SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出
2017年12月14日
本研究では、ロイシン豊富な繰り返しキナーゼ 2 によって Rab10 リン酸化の内因性のレベルを検出する簡単な方法について説明します。
この実験の全体的な目標は、リン酸結合タグを持つSDS-PAGEを使用して、LRRK2によるRab10リン酸化を検出することです。この方法は、LRRK2の疾患変異がRab10のリン酸化にどのように影響するかなど、パーキンソン研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、単純なウェスタンブロットを使用して、Rab10リン酸化の化学量論を大まかに推定できることです。
このプロトコルの手順の多くはかなり標準的であり、このビデオに付属するテキスト プロトコルで十分に詳細に説明されています。ここでは、視覚的な指導から最も恩恵を受ける手順を示したいと思います。テキストプロトコルに記載されているように、トランスフェクションされたHEK293細胞のプレートを調製します。
プレートを氷の上に置いた状態で、メディアを吸引して廃棄します。次に、各プレートの角に2ミリリットルのDPBSを慎重に追加し、プレートを揺り動かして溶液を広げます。次に、DPBSを取り外して廃棄します。
次に、各プレートに100マイクロリットルの溶解緩衝液を加えます。プレートを傾け、スクレーパーを使用してバッファーを広げ、細胞溶解物を放出します。次に、ライセートを吸引し、氷上で予冷したマイクロチューブに移し、10分間待ちます。
次に、チューブを遠心分離し、上清を氷上の新しいチューブに移すことにより、破片のない細胞溶解物を回収します。次に、Bradfordアッセイを使用して、透明化したライセートのタンパク質濃度を測定します。濃度データについては、ゲル分析用のライセートの100マイクロリットルサンプルを調製します。
過剰発現した赤血球凝集素Rab10と比較して、内因性Rab10を測定するために、より密度の高いライセートを調製します。サンプルを摂氏100度で5分間インキュベートして、サンプルの調製を終了します。その後、サンプルは摂氏マイナス20度未満で、必要になるまで最大6か月以上保管します。
まず、テキストプロトコルに従ってSDS-PAGEセルを準備します。次に、ゲルをタンクに入れ、バインダークリップで固定します。次に、タンクにランニングバッファーを充填し、シリンジに取り付けられた針を使用してウェル内とゲルの下の気泡を取り除きます。
次に、塩化マンガンをサンプルに加え、スピンダウンして沈殿物を除去します。次に、等量のサンプル、過剰発現したヘマグルチニンRab10を分析するために10マイクログラムのタンパク質を、または内因性Rab10を分析するために30マイクログラムのタンパク質をゲルにロードします。空のレーンに塩化マンガンを含むサンプルバッファーをロードします。
また、分子量マーカーにバッファーと塩化マンガンを添加して、サンプルと同じ容量にします。次に、50ボルトでゲルを動かし始めます。サンプルスタックの後、電圧を120に増やして分離します。
染料の前面がゲルの底に達したら、電圧を殺します。次に、以下のようにゲルを3回洗います。分離ゲルを、EDTAおよびSDSを添加したクリーンな転写バッファーの浴槽にロードします。
次に、室温でシェーカーで10分間揺らします。3回の洗浄後、SDSを添加した転写バッファーを使用してもう1回の洗浄を行いますが、EDTAは使用しません。次に、湿ったタンクを使用してゲルを移します。
氷冷水で満たされた発泡スチロールボックスにタンクを入れ、タンクを電源に接続して移送を開始します。効率的な冷却を伴う長時間の移載は、手順に不可欠です。移載後、メンブレンをPonceau Sで染色し、テキストプロトコルに従ってTBSTで洗浄して転写を確認します。
次に、ブロックを適用します。ブロットを乳白色TBSTに浸し、ブロットをシェーカーで室温で1時間揺さぶります。その後、ブロッキング溶液を取り出して廃棄し、一次抗体溶液を塗布します。
次に、メンブレンを摂氏4度で一晩揺らします。翌日、一次抗体溶液を取り出します。次に、前と同じように新しいTBSTでメンブレンを3回洗います。
洗浄後、ブロットを二次抗体溶液に浸し、メンブレンをロッカー上で室温で約1時間インキュベートします。インキュベーション後、メンブレンをTBSTで再度3回洗浄します。次に、メンブレンを開発します。
大きなラップに1ミリリットルのECL溶液を加えます。次に、メンブレンをECLに置き、すばやく裏返して両面を濡らします。次に、メンブレンを持ち上げて水気を切ります。
水気を切った後、片方の端をペーパータオルに約5秒間触れさせて、余分な溶液を吸い取ります。次に、メンブレンをしわのない硬い透明なフィルムで包み、黒いトレイに移してイメージングします。HEK293細胞にヘマグルチニンRab10野生型および3xFLAG-LRRK2をトランスフェクションしました。
家族性パーキンソン病LRRK2の変異で不活性な野生型キナーゼを試験した。LRRK2とRab10の共発現により、Pタグゲルに大きなバンドシフトが生じました。対照的に、キナーゼ不活性変異体との共発現では、Rab10の移動性に変化はなく、バンドシフトの原因としてキナーゼが示唆されました。
また、予想通り、家族性PD変異はすべてバンドシフトを増加させました。P-tagゲルシステムは、LRRK2阻害剤で処理したマウス3T3-スイスアルビノ胚性線維芽細胞の解析にも使用しました。リン酸化された内在性Rab10に対応するバンドシフトは、細胞をGSK2578215Aで処理すると消失しました。
同じ試験をヒトA549細胞を用いて行った。これらの実験では、LRRK2阻害剤の有効性を、LRRK2阻害の確立されたマーカーである抗pセリン935LRRK2抗体を用いて検証しました。この技術を習得すれば、転写前にゲルを洗浄する通常のウェスタンブロッティング手順と比較して、さらに14分しか必要としません。
この手順に続いて、FPD変異体がRab10の同じ残基をリン酸化するかどうかなどの追加の質問に答えるために、質量分析などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、パーキンソン研究の分野の研究者が、培養細胞および組織におけるRab10リン酸化の内因性レベルを調査する道を開きました。溶解バッファーにミクロシスチンを添加した状態での作業は非常に危険であり、細胞溶解物を調製する際には、適切な個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
本研究では、リン酸結合タグを用いたSDS-PAGEにより、LRRK2による内因性Rab10のリン酸化を検出する方法を提示します。この手法は、パーキンソン病研究におけるLRRK2変異の影響を理解する上で重要です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生化学
背景
- Rab10は、パーキンソン病に関与するタンパク質であるLRRK2の基質である。
- Rab10のリン酸化を理解することは、神経変性におけるLRRK2の役割に関する知見を得ることにつながる。
- リン酸化を研究するための現在の手法は、複雑で時間を要する場合がある。
- 本研究は、検出プロセスの簡便化を目的としている。
研究の目的
- Rab10のリン酸化を検出するための簡便な手法を開発すること。
- LRRK2変異がRab10のリン酸化レベルにどのように影響するかを評価すること。
- 主要な実験手順の視覚的なガイドを提供すること。
使用した手法
- HEK293細胞へのLRRK2のトランスフェクション。
- タンパク質分離のためのSDS-PAGEの使用。
- 検出のためのリン酸結合タグの適用。
- 化学量論的推定のためのウェスタンブロット解析。
主な結果
- 本手法により、Rab10のリン酸化化学量論の推定が可能になります。
- 視覚的な指示により、プロトコルの理解が深まります。
- 結果は、LRRK2変異がリン酸化レベルに及ぼす影響を示しています。
- このアプローチは、パーキンソン病に関するさらなる研究を促進することができます。
結論
- 開発された本手法は、Rab10のリン酸化を研究する上で有効です。
- LRRK2に関連するメカニズムを調査する研究者にとって、価値あるツールとなります。
- 今後の研究では、本技術を基盤として治療標的に向けた探索が可能です。
よくある質問
業界における重要性
本手法は、リン酸化特異的抗体の限界を克服するためにリン酸結合タグを用いることで、パーキンソン病の病態生理における重要なイベントであるLRRK2による内因性Rab10のリン酸化検出を可能にします。これにより、細胞モデルにおけるLRRK2キナーゼ活性および阻害剤の有効性を評価するための、抗体に依存しない迅速なアプローチが提供され、神経変性疾患の創薬におけるターゲット検証およびメカニズムのリスク低減を支援します。本技術は、遺伝学的および薬理学的摂動におけるリン酸化状態の定量的な比較を容易にし、LRRK2標的プログラムにおけるゴー/ノーゴー判断の根拠となります。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：LRRK2基質のリン酸化を解析することで、疾患関連モデルにおけるキナーゼ活性の機能的リードアウトとしてRab10を検証することが可能になります。
- 実用的価値：ターゲット確認のために、野生型と病原性LRRK2変異体を比較するための簡便な免疫ブロットベースのアッセイを提供します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： リン酸化化学量論に比例した定量的なモビリティシフトを生成し、LRRK2阻害剤の用量反応解析を可能にする。
- 実用的価値： 標準的なSDS-PAGEおよびウェスタンブロットの設備のみで実施可能であり、化合物のスクリーニングにおいて多くの研究室で迅速に導入できる。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 複数の細胞種（HEK293、A549、マウス線維芽細胞）における内因性Rab10リン酸化を検出し、種を越えた翻訳的妥当性を裏付ける。
- 運用上の価値： リン酸化シグナルの消失を通じてLRRK2阻害剤（例：GSK2578215A）のターゲットエンゲージメントを検証し、前臨床薬力学の情報を提供する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、過剰発現系における初期の仮説検証から、疾患モデルにおける内因性パスウェイの調節に至るLRRK2ターゲットバリデーションのカスケードに適合しており、リード化合物の同定から前臨床候補物質の選定までの進展を支援します。
- 探索生物学：細胞内コンテキストにおけるLRRK2キナーゼ活性とRab10のリン酸化状態を関連付けることで、メカニズム的なリスク低減を支援します。
- スクリーニング：標準化されたタンパク質投入量（10–30 µg）とモビリティシフトの読み取りを用いて、化合物がリン酸化レベルに及ぼす影響の評価を可能にします。
- 分析：バンドシフト強度による半定量的な化学量論的推定を提供し、質量分析を用いることなく異なる条件下での比較を容易にします。
- トランスレーショナルリサーチ：ヒトおよびげっ歯類の細胞における阻害剤感受性を実証し、LRRK2-Rab10シグナリングのトランスレーショナルな連続性を裏付けます。
- 企業での再利用：モジュール式の検出プラットフォームとして、さまざまな細胞株、組織、および摂動タイプ（変異体、阻害剤、活性化剤）にわたって再利用可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 基質のリン酸化に関する直接的な証拠を提供することで、LRRK2シグナリングにおけるメカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用の価値： 標準的なウェスタンブロッティングにわずか14分を追加するだけであり、スループットへの影響を最小限に抑えつつ、データの有用性を高めます。
- 戦略的価値： LRRK2の調節と機能的な下流シグナリングを相関させることで、ゴー/ノーゴー判定の精度を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 標的経路のエンゲージメントに基づいた、リスク調整後のLRRK2調節剤の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 細胞溶解、キナーゼアッセイのセットアップ、およびウェスタンブロットの最適化に関する専門知識が必要です。
- ゲル調製のためのリン酸結合タグ試薬および塩化マンガンの入手が必須となります。
- 実験群間でタンパク質ロード量を標準化する必要があります（過剰発現Rab10は10 µg、内在性Rab10は30 µg）。
- 一次組織に適用する場合、リン酸化状態を維持するために溶解条件の最適化が必要になることがあります。
- 本手法はリン酸化によるモビリティシフトの検出に限定されており、相補的な手法を用いなければ特定のリン酸化部位を特定することはできません。
