SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出

この実験の全体的な目標は、リン酸結合タグを持つSDS-PAGEを使用して、LRRK2によるRab10リン酸化を検出することです。この方法は、LRRK2の疾患変異がRab10のリン酸化にどのように影響するかなど、パーキンソン研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、単純なウェスタンブロットを使用して、Rab10リン酸化の化学量論を大まかに推定できることです。

このプロトコルの手順の多くはかなり標準的であり、このビデオに付属するテキスト プロトコルで十分に詳細に説明されています。ここでは、視覚的な指導から最も恩恵を受ける手順を示したいと思います。テキストプロトコルに記載されているように、トランスフェクションされたHEK293細胞のプレートを調製します。

プレートを氷の上に置いた状態で、メディアを吸引して廃棄します。次に、各プレートの角に2ミリリットルのDPBSを慎重に追加し、プレートを揺り動かして溶液を広げます。次に、DPBSを取り外して廃棄します。

次に、各プレートに100マイクロリットルの溶解緩衝液を加えます。プレートを傾け、スクレーパーを使用してバッファーを広げ、細胞溶解物を放出します。次に、ライセートを吸引し、氷上で予冷したマイクロチューブに移し、10分間待ちます。

次に、チューブを遠心分離し、上清を氷上の新しいチューブに移すことにより、破片のない細胞溶解物を回収します。次に、Bradfordアッセイを使用して、透明化したライセートのタンパク質濃度を測定します。濃度データについては、ゲル分析用のライセートの100マイクロリットルサンプルを調製します。

過剰発現した赤血球凝集素Rab10と比較して、内因性Rab10を測定するために、より密度の高いライセートを調製します。サンプルを摂氏100度で5分間インキュベートして、サンプルの調製を終了します。その後、サンプルは摂氏マイナス20度未満で、必要になるまで最大6か月以上保管します。

まず、テキストプロトコルに従ってSDS-PAGEセルを準備します。次に、ゲルをタンクに入れ、バインダークリップで固定します。次に、タンクにランニングバッファーを充填し、シリンジに取り付けられた針を使用してウェル内とゲルの下の気泡を取り除きます。

次に、塩化マンガンをサンプルに加え、スピンダウンして沈殿物を除去します。次に、等量のサンプル、過剰発現したヘマグルチニンRab10を分析するために10マイクログラムのタンパク質を、または内因性Rab10を分析するために30マイクログラムのタンパク質をゲルにロードします。空のレーンに塩化マンガンを含むサンプルバッファーをロードします。

また、分子量マーカーにバッファーと塩化マンガンを添加して、サンプルと同じ容量にします。次に、50ボルトでゲルを動かし始めます。サンプルスタックの後、電圧を120に増やして分離します。

染料の前面がゲルの底に達したら、電圧を殺します。次に、以下のようにゲルを3回洗います。分離ゲルを、EDTAおよびSDSを添加したクリーンな転写バッファーの浴槽にロードします。

次に、室温でシェーカーで10分間揺らします。3回の洗浄後、SDSを添加した転写バッファーを使用してもう1回の洗浄を行いますが、EDTAは使用しません。次に、湿ったタンクを使用してゲルを移します。

氷冷水で満たされた発泡スチロールボックスにタンクを入れ、タンクを電源に接続して移送を開始します。効率的な冷却を伴う長時間の移載は、手順に不可欠です。移載後、メンブレンをPonceau Sで染色し、テキストプロトコルに従ってTBSTで洗浄して転写を確認します。

次に、ブロックを適用します。ブロットを乳白色TBSTに浸し、ブロットをシェーカーで室温で1時間揺さぶります。その後、ブロッキング溶液を取り出して廃棄し、一次抗体溶液を塗布します。

次に、メンブレンを摂氏4度で一晩揺らします。翌日、一次抗体溶液を取り出します。次に、前と同じように新しいTBSTでメンブレンを3回洗います。

洗浄後、ブロットを二次抗体溶液に浸し、メンブレンをロッカー上で室温で約1時間インキュベートします。インキュベーション後、メンブレンをTBSTで再度3回洗浄します。次に、メンブレンを開発します。

大きなラップに1ミリリットルのECL溶液を加えます。次に、メンブレンをECLに置き、すばやく裏返して両面を濡らします。次に、メンブレンを持ち上げて水気を切ります。

水気を切った後、片方の端をペーパータオルに約5秒間触れさせて、余分な溶液を吸い取ります。次に、メンブレンをしわのない硬い透明なフィルムで包み、黒いトレイに移してイメージングします。HEK293細胞にヘマグルチニンRab10野生型および3xFLAG-LRRK2をトランスフェクションしました。

家族性パーキンソン病LRRK2の変異で不活性な野生型キナーゼを試験した。LRRK2とRab10の共発現により、Pタグゲルに大きなバンドシフトが生じました。対照的に、キナーゼ不活性変異体との共発現では、Rab10の移動性に変化はなく、バンドシフトの原因としてキナーゼが示唆されました。

また、予想通り、家族性PD変異はすべてバンドシフトを増加させました。P-tagゲルシステムは、LRRK2阻害剤で処理したマウス3T3-スイスアルビノ胚性線維芽細胞の解析にも使用しました。リン酸化された内在性Rab10に対応するバンドシフトは、細胞をGSK2578215Aで処理すると消失しました。

同じ試験をヒトA549細胞を用いて行った。これらの実験では、LRRK2阻害剤の有効性を、LRRK2阻害の確立されたマーカーである抗pセリン935LRRK2抗体を用いて検証しました。この技術を習得すれば、転写前にゲルを洗浄する通常のウェスタンブロッティング手順と比較して、さらに14分しか必要としません。

この手順に続いて、FPD変異体がRab10の同じ残基をリン酸化するかどうかなどの追加の質問に答えるために、質量分析などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、パーキンソン研究の分野の研究者が、培養細胞および組織におけるRab10リン酸化の内因性レベルを調査する道を開きました。溶解バッファーにミクロシスチンを添加した状態での作業は非常に危険であり、細胞溶解物を調製する際には、適切な個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。