーゲンマトリックスの上部には、ヒトの成体である低カルシウム、高温のケラチノサイトからなると思われる多くの核を含む層が観察できます。フルオレセインナトリウム塩とフルオレセインイソチオシアネートデキストランを使用して、拡散物質の分子サイズの影響を確認すると、分子サイズが小さい場合、シミュレーションと実験データは両方の分子でよく一致していることが明らかになります。ただし、分子サイズが大きいほど、シミュレーションの曲線進行の偏差が大きくなり、グラフの最初で遅延が発生し、グラフの後半でより強く上昇することが示されています。実際、透過係数は分子サイズが大きくなるにつれて減少し、シミュレートされた係数は実験の透過係数と同様に動作します。注目すべきは、ヒトの成人低カルシウム高温ケラチノサイトを使用するほとんどのモデルは、ヒトの成人低カルシウム高温ケラチノサイトを使用しないモデルと比較して、透過係数と拡散係数が低いことです。コラーゲンsimモデルは11〜12日で確立でき、適切に行えば浸透測定は6時間で完了します。手順を実行する際には、透過係数の変動を減らすために、温度、充填量、適用物質の濃度、湿度、膜プロセスなどの境界条件を一定に保つことが重要です。このモジュールシミュレーションの助けを借りて、実験の労力を削減し、長時間の性能を予測することができます。また、他の透過装置や臓器所有システムにも適応させることができます。この技術は、医薬品および化粧品用途の研究者だけでなく、組織工学における相互作用開発の研究者が人工組織における拡散浸透プロセスを探求するための道を開きます。

a-method-for-determination-simulation-permeability-diffusion-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ウェルプレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法

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