蛍光銀染色:ポリアクリルアミドゲル中の総タンパク質を可視化する技術

ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質の蛍光銀染色では、蛍光プローブを使用してタンパク質を検出および定量します。

を含むポリアクリルアミドゲルから始めて、電気泳動によってバンドに分離します。エタノールと酢酸の固定混合物に浸し、タンパク質を変性させることでバンドの拡散を防ぎます。

ゲルを洗浄して残留酢酸とエタノールを除去します。ジェルを硝酸銀の染色に浸します。銀イオンは、タンパク質の負に帯電した基に強く結合します。

暗闇の中でインキュベートします。ゲルを超純水ですすぎ、結合していない銀イオン錯体を除去します。

多成分蛍光プローブ(TPE-4TA)を含む現像液にゲルを浸漬します。この陰イオンプローブは、タンパク質に結合した銀イオンを標的にし、プローブの蛍光特性を活性化する不溶性凝集体を形成し、蛍光

蛍光活性化は凝集に依存しているため、結合していないプローブはシグナルを発しないため、バックグラウンド発光を低減した全タンパク質染色が可能です。

ゲルを暗所で穏やかに撹拌しながらインキュベートし、完全な蛍光発生を確実にします。ゲルを脱色バッファーに移して、結合していないプローブを除去します。最後に、ゲルを画像化してバンド信号強度を取得します。標準タンパク質曲線に対する蛍光シグナル強度をプロットして、サンプル中のタンパク質の総量を計算します。

電気泳動後、エタノールと酢酸を含む100ミリリットルの溶液にオービタルシェーカーでゲルを沈め、室温で50RPMで振とうしながら30分間2回インキュベートします。次に、清潔な容器でジェルを超純水で3回洗浄し、各洗浄を10分間持続させます。

まず、0.01グラムの硝酸銀を10ミリリットルの超純水に溶解し、濃度0.1%の原液を調製します。この原液100マイクロリットルを100ミリリットルの超純水に加えて、硝酸銀作業溶液を作ります。ヒュームフードで、密閉されたガラスチャンバー内の100ミリリットルの硝酸銀作業溶液にゲルを浸します。

浸中はアルミホイルを使用してゲルを光から保護し、オービタルシェーカーで50RPMで振とうしながら1時間インキュベートします。この後、清潔な容器でジェルを超純水で2回洗浄し、各洗浄は約100ミリリットルの水を使用し、60秒間持続します。

バックグラウンド染色を最小限に抑えるために、銀含浸ステップの後に超純水を使用してゲルを洗浄することが重要です。

まず、50ミリグラムのTPE-4TA染料に3ミリリットルの超純水を加えます。溶液を3分間超音波処理し、各超音波処理セッションの間に5マイクロリットルの1モル水酸化ナトリウム溶液を加えて、染料を通常最大3回溶解させます。次に、365ナノメートルのUVランプの下で溶液の蛍光をチェックし、染料が完全に溶解していることを確認します。弱い溶液または非発光溶液のみが完全な溶解を示します。

蛍光現像液を調製するには、10 ミリリットルの TPE-4TA 原液を 90 ミリリットルの超純水に加えます。pHメーターを使用して溶液のpHを確認します。pHが範囲外の場合は、希釈した水酸化ナトリウム溶液または酢酸を使用して、溶液を7〜9のpHに調整します。

次に、ゲルを 100 ミリリットルの蛍光現像液を入れた清潔で密封可能な容器に移し、ゲルが完全に浸されていることを確認します。容器を密封し、光から保護するために蓋をします。容器をオービタルシェーカーで50 RPMで室温で一晩振とうします。

ゲルを清潔な容器に移し、100ミリリットルの10%エタノールで30分間染みを取り除きます。次に、ジェルを超純水で5分間すすいでください。ゲルは、ベンチトップトランスイルミネーターで視覚化することも、ゲルドキュメンテーションマシンで365ナノメートルチャネルまたは302ナノメートルチャネルで画像化することもできます。