高速銀染色プロトコルを有効にする簡単なと非変化のポリアクリルアミドゲルを用いた SSR マーカーの効率的な検出

このプロトコールの全体的な目標は、非変性ポリアクリルアミドゲル中のSSRマーカーを迅速、簡単、低コストで検出するための最適化された銀染色法を導入することです。SSRマーカーの迅速なジェノタイピングは、遺伝的多様性解析や分子育種プログラムにおけるマーカー支援選択など、遺伝子研究および応用分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、SSRマーカーの検出に他のプロトコルよりも簡単に実行でき、時間がかかり、化学試薬の使用量が少ないことです。

この方法により、従来のプロトコルに見られる固定、停止、およびいくつかの洗浄ステップを回避できます。そして、必要なのは、含浸と開発の2つの主要なステップだけです。このプロトコルを使用すると、バックグラウンドノイズがないため、SSRバンディングパターンを明確に検出できるため、鮮明な画像を生成できます。

この技術を使用すると、1日あたり約800のDNAサンプルをスクリーニングでき、タバコや花の咲く白菜の研究で成功裏に使用されています。テキストプロトコルに従ってPCR産物とゲル溶液を調製した後、水道水で洗剤を使用してガラスプレートとスペーサー1セットを洗浄し、蒸留水で完全にすすぎます。プレートを乾燥ラックにセットして風乾させます。

長方形のガラス板の内面に1ミリリットルのBind-silane溶液を分散させ、5分間乾燥させます。次に、1ミリリットルのレペルシランをノッチ付きガラスプレートの内面に綿棒で分散させ、ティッシュペーパーを使用して余分な溶液を拭き取ってから、プレートを5分間風乾させます。ガラスプレートをスペーサーで組み立て、ノッチ付きプレートを上にします。

また、鋳造クランプを使用して、アセンブリの両側をクランプします。次に、プレートセット用のビーカーに6%非変性ポリアクリルアミドゲル溶液を適量注ぎます。20マイクロリットルのTEMEDと200マイクロリットルの新鮮な20%APSを加え、穏やかに混ぜます。

ノッチ付きプレートの端に沿って組み立てられたガラスプレートに溶液をすぐに慎重に注ぎ、スペースをほぼ上部まで満たします。そして、櫛を差し込みます。次に、コームの上に少量のゲル溶液を加え、ゲルを室温で30分間硬化させます。

ゲルが完全に重合したら、キャスティングクランプを取り外し、ノッチ付きプレートを上部バッファーリザーバーに向けて電気泳動タンクユニットにセットしたプレートを配置します。大きなclを使用しますamp プレートセットをタンクユニットに取り付けます。1リットルの0.5 X TBEバッファーを上部チャンバーと下部チャンバーのそれぞれに注ぎます。

次に、コームを取り外し、バッファーで満たされたピペットまたはシリンジを使用して、すべてのウェルを完全に洗い流します。ポリアクリルアミドゲルを泳動するには、約1マイクロリットルのPCR産物を各ウェルにロードします。また、両端にDNAラダーをロードします。

次に、安全カバーを上部のバッファーチャンバーに固定します。リード線を電源に接続し、赤から赤、黒から黒に色分けされた色を一致させます。色素が所定の位置に達するまで、ゲルを110ボルトの定電圧で泳動します。

通常、約70分間です。電気泳動後、バルブを開き、上部チャンバーからバッファーを大きなビーカーに排出します。サイドclを取り外しますamp 装置からプレートを取り外します。

次に、スパチュラを使用して、ノッチ付きガラスプレートを片側に沿って慎重に分離し、ゲルがバインドシランでコーティングされたもう一方のガラスプレートに付着したままであることを確認します。次に、1リットルの蒸留水に1.5グラムの硝酸銀を溶解することにより、1リットルの新鮮な含浸溶液を準備します。次に、10グラムの水酸化ナトリウムを900ミリリットルの蒸留水に溶解して、1リットルの新鮮な現像液を調製します。

37%ホルムアルデヒドを1ミリリットル加え、蒸留水を使用して最終容量1リットルに調整します。十分な蒸留水で、ゲルとガラスプレートを慎重にすすぎ、電気泳動バッファーを除去します。次に、ゲルを上に向けてプレートをプラスチックトレイに置き、ゲルを1リットルの含浸液に浸します。

シェーカーでトレイを60RPMで3〜4分間静かに振ってください。プレートを含浸液から別のトレイに移します。次に、十分な蒸留水を使用して、プレートとゲルの表面から残留含浸溶液をそれぞれ3〜5秒間2回洗い流します。

含浸後のゲル洗浄ステップは重要です。不十分な洗浄は、含浸液の不完全な除去を引き起こします。そして、背景が暗くなります。

ゲルを上に向けて別のトレイに置きます。プレートを1リットルの現像液に浸し、トレイを50RPMで約3分間静かに振とうします。DNA断片の外観を監視し、バックグラウンドのノイズに対するDNA断片の信号の最も高い比率が観察されたら、発生を停止します。

適切な開発時間も重要なステップです。開発が過剰になると、背景が暗褐色になり、DNA断片のコントラストが低くなります。プレートとゲルを十分な蒸留水で2回すすぎ、ティッシュペーパーを使用してゲルプレートを乾燥させます。

次に、スキャナーと適切なソフトウェアを使用してゲルを300 DPIでスキャンし、明るさとコントラストを調整して、DNAバンドを鮮明に視覚化します。最後に、画像内のDNAフラグメントサイズに基づいてSSRマーカーのバンディングパターンをスコアリングします。ここで紹介するPCRアンプリコンは、開花中の白菜とタバコの対応するSSRプライマーペアを使用して製造されました。

電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルは、このビデオで示した銀染色プロトコルを使用して染色しました。これにより、SSRマーカーのバンディングパターンが明確に検出されました。異なる銀染色プロトコルの検出効率を比較するために、SSRマーカーのPCR産物をPAGEを使用して分離し、公開されている5つの銀染色プロトコルとこのビデオで実証されている6番目の方法を使用して視覚化しました。

ここで示したプロトコルは、バックグラウンドノイズが最も少なく、DNA断片のコントラストが最も高く、最高の画像鮮明さを実現しました。テストした6つのプロトコルのうち、ここで示す方法は、最も時間がかかり、必要な化学試薬とプロセスステップの数が最も少なくて済みます。最後に、この図は、レーン1のバンドあたり10ナノグラムからレーン11のDNAバンドあたり9.8ピコグラムまで、非変性ポリアクリルアミドゲル上の50〜2000bpのDNAマーカーの段階希釈を使用して測定したプロトコルの感度を示しています。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば7分で完了します。この手順を試行する際には、含浸液と開発液の相互汚染を防ぐことを覚えておくことが重要です。開発後、この技術は、研究者がSSRマーカーを迅速に遺伝子型決定する道を開きました。

このビデオを見れば、銀染色を使用して非変性ポリアクリルアミドゲル中のSSRマーカーを簡単かつ効率的に検出する方法を十分に理解できるはずです。化学試薬の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行するときは常に手袋などの予防措置を着用する必要があることを忘れないでください。