ボルネオから下顎腺貯留層内容の分離 ' GC MS と MetaboliteDetector による Volatilome 解析のためアリの (守) を爆発

この方法は、昆虫メタボロミクスにおける重要な疑問に答えるのに役立ちます。代謝物プロファイリングアプローチは、他の生物との相互作用における揮発性物質の役割を解明することにより、アリの化学生態学を研究するために使用できます。提示されたワークフローの主な利点は、基本的に独立して適用できる2つの異なる部分で構成されていることです。

第一に、下顎腺リザーバーとその含有量の物理的分離、第二に、対象の生物学的サンプルにおける非標的プロファイリングと揮発性有機成分の同定。その手順を実演するのは、私の研究室の才能ある博士課程の学生であるMichaela Hoenigsbergerです。アリを解剖する前に、ドラフト内で、ガラスのペトリ皿と解剖器具を紙のティッシュとメタノールと水の1プラス1体積混合物を使用して清掃します。

皿は摂氏マイナス20度で保管してください。次に、シリコンPTFEセプタムを含むスクリューキャップを含む1.5ミリリットルの短糸バイアルの質量を取ります。バイアルを氷の上に保存します。

次に、冷凍可鍛性コールドパックを発泡スチロールの箱に入れます。次に、コールドパックの上にペトリ皿を載せ、冷凍アリを皿に入れます。次に、実体顕微鏡でアリを調べます。

その胃コンパートメントの完全性を確認してください。アリは無傷のガスター領域を持っていなければなりません。ガスターが平らなアリや、体表面に硬化した下顎腺リザーバーの内容物が痕跡残っているアリは使用しないでください。

次に、下顎腺のリザーバーの内容物をアリから分離します。鉗子を使用して前脚と葉柄をつかみ、これらの体のセグメントをゆっくりと引き離します。次に、細い鉗子を使用してテルギット4のガスターをつかみます。

別の鉗子で、テルギット1をつかみ、テルギットを剥がしてそっと取り除きます。このプロセスを繰り返してテルギット2と3を引き剥がし、下顎腺リザーバーの胃腸部分がほとんど見えるようにします。下顎腺のリザーバーは、C.Explodensの働きアリでは黄色ですが、色は黄色よりも白、他の種では赤までさまざまです。

次に、解剖針を使用して、対になった下顎腺リザーバーのワックス状の内容物を胃コンパートメントから引っ掻き出して静かに取り除きます。下顎腺のリザーバーの内容物のうち、アリガスターに存在する他の腺や体構造に圧力をかけずに分離できる部分のみを取り除きます。下顎腺リザーバーの内容物をすべて収集する必要はありません。

次に、下顎腺リザーバーの内容物を、解剖針の先端で優しく触れて、くっつくまで拾います。次に、腺の内容物を冷たい1.5ミリリットルの短いスレッドバイアルに移します。針先をバイアルの壁に沿って動かし、グランドの内容物をバイアルの壁に塗る必要がある場合があります。.

分析できるようになるまで、コレクションを覆い、氷の上に置いておきます。解剖の合間に、メタノールと水の混合物で器具と皿を再度洗浄します。1つの分析サンプルを作成するには、複数のアリの腺リザーバーの内容物を組み合わせます。

この場合、5匹のC.explodens働きアリの腺内容物がプールされます。コントロールのために、下顎腺リザーバーに隣接するデュフォー腺で構成されたサンプルを収集します。腺内容物を抽出する前に、分析サンプルの質量を決定します。

次に、氷冷した高純度酢酸エチルを体積で14部、ティッシュを質量で1部加えます。冷却条件下で5分間準備をボルテックスします。次に、サンプルを10分間遠心分離し、上清を収集します。

約55〜75マイクロリットルの上清が5匹のアリのサンプルから期待されます。各上清を0.1ミリリットルのマイクロインサートを備えた予冷した1.5ミリリットルの短糸バイアルに移し、穴と赤いゴムPTFEセプタムを含むスクリューキャップを使用してバイアルをしっかりと密封します。完全なGCMS測定シーケンスを得るには、市販のアルカン標準溶液をヘキサンで8ミリグラム/ミリリットル/化合物に希釈して作られた、保持インデックス校正混合物を含む1.5ミリリットルの短糸バイアルを調製します。

次に、溶媒ブランクとして機能する純粋な酢酸エチルの別のバイアルを準備します。ガスクロマトグラフの冷却されたオートサンプラートレイに、最初に溶媒ブランク、次に保持インデックスキャリブラント混合物、3番目に下顎腺リザーバー含有量抽出物、4番目にデュフォー腺含有量抽出物をロードします。トレイを氷の上に置き、ガスクロマトグラフに輸送します。

冷却されたオートサンプラーにトレイを挿入します。各サンプルについて、1 マイクロリットルのアリコートを GC 質量分析計に注入し、ターゲット化合物に適したカラムでクロマトグラフィー分離します。HP-5MS UIコラムなど。

次に、適切な GC パラメータを設定します。たとえば、キャリアガスにヘリウムを使用し、カラム流量は1分あたり1ミリリットルです。オーブンの温度ランプを摂氏40度から2分間開始し、その後、毎分摂氏10度のランプを摂氏330度まで使用します。

その後、7分間のホールド。これらのパラメータを使用して、入口温度を摂氏270度に設定します。次に、必要に応じて、GC質量分析の分割比を調整します。

目的の化合物に適切なピーク形状と強度が得られるように注入します。補助温度を摂氏350度に設定します。質量分析の場合。

次のパラメータを使用します。MSソース温度230°C、MSクワッド温度150°C、低質量30から高質量500までのスキャン範囲で、毎秒約3スキャンのスキャンレートを実現します。そして、溶媒ブランクと実験サンプルの溶媒遅延は4.1分、保持インデックスキャリブラント混合物の溶媒遅延は6.1分です。

測定が完了したら、GCMSデータ解析ソフトウェアを開き、データをAIAプロジェクトファイルとしてポータブルストレージデバイスにエクスポートして、64ビットLinuxベースのオペレーティングシステムを搭載したコンピューターへのデータ転送を容易にします。データを分析するには、代謝物検出器ソフトウェアの使用に関するプロトコルテキストの説明に従ってください。.野外でアリを採取し、マイナス20°Cで2日間冷凍した後、分析するまでマイナス80°Cで保存しました。

5匹のC.explodens働きアリの下顎腺貯留層の内容物をプールし、GCMSで測定しました。データ分析により、数十の推定される腺含有量化合物が明らかになりました。下顎腺リザーバー含有量抽出物中の2つの主要な代謝物は、カラムの過負荷を引き起こしました。.

そのため、同じサンプルを50対1という高い分割比で再度分析しました。デュフォー腺の成分による下顎腺リザーバー含有量の交差汚染は、デュフォー腺サンプルを検査することにより調査されました。このような汚染物質は、約 29 分から始まる遅い保持時間を示しました。

検出された推定下顎腺リザーバー含有量代謝物は、スペクトルと保持指数の類似性の組み合わせに基づいて、社内ライブラリと同定されました。これにより、検出された代謝物の約10%の同一性を確認することができ、その一部は化合物1から5としてリストされています。このビデオを見た後、MS測定を選択することにより、一度に1つの代謝物を分離、抽出、および決定する方法を十分に理解しているはずです。

一度習得すると、同じサンプルの分離、溶媒抽出、およびデータ取得は、適切に実行されれば約2時間で実行できます。揮発性有機化合物プロファイルの複雑さに応じて、データ評価に必要な時間は異なります。この手順を試行する際は、収集から分析まで、サンプルを恒久的に冷却しておくことを忘れないでください。

さらに、セクションの前に、アリのガスターが物理的に無傷であることを確認する必要があります。この手順は、代謝物の比較定量または絶対定量と組み合わせることもでき、代謝組成、さまざまな環境条件、または缶詰成分の絶対量などの追加の質問に答えることができます。便利なことに、このプロトコルの抽出、測定、およびデータ評価のステップは、他の昆虫、微生物、または植物などの複数の生物学的システムにも適用できます。