Name: SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶリン酸結合タグを用いたSDS-PAGEによるLRRK2によるRab10リン酸化検出法。パーキンソン病研究においてLRRK2変異がRab10リン酸化に与える影響を評価し、簡便なウェスタンブロットで化学量論的推定が可能です。

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岩坪威博士 (東京大学、日本) にありがとう親切プラスミド 3xFLAG LRRK2 WT と変異体を提供します。我々 も博士ダリオ ・ アレッシ (、英国ダンディー大学) 提供いただきありがとうございます親切 MLi 2 とエンコード HA Rab10 プラスミド。この作品は、科学の振興 (JSPS) 科研費助成番号 JP17K08265 (GI) の日本社会によって支えられました。

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著者が明らかに何もありません。

ここでは、P タグの方法論に基づいて内因性レベル LRRK2 による Rab10 リン酸化を検出する簡易で堅牢な方法をについて説明します。現在利用可能なリン酸化 Rab10 抗体発現タンパク質15でのみ動作するため、P タグ SDS-PAGE を利用した本法は Rab10 リン酸化の内因性のレベルを評価する唯一の方法です。さらに、本法は、Rab10 リン酸化細胞の化学組成の推定できます。P タグの方法論はリン蛋白質に一般的に適用される、ためこの議定書は他のリン蛋白質のための同様のメソッドを確立するための「プロトタイプ」をすることができます。
プロトコルの重要なステップは、鋳造ゲルと試料の調製です。比較的写真不安定な試薬であり、長期的なストレージ 4 ° C で、後リン酸化タンパク質の電気泳動移動度を遅らせる能力が失われる時 P タグ アクリルアミド研究者は、光に P タグ アクリルアミドを公開することを避けるためにすべての心配を取る必要があります。また、P タグ分子はリン酸塩をキャプチャする Mn2 +イオンとの...

PD は、主に高齢者1モーター システムの機能不全の結果、中脳のドーパミン作動性ニューロンに影響最も一般的な神経変性疾患の一つです。ほとんどの患者は、PD を作成し散発的な方法で、病気を継承する家族が集まっています。FPD2とリンクするいくつかの遺伝子の突然変異が見つかっています。FPD の原因遺伝子の 1 つは、LRRK2、パーク 8 と呼ばれる支配的継承された FPD にリンク 8 のミスセンス変異 (N1437H、R1441C、G、H、S、Y1699C、G2019S、および I2020T) にされているの報告された3,4,5これまでのところです。いくつかのゲノムワイド関連研究 (GWAS) 散発的な PD 患者は PD、LRRK2 の機能に異常が散発的の両方の神経変性疾患の一般的な原因であることを示唆しているのリスク要因として LRRK2 軌跡におけるゲノム変化も確認します。パーク 8 FPD6,7,8。
LRRK2 は、ロイシン豊富な繰り返しドメイン、複雑なタンパク質 (中華民国) ドメイン、ROC (COR) ドメイン、セリン/スレオニン蛋白質キナーゼ ドメインおよび9WD40 リピート ドメインの C 末端の GTP 結合 Ras から成る大規模な蛋白質 (2,527 アミノ酸) であります。8 つの FPD 変異をこれらの機能ドメインの検索します。N1437H と ROC ドメイン、COR ドメイン、G2019S とキナーゼ ドメインで I2020T で Y1699C で R1441C/G/H/S。それは、仮定される G2019S 突然変異は、PD 患者10、11,12の突然変異を見つけた最も頻繁には、体外で2-3 倍13LRRK2 のキナーゼ活性が増加、のでLRRK2 substrate(s) のリン酸化の異常な増加は神経細胞に有毒であります。ただし、それされています患者派生サンプルで評価方法の不足のため散発的/家族性 PD 患者における生理学的関連 LRRK2 基板のリン酸化が変更されるかどうかを検討することが可能。
蛋白質のリン酸化は免疫ブロットまたは質量分析によるタンパク質のリン酸化状態を具体的に認識する抗体を用いた酵素抗体法 (ELISA) によって一般に検出されます。ただし、元の戦略時適用できませんリン酸化特異的抗体を作成する難しさのため。放射性隣酸塩に細胞の代謝ラベリングはリン酸化特異的抗体が容易に利用可能でない場合、リン酸化の生理的レベルを確認する別のオプションです。ただし、放射性物質の大規模な量を要求され、したがって放射線防護14のために特殊な機器を伴います。質量分析はより敏感なこれらの免疫化学的方法と比較して、蛋白質のリン酸化の分析に人気となったです。サンプル準備は時間がかかるし、高価な楽器が分析に必要です。
Rab10 Rab8 など Rab GTPase の家族のサブセットは、LRRK2 の直接生理学的な基板が15大規模プロテオーム解析の結果に基づき、最近報告されました。[Rab10 リン酸化された FPD 変異マウス胚性線維芽細胞、マウス16をノックの肺によって増加するデモンストレーションを行った。本報告では、ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を採用しました-P タグ分子が SDS ページのゲル (P タグ SDS-PAGE) Rab10 リン酸化の内因性のレベルを検出するために共重合する手法リン酸化 Rab10 の高感度抗体はまだ欠けていた。我々 は合計 Rab8 の現在入手可能な抗体の選択度が低くによる内因性 Rab8 のリン酸化を検出する失敗します。したがって、我々 は Rab10 リン酸化に焦点を当てることを決めた。LRRK2 は、Thr73 の非常に節約された「スイッチ II」地域の中で場所に行く Rab10 を廃止します。Rab 蛋白質リン酸化のサイトの高い保護は明確な Rab 蛋白質を認識する検体抗体が作りにくい理由の一つかもしれません。
LRRK2 による Rab8A のリン酸化は、Rabin8、GTP15にバインドされた GDP を交換することによって Rab8A をアクティブにグアニン ヌクレオチド交換因子 (GEF) の結合を阻害します。Rab10、LRRK2 による Rab8A のリン酸化は、Rab タンパク質の活性化に不可欠な膜15から GDP 結合 Rab 蛋白質の抽出は、GDP 解離阻害剤 (GDIs) の結合を阻害します。総称して、それは、LRRK2 による Rab タンパク質のリン酸化を防ぎます活性化正確な分子機構とリン酸化の生理的影響は明白でなく残るが、仮定されます。
P タグ SDS ページは 2006 年に木下らによって発明された: この方法ではアクリルアミドは P タグと共有結合は、SDS-PAGE に共高親和とリン酸塩を取り込み分子ゲル17。SDS ページのゲルの P タグ分子選択的リン酸化タンパク質の電気泳動移動度を遅らせる、ので P タグ SDS-PAGE は非リン酸化のものからリン酸化タンパク質を区切ることができます (図 1)。興味の蛋白質は複数の残基のリン酸化、リン酸化特異的形態に対応するバンドのはしごは見られなくなります。Rab10、場合 Rab10 で Thr73 だけでリン酸化されることを示す 1 つだけ移されたバンドを観察します。リン酸化特異的抗体と免疫ブロット上 P タグ SDS ページの主な利点は非リン酸化特異抗体 (すなわち、認識合計 Rab10) とイムノブロット リン酸 Rab10 が認識されること膜に転送された後である一般により特定、機密、および利用可能な商業学術ソースから。SDS ページ P タグを使用してのもう一つの利点は、リン酸化特異的抗体と免疫ブロットすること放射性と細胞の代謝ラベリングによって不可能である 1 つは、リン酸化の化学量論の近似的評価を取得できることリン酸塩。
別に安価な P タグ アクリルアミドおよびそれに関連するいくつかのマイナーな変更の使用は、現在 LRRK2 による Rab10 リン酸化の検出法免疫ブロットの一般的なプロトコルに従います。したがって、免疫ブロットが浄化された蛋白質、セル lysates の組織乳剤などのサンプルの任意のタイプの通常の練習を任意の所で簡単であり、容易に実行可能ファイルをする必要がありますそれ。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)</td><td>自家製</td><td></td><td>150 mM NaCl、8 mM Na2HPO4-12H2O、2.7 mM KCl、1.5 mM KH2PO4 MilliQ水でオートクレーブ</td></tr>滅菌 塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>NacalaiTesque</td><td>31320-34</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム二ナトリウムリン酸水素 12-水</td><td>和光</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>和光</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>和光</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>2.5% トリプシン (10X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td>滅菌 DPBS で 10 倍に希釈して作業溶液</td></tr><tr><td>を調製しますDulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>BioWest</td><td>S1560</td><td>56°Cで熱不活性化;C for 30 min</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Na hydroxide</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)</td><td>PolySciences, Inc.</td><td>24765-1</td><td>原液を 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 で 1 mg/mL で調製し、NaOH</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Wako</td><td>045-28335</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>STAR</td><td>RSP-THA500G</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>ポリオキシエチレン(10) Octylphenyl Ether</td><td>Wako</td><td>160-24751</td><td>Triton X-100 と同等</td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸(EGTA)</td><td>和光</td><td>346-01312</td><td></td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム(V)</td><td>和光</td><td>198-09752</td><td></td></tr><tr><td>フッ化ナトリウム</td><td>関東化学</td><td>工業 37174-20</td><td></td></tr><tr><td>&β;-グリセロリン酸 二ナトリウム塩 五水和物</td><td>ナカライ テスク</td><td>17103-82</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムピロリン酸十水和物</td><td>国産化学</td><td>2113899</td><td></td></tr><tr><td>ミクロシスチン-LR</td><td>和光</td><td>136-12241</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>和光</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ</td><td>11873580001</td><td>1錠を1mLの水に溶かし、-20°Cで保存することができます。Cは1ヶ月間。細胞溶解に1:50希釈で使用</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Nadium dodecyl sulfate</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31607-65</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Wako</td><td>075-00616</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Wako</td><td>021-02911</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>関東化学</td><td>25099-00</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>和光</td><td>056-06967</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>和光</td><td>136-01837</td><td></td></tr><tr><td>リン酸結合タグアクリルアミド</td><td>和光</td><td>AAL-107</td><td>Pタグアクリルアミド</td></tr><tr><td>40% (w/v) アクリルアミド溶液</td><td>ナカライ テスク</td><td>06119-45</td><td>アクリルアミド:Bis = 29:1</td></tr><tr><td>テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)</td> <td>ナカライ テスク</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>Wako</td><td>016-08021</td><td>10% (w/v) 溶液を MilliQ 水</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>和光</td><td>166-04831</td><td></td></tr><tr><td>塩化マンガン四水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Prestained Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374, 1610373, 1610377</td><td>プロトコールで使用される分子量マーカー</td></tr><tr><td>WIDE-VIEW 染色済みタンパク質サイズマーカー III</td><td>Wako</td><td>230-02461</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-64</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran NC 0.45</td><td>GE Healthcare</td><td>10600007</td><td>Nitrocellulose membrane</td></tr><tr><td>Durapore Membrane Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>GVHP00010</td><td>PVDF</td></tr><tr><td>membrane Filter Papers No.1</td><td>Advantec</td><td>00013600</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28322-72</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>和光</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>ポリオキシエチレンソルビタン モノラウレート</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td> <td>和光</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>脱脂粉乳</td><td>Difco Laboratories</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>イムノスター</td><td>和光</td><td>291-55203</td><td>ECL液(普通感度)</td></tr><tr><td>イムノスターLD</td><td>和光</td><td>290-69904</td><td>ECL液(高感度)</td></tr><tr><td>CBB 染色液</td><td>自家製</td><td></td><td>1g CBB R-250、50% (v/v) メタノール、10% (v/v) 酢酸 1 L のミリQ 水</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>和光</td><td>031-17922</td><td></td></tr><tr><td>CBB 脱脂溶液</td><td>自家製</td><td></td><td>12%(v / v)メタノール、7%(v / v)酢酸1LのMilliQ水</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11583816001</td><td>0.2 &mu;イムノブロッティング用のg / mL。</td></tr><tr><td>anti-Rab10 antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#8127</td><td>Used at 1:1000 for immunoblotting. 特異性は、CRISPR KOによって確認されました。これは、Ito et al., Biochem J, 2016.</td></tr><tr><td>抗pSer935抗体</td><td>Abcam</td><td>ab133450</td><td>1 &mu;イムノブロッティング用のg / mL。</td></tr><tr><td>抗LRRK2抗体</td><td>Abcam</td><td>ab133518</td><td>1 &mu;イムノブロッティング用のg / mL。</td></tr><tr><td>抗-α;-チューブリン抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>1 &mu;イムノブロッティング用のg / mL。</td></tr><tr><td>抗GAPDH抗体</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-32233</td><td>0.02 &mu;イムノブロッティング用のg / mL。</td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ AffiniPure Sheep 抗マウス IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td>0.16 &mu;イムノブロッティング用のg / mL。</td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ AffiniPure ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-003</td><td>0.16 &mu;イムノブロッティング用のg / mL。</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>InhibitorsGSK2578215A</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MedChem Express</td><td>HY-13237</td><td>ストック溶液は、DMSOで10 mMで調製し、-80°で保存しました。C</td></tr><tr><td>MLi-2</td><td>Dario Alessi 博士 (ダンディー大学)</td><td></td> ストック<td>溶液を DMSO で 10 mM で調製し、-80 °C で保存しました。C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rab10/pcDNA5 FRT TO HA ダ</td><td>リオ・アレッシ博士提供 (University of Dundee)</td><td></td><td>このプラスミドは、アミノ末端HAタグ付きヒトRab10を発現します。</td></tr><tr><td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td><td>岩坪武博士(東京大学)</td><td></td>提供:<td>伊藤ほか, Biochemistry, 46: 1380&ndash;1388 (2007).このプラスミドは、アミノ末端に3xFLAGタグ付き野生型ヒトLRRK2を発現します。</td></tr><tr><td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td><td>岩坪武博士(東京大学)</td><td></td><td>Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&ndash;1388 (2007).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きK1906Mキナーゼ不活性変異体を発現します。</td></tr><tr><td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>この論文です。このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きN1437H FPD変異体を発現します。</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>岩坪武博士(東京大学)</td><td></td>上<td>川寺ら、Biochemistry, 48: 10963&ndash;10975 (2013).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きR1441C FPD変異体を発現します。</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td><td>岩坪武博士(東京大学)</td><td></td>上<td>川寺ら、Biochemistry, 48: 10963&ndash;10975 (2013).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きR1441G FPD変異体を発現します。</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td><td>岩坪武博士(東京大学)</td><td></td>上<td>川寺ほか, Biochemistry, 48: 10963&ndash;10975 (2013).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きR1441H FPD変異体を発現します。</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>この論文です。このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きR1441S FPD変異体を発現します。</td></tr><tr><td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>岩坪武博士(東京大学)</td><td></td>上<td>川寺他提供, Biochemistry, 48: 10963&ndash;10975 (2013).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きY1699C FPD変異体を発現します。</td></tr><tr><td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td><td>岩坪武博士(東京大学)</td><td></td>上<td>川寺ら、Biochemistry, 48: 10963&ndash;10975 (2013).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きG2019S FPD変異体を発現します。</td></tr><tr><td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td><td>岩坪武博士(東京大学)</td><td></td>上<td>川寺ら、Biochemistry, 48: 10963&ndash;10975 (2013).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きI2020T FPD変異体を発現します。</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社<</td><td>strong>カタログ番号</td><td>コメント<</td></tr><tr><td>strong>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>フォーマシリーズII 3110ウォータージャケットオート</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>ドラモンド</td><td>ピペットエイドPA-400</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットP10</td><td>日用</td><td>00-NPX2-10</td><td>0.5&ndash;10 &mu;L</td></tr><tr><td>マイクロピペット P200</td><td>日菱</td><td>00-NPX2-200</td><td>20&ndash;200 &mu;L</td></tr><tr><td>マイクロピペット P1000</td><td>日用</td><td>00-NPX2-1000</td><td>100°C;1000 &mu;L</td></tr><tr><td>マイクロピペット用チップ P10</td><td>STAR</td><td>RST-481LCRST</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット用滅菌チップ P200</td><td>FUKAEKASEI</td><td>1201-705YS</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット用滅菌チップ P1000</td><td>STAR</td><td>RST-4810BRST</td><td>滅菌済み</td></tr><tr><td>5 mL ディスポーシャブルピペット</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>済み 10 mL ディスポーシャブルピペット</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td>滅菌済み</td></tr><tr><td>25mL ディスポーサブルピペット</td><td>ファルコン</td><td>357535</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>済み血球計算盤</td><td>サンリードガラス</td><td>A126</td><td>改良型ノイボイアー</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>10cm皿</td><td>ファルコン</td><td>353003</td><td>組織培養用</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>AGCテクノグラス</td><td>3810-006</td><td>組織培養用</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>サイエンティフィック・インダストリー</td>ズ <td>ボルテックス・ジーニー 2</td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>住友ベークライト</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL</td>チューブ <td>STAR</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>15mLチューブ</td><td>AGCテクノグラス</td><td>2323-015</td><td></td></tr><tr><td>50mLチューブ</td><td>AGCテクノグラス</td><td>2343-050</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>タカラトミーMX-307</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Greiner</td><td>655061</td><td>Not for tissue culture</td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M2e</td><td></td></tr><tr><td>SDS&ndash;PAGEタンク</td><td>日本映像</td><td>NA-1010</td><td></td></tr><tr><td>トランスファータンク</td><td>日本映像</td><td>NA-1510B</td><td></td></tr><tr><td>ゲルプレート(ノッチ付き)</td><td>日本映像</td><td>NA-1000-1</td><td></td></tr><tr><td>ゲルプレート(プレーン)</td><td>日本映像</td><td>NA-1000-2</td><td></td></tr><tr><td>シリコンスペーサー</td><td>日本映像</td><td>NA-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>17ウェルコーム</td><td>日本映像</td><td>カスタムメイド</td><td></td></tr><tr><td>バインダークリップ</td><td>日本英道</td><td>NA-1000-15</td><td></td></tr><tr><td>5 mL シリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>21G</td><td>テルモ</td><td>NN-2138R</td><td></td></tr><tr><td>発電所 1000 VC</td><td>ATTO</td><td>AE-8450</td><td>SDS用電源ページングとトランスファー</td></tr><tr><td>大型計量ボート</td><td>イナオプティカ</td><td>AS-DL</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック容器</td><td>AS ONE</td><td>PS CASE No.4</td><td>10 x 80 x 50 mm</td></tr><tr><td>ロッキングシェーカー</td><td>タイテック</td><td>NR-10</td><td></td></tr><tr><td>スチロールフォームボックス</td><td>ジェネリック</td><td></td><td>内寸は、トランスファータンク1個(200×250×250mm)に収まるようにしています。</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4000</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>ECL検出用冷却CCDカメラ搭載イメージャー</td></tr></tbody></table>

sds ページを用いたリン酸 binding タグ lrrk2 活動によって rab10 リン酸化検出

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

ロイシン豊富な繰り返しキナーゼ 2 (LRRK2) の変異は、家族性パーキンソン病 (FPD) とリンクする示されています。LRRK2 のキナーゼ活性の異常な活性化は、PD の発症機序に関与している、ので LRRK2 キナーゼ活性の生理的レベルを評価する手法の確立が必要不可欠です。最近の研究では、LRRK2 廃止 Rab10 を含む生理学的な条件の下で、Rab GTPase 家族のメンバーであることを明らかにしました。質量分析法による培養細胞における LRRK2 による内因性 Rab10 のリン酸化を検出する可能性があります、されているイムノブロットの現在入手可能な特定のリン酸化抗体の感度不良のためそれを検出することは困難Rab10。ここで、簡単な説明ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) リン酸バインディング タグ (P タグ)、併用を利用した免疫ブロットに基づく LRRK2 による Rab10 リン酸化の内因性のレベルを検出します。N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N'、N'- トリス (ヌクレオチ-2-イル-メチル) - 1, 3 - diaminopropan-2-ol。現在のプロトコルだけでなく P タグを利用する方法の例を提供します、どのように変異と同様阻害剤治療/管理やその他の要因を変える細胞や組織における LRRK2 の下流のシグナリングの評価ができます。.

過剰発現システム: ハ-Rab10 3 のリン酸化 × フラグ-LRRK2 の HEK293 細胞します。
HEK293 細胞は、HA Rab10 野生型および 1.066 μ g 3 × フラグ LRRK2 の (野生型、キナーゼ不活性変異体 (K1906M)、または FPD 変異) 0.266 μ g を導入させた。反を用いたイムノブロット P タグ SDS-PAGE を用いて Rab10 リン酸化-HA 抗体 (図 2)。10 μ g のタンパク質は、50 μ M P タグ アクリルアミドと 100 μ M MnCl2を含む 10% ゲル (80 × 100 × 1 mm) で実行されました。P タグ ゲル (上部パネル) の露光時間は 10 s 標準 ECL ソリューションを使用します。Rab10 と LRRK2 の過剰発現の Co が P タグ ゲルのバンドのシフトを...

本研究では、ロイシン豊富な繰り返しキナーゼ 2 によって Rab10 リン酸化の内因性のレベルを検出する簡単な方法について説明します。

SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

この実験の全体的な目標は、リン酸結合タグを持つSDS-PAGEを使用して、LRRK2によるRab10リン酸化を検出することです。この方法は、LRRK2の疾患変異がRab10のリン酸化にどのように影響するかなど、パーキンソン研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、単純なウェスタンブロットを使用して、Rab10リン酸化の化学量論を大まかに推定できることです。このプロトコルの手順の多くはかなり標準的であり、このビデオに付属するテキスト プロトコルで十分に詳細に説明されています。ここでは、視覚的な指導から最も恩恵を受ける手順を示したいと思います。テキストプロトコルに記載されているように、トランスフェクションされたHEK293細胞のプレートを調製します。プレートを氷の上に置いた状態で、メディアを吸引して廃棄します。次に、各プレートの角に2ミリリットルのDPBSを慎重に追加し、プレートを揺り動かして溶液を広げます。次に、DPBSを取り外して廃棄します。次に、各プレートに100マイクロリットルの溶解緩衝液を加えます。プレートを傾け、スクレーパーを使用してバッファーを広げ、細胞溶解物を放出します。次に、ライセートを吸引し、氷上で予冷したマイクロチューブに移し、10分間待ちます。次に、チューブを遠心分離し、上清を氷上の新しいチューブに移すことにより、破片のない細胞溶解物を回収します。次に、Bradfordアッセイを使用して、透明化したライセートのタンパク質濃度を測定します。濃度データについては、ゲル分析用のライセートの100マイクロリットルサンプルを調製します。過剰発現した赤血球凝集素Rab10と比較して、内因性Rab10を測定するために、より密度の高いライセートを調製します。サンプルを摂氏100度で5分間インキュベートして、サンプルの調製を終了します。その後、サンプルは摂氏マイナス20度未満で、必要になるまで最大6か月以上保管します。まず、テキストプロトコルに従ってSDS-PAGEセルを準備します。次に、ゲルをタンクに入れ、バインダークリップで固定します。次に、タンクにランニングバッファーを充填し、シリンジに取り付けられた針を使用してウェル内とゲルの下の気泡を取り除きます。次に、塩化マンガンをサンプルに加え、スピンダウンして沈殿物を除去します。次に、等量のサンプル、過剰発現したヘマグルチニンRab10を分析するために10マイクログラムのタンパク質を、または内因性Rab10を分析するために30マイクログラムのタンパク質をゲルにロードします。空のレーンに塩化マンガンを含むサンプルバッファーをロードします。また、分子量マーカーにバッファーと塩化マンガンを添加して、サンプルと同じ容量にします。次に、50ボルトでゲルを動かし始めます。サンプルスタックの後、電圧を120に増やして分離します。染料の前面がゲルの底に達したら、電圧を殺します。次に、以下のようにゲルを3回洗います。分離ゲルを、EDTAおよびSDSを添加したクリーンな転写バッファーの浴槽にロードします。次に、室温でシェーカーで10分間揺らします。3回の洗浄後、SDSを添加した転写バッファーを使用してもう1回の洗浄を行いますが、EDTAは使用しません。次に、湿ったタンクを使用してゲルを移します。氷冷水で満たされた発泡スチロールボックスにタンクを入れ、タンクを電源に接続して移送を開始します。効率的な冷却を伴う長時間の移載は、手順に不可欠です。移載後、メンブレンをPonceau Sで染色し、テキストプロトコルに従ってTBSTで洗浄して転写を確認します。次に、ブロックを適用します。ブロットを乳白色TBSTに浸し、ブロットをシェーカーで室温で1時間揺さぶります。その後、ブロッキング溶液を取り出して廃棄し、一次抗体溶液を塗布します。次に、メンブレンを摂氏4度で一晩揺らします。翌日、一次抗体溶液を取り出します。次に、前と同じように新しいTBSTでメンブレンを3回洗います。洗浄後、ブロットを二次抗体溶液に浸し、メンブレンをロッカー上で室温で約1時間インキュベートします。インキュベーション後、メンブレンをTBSTで再度3回洗浄します。次に、メンブレンを開発します。大きなラップに1ミリリットルのECL溶液を加えます。次に、メンブレンをECLに置き、すばやく裏返して両面を濡らします。次に、メンブレンを持ち上げて水気を切ります。水気を切った後、片方の端をペーパータオルに約5秒間触れさせて、余分な溶液を吸い取ります。次に、メンブレンをしわのない硬い透明なフィルムで包み、黒いトレイに移してイメージングします。HEK293細胞にヘマグルチニンRab10野生型および3xFLAG-LRRK2をトランスフェクションしました。家族性パーキンソン病LRRK2の変異で不活性な野生型キナーゼを試験した。LRRK2とRab10の共発現により、Pタグゲルに大きなバンドシフトが生じました。対照的に、キナーゼ不活性変異体との共発現では、Rab10の移動性に変化はなく、バンドシフトの原因としてキナーゼが示唆されました。また、予想通り、家族性PD変異はすべてバンドシフトを増加させました。P-tagゲルシステムは、LRRK2阻害剤で処理したマウス3T3-スイスアルビノ胚性線維芽細胞の解析にも使用しました。リン酸化された内在性Rab10に対応するバンドシフトは、細胞をGSK2578215Aで処理すると消失しました。同じ試験をヒトA549細胞を用いて行った。これらの実験では、LRRK2阻害剤の有効性を、LRRK2阻害の確立されたマーカーである抗pセリン935LRRK2抗体を用いて検証しました。この技術を習得すれば、転写前にゲルを洗浄する通常のウェスタンブロッティング手順と比較して、さらに14分しか必要としません。この手順に続いて、FPD変異体がRab10の同じ残基をリン酸化するかどうかなどの追加の質問に答えるために、質量分析などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、パーキンソン研究の分野の研究者が、培養細胞および組織におけるRab10リン酸化の内因性レベルを調査する道を開きました。溶解バッファーにミクロシスチンを添加した状態での作業は非常に危険であり、細胞溶解物を調製する際には、適切な個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Biochemistry

生物化学

ロイシンリッチリピートキナーゼ2は、大規模なマルチドメインのキナーゼ、パーキンソン病の最も一般的な遺伝的原因であるの変異です。このタンパク質のキナーゼ活性の分析は、このタンパク質の生物学と機能障害を理解する上で重要なツールであることが証明されている。本論文では、...

LRRK2のキナーゼ活性を測定する in vitroで</em

このビデオでは、単一分子プルダウンアッセイを用いたタンパク質リン酸化の高感度定量技術を示しています。ポリエチレングリコール-ビオチンの官能基化と標識抗体の使用により、リン酸化チロシンの検出が特異的に増加します。...

タンパク質リン酸化分析のための単一分子プルダウンアッセイ:細胞溶解物中のタンパク質リン酸化を定量するハイスループット技術

ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2（LRRK1およびLRRK2）は、GTPアーゼおよびキナーゼドメインの両方をコードし、細胞内でリン酸化されたマルチドメインタンパク質である。ここでは、それによってその全体的なセルラphophorylationレベルを測定する手段を提供する、32 Pオルトリン酸を用いて細胞内LRRK1とLRRK2を標識するためのプロトコルを提示する。...

ロイシンリッチの代謝標識は、放射性リン酸キナーゼ1および2を繰り返します

ここでは、IRF3転写因子のリン酸化依存性活性化の詳細な分析を可能にする手順について説明します。これは、高分解能のSDS-PAGEとネイティブPAGEを組み合わせ、複数のリン酸化特異的抗体を用いたイムノブロットと組み合わせることで実現されます。...

IRF3のリン酸化依存性活性化を監視するために、高解像度の方法

ペプチド競合アッセイは、種々の分子および免疫学的実験において広く使用されている。本稿では、in vitroオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細な方法と、特定のリン酸化部位を見出すのに有用な関連する検証手順について説明します。...

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

ロイシンの変異は、リピートキナーゼ2遺伝子(LRRK2)が遺伝性パーキンソン病を引き起こす。我々はヒト末梢血中のRab10のLRRK2制御リン酸化を評価するための容易で、強い方法を開発した。これは、LRRK2キナーゼ経路活性の増加を有する個体を同定するのに役立つ可能性がある。...

Rab10リン酸化を評価してパーキンソン病関連LRRK2キナーゼ経路を尋問するためのヒト末梢血好中球分離

このプロトコルの目的は、ラベル、豊かにする、および特定蛋白質キナーゼ CK2 細胞ライセートや組織ホモジネートなど複雑な生物的サンプルからの基板です。このメソッドは、この目的のため CK2...

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

我々は、堅牢な生化学的アプローチを用いた新しいキナーゼタンパク質を特徴付けた:異なる細胞株および組織上の専用の特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析、共免疫沈殿実験による相互作用、西洋で検出されたキナーゼ活性ホスホ特異的抗体およびγ[32P]ATP標識を用いたブロット。...

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

このプロトコルは、カスタムメイドのポータブルFRET分析器を用いて蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）センサデータの迅速かつ高感度定量を記載しています。デバイスは、糖度の実用的かつ効率的な評価を可能にする、検出感度を最大臨界温度範囲にマルトースを検出するために使用しました。...

ポータブルFRETアナライザを使用して高感度かつ迅速な蛍光検出

この研究は、酸性pH条件下で大腸菌 HdeBのシャペロン活性を特徴づけるために、生物物理学的生化学的および分子技術を説明しています。これらのメソッドは、成功し、このようなHdeAなどの他の酸保護シャペロンに適用されており、他のシャペロンとストレス条件のために働くように修正することができます。...

のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

学ぶリン酸結合タグを用いたSDS-PAGEによるLRRK2によるRab10リン酸化検出法。パーキンソン病研究においてLRRK2変異がRab10リン酸化に与える影響を評価し、簡便なウェスタンブロットで化学量論的推定が可能です。

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