周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

ショウジョウバエ種における発育中の瞳孔および成体の末梢嗅組織を病期分類および解剖する全体的な目標は、末梢嗅組織の分子的および発達的分析のためのサンプルを生成することです。この方法は、嗅覚系の発生および進化分野における重要な疑問、例えば、発生中の末梢嗅組織における特定の遺伝子の発現動態レベルおよびパターンなどに答えるのに役立ちます。この方法により、ショウジョウバエ種における末梢嗅覚系の発達過程についての洞察を得ることができます。

また、末梢味覚系や視覚系などの他の感覚系にも適用できます。RNAシーケンシング実験では、100〜200個のアンテナディスクまたはアンテナを4つの異なる発生段階に収集することを計画します。免疫組織化学では、10〜20匹のハエを解剖する計画を立てます。

解剖に関与するすべての材料を70%エタノールを使用して洗浄します。次に、RNase中和剤で材料をさらに洗浄します。また、すべての溶液はヌクレアーゼフリーまたはDEPC処理水を使用して製造します。

蛹を収集するには、30分間隔で幼虫を監視します。そして、ゼロアワーAPF蛹段階で蛹を集めます。幼虫は動かず、非常に明るく、ほぼ白い色の蛹のケースに囲まれます。

この段階で、幼虫を湿った濾紙で小さな2インチのペトリ皿に移します。ゼロ時間APFステージ解剖の場合は、すぐに蛹前触角椎間板の採取に進みます。それ以外の場合は、皿をパラフィンフィルムで覆い、動物が関心のある発達段階になるまで、摂氏25度で成長させます。

他のショウジョウバエ種の蛹の発育を段階的に行うには、0時間の蛹前の幼虫を収集し、それらを新鮮なバイアルに選別します。次に、蛹になるまでの日数を記録します。そして、今回は単にメラノガスターのタイムラインにスケーリングします。

まず、RNaseフリーの1.5mmチューブで150マイクロリットルのRNA分離溶液を冷却します。次に、解剖パッド上にPBSのいくつかの別々の液滴を沈着させます。PBSの各滴に、解剖する1匹の蛹を置きます。

0〜2時間の蛹の場合は、鉗子を使用してマウスフックをつかみ、これらの構造を引っ張って脳と想像上の椎間板を引き裂いて露出させます。8時間の蛹の場合、最初に蛹の最も前方の四分の一から蛹のケースをそっと剥がし、発育中の頭を露出させます。次に、首の関節で頭を外します。

触角円盤は、発達のこの段階では頭の中にあります。次に、触角椎間板を含む組織をPBSの別の液滴に移します。次に、視葉で脳に接続されている眼触角椎間板を特定します。

鉗子を使用して、眼触角椎間板を外し、新しい液滴に移します。8時間の蛹では、目の椎間板が触角の椎間板をカップに入れ、両方とも脳の前方にあります。次の液滴で、鉗子を使用して目と触角椎間板を分割します。

次に、P20ピペットチップを使用して、解剖した組織を最小限の液体で静かに収集します。椎間板をRNA単離溶液試薬に沈着させ、少なくとも100個が収集されるまで触角椎間板の解剖を続けます。蛹形成後40時間で、成虫のアンテナは最終的な形をしていますが、まだ透明です。

この段階では、RNA配列の収集には少なくとも50個の蛹が必要です。まず、150マイクロリットルのチルドRNA単離溶液を調製します。解剖パッドで、蛹をPBSの液滴に入れます。

次に、1対の鉗子で体を安定させ、最も前方の四分の一から蛹のケースをそっと剥がして頭を露出させます。次に、首の関節で頭を慎重に取り外します。次に、ヘッドをPBSのきれいな液滴にそっと移します。

そこでヘッドを囲む膜を取り除くために、PBSでヘッドを上下にピペッティングします。このクリーニングにより、アンテナが見えるようになります。次に、セグメントジョイントの2番目と3番目のセグメントの間のメンブレンからアンテナを外します。

第3のセグメントには、触角嗅覚受容体が含まれています。次に、ピペットを使用して、解剖した組織をRNA単離溶液に穏やかに移し、移動する液体の量を最小限に抑えます。RNA抽出には、CO2パッドで麻酔をかけた成体を解剖します。

まず、CO2パッドと鉗子をRNase阻害剤で処理します。次に、成虫に麻酔をかけ、解剖顕微鏡でパッドを観察します。2対の鉗子を使用して体を安定させ、2番目の触角セグメントから3番目の触角セグメントをそっと引き出すかつまんで組織を収集します。

鉗子を液体に浸して離すことにより、アンテナをRNA分離溶液のチューブに移します。アンテナは水没させる必要があります。アンテナが側壁にくっついていると、RNAは早期に分解されます。

十分なアンテナを採取したら、RNAの抽出を進めます。または、収集チューブを摂氏80度で無期限に保管してください。アンテナが免疫組織化学を目的としている場合は、フライをPBSに沈めた状態で、Tritonの有無にかかわらず、この解剖パッドでこの解剖を行います。

解剖された発生中の嗅覚組織は、RNA抽出に使用でき、続いてRT-PCRを使用して遺伝子発現を評価することができます。例えば、表面受容体転写産物および嗅受容体転写産物の発現は、この方法で研究することができる。あるいは、この組織を免疫組織化学に使用して、目的の遺伝子の発現パターンと細胞内局在を決定することもできます。

例えば、Rn-EGFPトランスジェニックフライは、抗GFP抗体および抗ラミニン抗体で染色することができます。この解析では、蛹形成後40時間で、Or67d遺伝子がアンテナ内の特定の細胞で活性化し、GAL4-UASシステム下でのGFPの発現を促進することが明らかになった。一度マスターすれば、適切に行えば1時間で解剖を行うことができます。

この手順を試行する間は、各ショウジョウバエ種の蛹の発育期間に基づいて、時間と適切にスケジュールされたピッキング、老化、解剖を忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、qRT-PCR、免疫組織化学などの他の方法、およびその他のin vivo染色および転写プロファイリング技術を実行して、発生中の組織内のシステムレベルでの転写のパターンとプロファイルに関する追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、感覚系の進化と発達の分野の研究者が、ショウジョウバエ種の他の感覚系における転写ダイナミクスと新規遺伝子発見を探求するための道を開くでしょう。

鋭利な鉗子、一部のRNA抽出溶液、ホルムアルデヒドを使用した作業は非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行する際には、細かい運動能力、高い注意力、適切な実験服の着用を発達させるために、解剖の事前の実践などの予防策を常に講じる必要があります。