マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ

この手順の全体的な目標は、酸化ストレスを受ける酵母の発現差を調べることにより、理系学部生にマイクロアレイ技術を紹介することです。これは、まず過酸化水素で処理した酵母培養物と未処理のコントロールから全RNAを単離することによって達成されます。手順の2番目のステップは、これらのRNAサンプルからCDNAを生成して精製することです。

次に、CDNAを使用して、in vitro転写を介してビオチン標識CRNAを調製します。手順の最後のステップは、ビオチン標識CRNAの断片化であり、AFIメトリック酵母遺伝子チップへのハイブリダイゼーションです。最終的には、2つの酵母サンプルの発現の違いを示す結果が得られ、バイオインフォマティクスを通じて、マイクロアレイ解析の力を学部生に示すことができます。

バーモント遺伝学ネットワークアウトリーチチームは、科学教育を強化するためにバーモント州全体の科学学生にマイクロレイ技術を提供する責任を負ったときに、この方法のアイデアを最初に思いつきました。現在までに、この方法は州内の8つのバカロレア大学の複数のサイトに提供されています。ですから、マイクロレイの教育モジュールを使用する主な利点は、研究室全体で毎日使用される一般的な分子生物学の技術を個人のグループに教え

また、これを使用して、生徒や教師、そして私たちのグループに教えることもできます。実は、学生と教授が同じプロジェクトに一緒に取り組んでいるのです。彼らは、RNAの取り扱いなど、多くの技術を必要とする特定の技術を学びますが、これは簡単な作業ではありません。

彼らは、視覚化試薬を使用してDNAを沈殿させる方法を学びます。彼らは実際に、大学院の研究や日常の分子生物学研究室で遭遇する技術を使うことができます。この方法は、酸化ストレスや酵母についての洞察を得るのに適していますが、他のモデル生物や他の生物学的システムにも確実に適用できます。

遺伝子発現は、発生変化、環境毒素、特定の疾患状態など、さまざまなことに関連しているかどうかを変化させます。酸化ストレスを受ける酵母の発現差を調べるために、まず酵素溶解により2つの酵母培養物から全RNAを抽出します。一方の培養物は、ハンクの緩衝生理食塩水中に0.5ミリモルの過酸化水素を1時間投与し、他方の培養物をHBSSのみを対照として処理することにより、酸化ストレスに曝露しました。

まず、2本の1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに適切な識別情報を付けます。1.5ミリリットルの適切な酵母培養物を各チューブに移します。チューブを5, 000Gで室温で2分間遠心分離します。

遠心分離後、マイクロピペットを使用して、ペレットを乱さずに上清を慎重に除去および廃棄します。手順を続行する前に、ペレットが十分に大きいことを確認してください。ペレットが小さすぎる場合は、ペレットが入った同じチューブに1.5ミリリットルの培養物を加え、遠心分離してより大きなペレットを得ます。

マイクロピペットで上清を捨て、酵母ペレットからできるだけ多くの液体を取り除きます。次に、100マイクロリットルのSGバッファーと30マイクロリットルのリアーゼ溶液を酵母ペレットボルテックスに加えて混合します。インキュベーション中に両方のチューブを室温で30分間インキュベートします。

各チューブを10分ごとに静かに回転させて、プラットを生成します。酵母のスフェロめっきを行う際の最も重要なステップの1つは、処理後に実際に100%のスフェロプラストを作成したことを確認することです。つまり、すべての溶解酵素が同じように作られているわけではありません。

そのため、良好な溶解酵素が良好なスフェロめっきを与えているかどうかを確認する必要があります、つまり、これらのサンプルを採取し、顕微鏡スライドに載せ、0.1%SDSを添加して顕微鏡で確認し、プロトプラストが形成されていることを確認する必要があります。完全なスフェロめっきを観察するには、10マイクロリットルの酵母サンプルを顕微鏡スライドにピペットで固定し、顕微鏡下で0.1%SDSの1マイクロリットルでサンプルを検査して、酵母細胞を膨潤させ、完全な球体またはスフェロイドを形成します。出芽細胞がSスフェロイドを形成することも観察することが重要です。

部分的なスフェロめっきが観察される場合は、リアーゼによる長期処理が推奨されます。各チューブに350マイクロリットルのBRLTバッファーで完全なスフェロめっきが確認されたら、次に250マイクロリットルの100%エタノールを添加します。蓋を閉めたまま1分間激しく渦巻き、チューブがしっかりとキャップされていることを確認します。

この手順では、Spheroプラットをシラミで除きます。この後、RスピンカラムとEasy Zスピンカラムを使用して、2つの培養物からRNAを収集して洗浄します。最後に、1.2%プレキャストarosゲルを電気泳動に使用して抽出したRNAの品質を評価し、ビオチン標識CRNAを調製します。

酵母細胞から抽出した全RNAは、まず逆転写によってCD NAを合成するために使用されます。CD NA生成後、CDNA沈殿遠心分離機で使用するフェーズロックゲルチューブを1分間全速力で準備し、ゲルがチューブの底にあることを確認します。pH 8.0トリス緩衝フェニルクロロホルム、イソアミルアルコール、またはPCI混合物の最下層のCD NAピペット162マイクロリットルを沈殿させ、第2ストランドの162マイクロリットルの内容物に加えて、このステップには同量の水溶液と有機混合物が必要です。

5秒間渦を巻いて内容物を混ぜ合わせます。次に、マイクロピペットを使用して、すべてのCD N-A-P-C-I混合物をフェーズロックゲルチューブに移します。フェーズロックゲルチューブ遠心分離機を全速力で2分間ボルテックスしないでください。

次に、マイクロピペットを使用して、フェーズロックゲルチューブから新たにラベル付けされた1.7ミリリットルチューブに最上層を移します。できるだけ多くのレイヤーを収集してみてください。1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブ、405マイクロリットルの100%エタノール、80マイクロリットルの酢酸アンモニウム、および1マイクロリットルのペレットペイントボルテックスに以下を追加します。

チューブのヒンジを外側に向けてチューブを遠心分離機に短時間置き、全速力で20分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、室温でCDNAペレットを乱さないように注意しながら、チューブを遠心分離機から静かに取り外します。ペレットは、ペレット塗料とほぼ塩粒のサイズのためにピンク色である必要があります。

そして、ヒンジの下のチューブの側面で、CD NAペレットを氷の上に置き、すぐにペレットのクリーニングに進みます。CD NAペレットの洗浄手順を開始するには、P 1000マイクロピペットを使用して、チューブからすべての上清を慎重に取り除きます。ペレットを乱さないように注意してください。

それはチューブに冷たい、80%エタノールの500マイクロリットルであなたのサンプルです。チューブをそっとキャップし、ゆっくりと数回反転させます。ペレットがチューブの側面から外れないように、ペレットを非常に注意深く監視してください。

ペレットが外れた場合は、チューブをラックに戻し、ペレットを底に落ち着かせるか、チューブを全速力で15秒間遠心分離することで、チューブの底に戻すことができます。次に、P 1000マイクロピペットを使用して、ペレットを乱さずにエタノールを慎重に取り除きます。チューブを傾けて、できるだけ多くの液体を除去できるようにします。

新しいEloqua of cold, 80%ethanolを加え、チューブにキャップをして、ゆっくりと数回反転させます。P 1000マイクロピペットを使用して可能な限りすべてのエタノールを除去した後。チューブを全速力で5秒間遠心分離します。

次に、P 10マイクロピペットを使用して、ペレットを乱さずに最後の数マイクロリットルのエタノールを取り出します。開いたチューブを乾燥ボックスに10〜20分間入れて、残りのエタノールを蒸発させます。ペレットは乾くと簡単に失われるので、チューブを優しく扱い、キャップを閉めるように注意してください。

乾燥が完了したら、乾燥したペレットを視覚化して、チューブ内に存在することを確認します。最後に、乾燥させたペレットを22マイクロリットルのRNAフリー水に再懸濁し、チューブを氷の上に置きます。次に、このCDNAを使用して、Enzo BioArrayキットを使用したin vitro転写によりビオチン標識CRNAを調製します。

ビオチン標識CRNAを洗浄して定量した後、標的調製のために断片化します。CDNAが生成されたら、次に標準的なin vitro転写法を使用してビオチン化CRNAを生成します。CRNAは、マイクロレイチップに適用する前にフラグメンテーションを経る必要があります。

この手順を開始するには、5マイクログラムのCRNAに相当する量を標識された0.5ミリリットルのPCRチューブに移します。総容量を16マイクロリットルにするのに十分なRNAフリーウォーターを追加し、次に5 xフラグメンテーションバッファーを4マイクロリットルのチューブに追加します。チューブ内の総容量は20マイクロリットルである必要があります。

チューブをボルテックスし、10秒間遠心分離します。次に、チューブを摂氏94度で30分間インキュベートします。サーモサイクラーで、インキュベーション後にチューブを氷の上に置きます。

次に、各サンプルの断片化されたCRNAと未断片化されたCRNAを、1.2%プレキャストAROSゲルを使用した電気泳動で評価します。ランが完了すると、ゲルをトランスルミネーターで可視化し、画像を取得します。最終的な合成産物をアトリクイースト遺伝子チップにハイブリダイズし、マイクロアレイ解析の代表的な結果をここに示します。

この最初の図は、atrics gene chipオペレーティングソフトウェアによって生成されたスキャンされたatrics yeast gene chip画像の一例です。これは、すべての遺伝的転写産物、約6, 700遺伝子の2D散布図であり、対照酵母と処理酵母のデータを比較しています。各点は 1 つの遺伝子を表します。

紫色に着色された遺伝子は発現差のある遺伝子を示し、赤色に着色された遺伝子は発現しない遺伝子を示します。この例では、差次的に発現する遺伝子のほとんどは、その説明が示すように細胞周期制御に関与する遺伝子です。アノテーションの可視化と統合的発見のためのデータベースからのこのフローチャートは、影響を受ける生物学的経路で差次的に発現する遺伝子を示しています。

赤い星で示されている遺伝子は、縮瞳経路でダウンレギュレーションされた遺伝子を示しています。最後に、Geo Species Gene Sifuterソフトウェアを使用して生成された火山プロットの代表的な結果をここに示します。コントロールサンプルと処理サンプルを、0.05 の P 値カットオフ値と 1.5 倍の発現変化カットオフ値で比較しました。

は急速に成長しやすいため、酵母の使用を選んだのですが、酵母を扱う上で最も重要な部分は、実際に適切なスフェロメッキを作成することであることも認識していました。マイクロアレイでやりたくないことの1つは、実際には不完全な消化を行い、G1またはG2のM期にあるスフェロプラスト細胞のみを行うことです。そして、特定の複製段階にある酵母でマイクロアレイ実験を行います。

この演習で私たちが強調しようとしているもう一つの複雑な点は、人々が毎日話しているCD NAのペレット化は必ずしも簡単ではないということです。そして、私たちのモジュールで行ったことは、実際に特殊なチューブと可視化試薬を使用したことです。ですから、実際にDNAをスピンダウンし、アペレートを視覚化することで、学生と教師の両方にとってより簡単にすることができます。

そのため、開発後のDNAおよびRNA作業のすべてのフェーズで使用できます。このモジュールは、バカロレア研究所の教員が、既存のカリキュラムや自身の研究関心と互換性がある可能性のある他のモデル生物や他の治療計画を検討するための道を本当に開きました。また、いくつかの変更例を挙げると、除草剤処理が酵母に及ぼす影響を調べたサイトや、酵母のLAMP IDE処理を調べたサイト、特に興味を持っていた哺乳類の細胞株の発生変化を調べたサイト

そして最後に、別のサイトでは、シロイヌナズナや植物に対する差動光源の影響を調べていました。このビデオを見れば、酵母からの全RNAの単離、CDNAの生成、ビオチン標識CRNAの断片化など、理系の学部生を対象としたマイクロレイ実験の設定方法について十分に理解できるはずです。このような高度な技術を実際に体験することで、学部の理科教育の強化・強化に役立っています。