Name: 周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶショウジョウバエの周辺嗅覚組織の解剖法と免疫組織化学解析。発生段階の特定、組織採取、遺伝子発現解析の手法を習得し、感覚系の発生と進化の研究に応用できます。

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本研究は、ペリン C. ボルカン (デブ 1457690) に全米科学財団からの助成金によって支えられました。

次のプロトコルは、デューク大学研究倫理委員会の倫理規範と一致。
1. 組織ショウジョウバエ蛹の発育の準備及び
<ol><li>まず、どのように多くのハエが郭清の必要があります。RT-PCR および RNAseq は、前、8 h APF、40 h APF、および大人の段階で必要である個人から 100-200 触角ディスクと触角を収集します。免疫組織の個々 の 10-20 を解剖します。</li>
	<li>郭清パッドおよび鉗子、70% のワイプを使用してを含むすべての材料をきれい江藤。切り裂かれた材料は RNA の抽出に使用する RNase 中和剤できれい、ヌクレアーゼ フリーのいずれかを使用してすべてのソリューションまたはピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) 処理水。 注: このプロトコルは、ガラスではなく、解離の解離のシリコン パッドを使用します。シリコン パッドは超微細鉗子にやさしい、高速かつ高品質の解離を促進します。</li>
	<li>0 h APF/前ステージで蛹を収集します。<ol>
<li>最も正確なステージングを確認するには、30 分を 1 時間間隔で幼虫を監視します。 注: やや混雑したボトルで放浪 3 齢幼虫は数時間以内は蛹可能性が高い。</li>
		<li>幼虫は不動なり非常に軽い (ほぼ白) 色蛹ケースに囲まれている、一度、小 2 で湿ったろ紙を敷いたシャーレに転送します。</li>
		<li>1-2 時間、時折監視、識別、および前蛹の転送を続けます。 注: または、すべて蛹のボトルをオフにし、幼虫は、2 h の開発を許可します。すべての蛹は、APF 範囲 2 h が 0 - 2 h になります後に収集されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ 3.1 0 h APF ステージ前の触角を解剖するすぐに移動します。イラガ前蛹が熟成する場合は、皿にそれらを収集、カバー皿とパラフィン膜の乾燥を抑制するエッジの周りを配置し、25 ° C にペトリ皿を配置 注: 蛹は、羽化に今老化することができます。</li>
	<li>蛹は 2 h の範囲で収集の蛹がないことを確保するために 2 h 希望年齢未満の前蛹を年齢超過。</li>
	<li>組織が非常に小さく、壊れやすい、超微細鉗子 (デュモン 55) を使用します。</li>
</ol>2. 組織他のショウジョウバエの種から蛹の発達の準備及び
<ol><li>他ショウジョウバエ種の蛹の発育日数を調べるには、最適な温度でサンプルを配置、前蛹を観察するときの日付を記録、新鮮なバイアルに並べ替えたり、イラガ前蛹から成人期までの日数数を記録します。</li>
	<li>非キイロショウジョウバエ種とキイロショウジョウバエの蛹の発育のための時間の割合を記録します。キイロショウジョウバエのステージング非キイロショウジョウバエ種を年齢に時間の数を取得するために使用時間の数によって発達の時間の割合を乗算します。</li>
</ol>3.ショージョーバエ ・蛹の触角の郭清
注: すべてのエージング時間と解剖のプロトコルの説明がキイロショウジョウバエ。他のすべての種のため、種特異的な発達時期に基づく高齢化プロトコルの変更は、前述のよう、必要になります。
<ol><li>蛹の触角解剖の 50 100 0 - 2 h やヘラを使用して 6 ~ 8 h 古い蛹を収集し、郭清パッドの上に置きます。</li>
	<li>RNA 分離ソリューションの 150 μ L のピペット、RNase フリー 1.5 mL および microfuge 200 μ L ピペットを使用してチューブし、チューブを氷の場所に。</li>
	<li>1 × PBS (リン酸緩衝生理食塩水、ヌクレアーゼ フリー) の 150-200 μ L 中の蛹を解剖します。郭清パッドに PBS (液滴あたり 150-200 μ L) の複数の滴を配置します。</li>
	<li>郭清パッド PBS 滴 × 1 のいずれかで切り裂かれる 0 - 2 h または歳 6-8 h 蛹 (1 ドロップ 1 つ蛹) を配置します。体を安定させるために片方の手で鉗子を使用します。</li>
	<li>0 - 2 h 蛹、イラガ前蛹の最も前方部分 (口フック) する一方、ホールドで鉗子を用いた高齢者し、脳と前蛹の場合に添付成虫ディスクを公開するそれを引き出します。</li>
	<li>8 h APF 蛹の最初を慎重にはがし本体を囲む膜の袋内のヘッドを公開、蛹の最も前の四半期から蛹ケース。 注: ボディ、この段階でように見えます変性幼虫。</li>
	<li>ネック ジョイントの頭を削除します。 注: これにより、触角のディスクが、失われないだろうことをこの段階では主に脳の視葉に接続しています。</li>
	<li>脳と成虫ディスク組織を鉗子または 20 μ L ピペットを使用して PBS 液滴 x 別 1 に転送します。</li>
	<li>視葉で脳に接続された目触角のディスクを識別します。鉗子を使用して、脳と蛹のケースから目触角を外します。鉗子または 20 μ L ピペットを使用して PBS 液滴 x 新しい 1 に転送します。 注: 前の目触角ディスク、フラット組織です。ただし、8 h 蛹目ディスクは回転カッピング触角ディスク中央の脳の前方に座っています。</li>
	<li>鉗子を使用すると、目と触角のディスク間の接続のサイトでティッシュをカットします。20 μ L ピペットを使用して、優しく RNA 分離液試薬に切り裂かれたティッシュを転送します。できるだけ小さく量をピペットで転送される液体の量を最小限に抑えます。</li>
	<li>この操作を繰り返して、すべての蛹を解剖しました。</li>
</ol>4.ショージョーバエ ・半ば-蛹とアダルト アンテナの郭清
注: 40 h APF、変容の大部分が完了し、大人の構造、明らかになっているが、まだ白と目立たない。この発達の時点でアダルト アンテナその最終的な形をとっているけれどもまだ透明には、嗅覚受容体の少数を除いて、大半が式を開始していません。
<ol><li>蛹の触角の解剖の手順 1 で説明したように 50-100 の前蛹を収集し、25 ° C で 40 h の年齢</li>
	<li>ピペット 150 μ L の RNA 分離ソリューションに RNase フリー 1.5 mL 遠心チューブ 200 μ L ピペットを使用して、チューブを氷の場所します。</li>
	<li>郭清パッド PBS 滴 x 1 の 1 つに切り裂かれる蛹を配置します。体を安定させるために片方の手で鉗子を使用します。鉗子を使用すると、もう一方の手で、体を取り巻く膜袋内のヘッドを公開、蛹の最も前の四半期から蛹のケースを慎重にはがし。</li>
	<li>鉗子のセットが付いているボディを押し、鉗子の別のセットを持つ共同首で頭をリッピング蛹の体の残りの部分から頭を切って鉗子を使用して、慎重に。優しく鉗子を使用して PBS 液滴 x 別 1 に頭を転送します。上下のピペット ヘッド開発ショウジョウバエの頭部を囲む明確な膜を取得する (脳、等) の内容をきれいにします。 注: 40-50 h で APF、アンテナ膜の前方のセクションに接続しています。ピペッティングで頭の内容が消去されるとき、彼らは郭清の明白になります。</li>
	<li>鉗子を使用して、膜から蛹のアンテナを外します。3 からアンテナの 2ndセグメントを切断rd 3rdのセグメントだけが嗅覚受容ニューロンの家として区域の共同でスライスに鉗子を使用します。</li>
	<li>20 μ L ピペットを使用して、優しく RNA 分離液試薬に切り裂かれたティッシュを転送します。できるだけ小さく量をピペットで転送される液体の量を最小限に抑えます。この操作を繰り返して、すべての蛹を解剖しました。</li>
	<li>大人の触角解剖の約 50 大人を収集し、一週間後羽化の年齢します。 注: 嗅覚受容体遺伝子の発現と他の遺伝子はピーク羽化後一週間です。大人生体関連遺伝子検出のしきい値を超えて上昇する低豊富の成績証明書を確保するため一週間熟成します。</li>
	<li>RNA の抽出、CO2パッドの上まだ生きている間ハエを解剖します。RNase 阻害剤と CO2パッドを扱います。共焦点レーザー顕微鏡の解剖 1 × PBS または PBS + 0.2% で解剖パッドに乗って飛ぶトリトン。</li>
	<li>郭清範囲の下で CO2駅パッド上で寝る大人はまず、置きます。CO2駅パッドは、体を安定させるために片方の手で鉗子を使用して 2 番目から 3 番目の触角セグメントを優しくプル/ピンチにもう一方の手で鉗子を使用します。</li>
	<li>液体に直接アンテナを配置する鉗子を使用して RNA 分離ソリューションにアンテナを移します。この操作を繰り返して、すべての大人を解剖しました。 注: は、アンテナが RNA の分離ソリューションに沈んでいることを確認します。アンテナは、チューブの側面に残ることがあります。これは、rna の増加低下を RNA の品質と量を減らすことが生じます。</li>
	<li>直接 RNA の抽出に進むか、長期保存のための-80 ° c チューブを配置します。</li>
</ol>5 切り裂かれたティッシュから RNA の隔離
<ol><li>-80 ° C の記憶域からすべてのサンプルを削除し、氷の上にそれらを解凍します。</li>
	<li>簡単にスピン (5-6 s, ~ 6,000 x g) 各サンプル チューブの下部に資料の収集をします。</li>
	<li>10 のオートクレーブ養生プラスチック杵と電気モーターを使用して各サンプルを挽く氷上 s。</li>
	<li>5.2 と 5.3 の 4 の手順を繰り返します。</li>
	<li>市販のキットを使用して、次の最適な収率の製造元のプロトコル、RNA の抽出を実行します。</li>
	<li>市販試薬、遺伝子興味のそして次の製造元のプロトコルに対して特異的プライマーを用いた qRT PCR を実行します。<ol>
<li>次の条件を使用してすべての PCR 反応を行う: 95 ° C 10 分の変性に続いて 40 サイクル 95 ° C の 15 s、55 ° C、30 s、および 30 ° C、60 s。 注:ディップとdprの遺伝子のプライマーは、表 1に記載されて、嗅覚受容体遺伝子のプライマーは、Hueston CEらに表示されます。8。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 蛹触角ディスクと免疫組織化学のアンテナの固定
注: は、10-20 個人、組織、時間の同じ量の修正の確認からバッチで組織を修正します。サンプルは、組織の完全性を最大化する定着剤にそれらを転送する前に PBT (洗剤で PBS) で滞在時間の量を最小限に抑えます。
<ol><li>収集切り裂かれた触角ディスクまたは 0.2% の 200 μ L を含む 200 μ L の PCR チューブに蛹のアンテナ PBT 氷の上、組織の整合性を維持し、200 μ L の PCR の壁に付着してからサンプルを避けるためには不完全な固定につながる管します。 注: 蛹触角と触角ディスクかなり半透明を参照してくださいすることは困難にすることができます。組織の損失を防ぐためにすべての洗浄のステップの郭清範囲を使用することをお勧めします。また、96-well テラサキ プレート固定用に使用されると最適組織に管理する染色があります。</li>
	<li>4% の約 200 μ L で蛹から解剖の触角と触角のサンプルを修正 PFA (パラホルムアルデヒド) 室温で 30 分間。これおよびそれに続く手順は正しくソリューションのサンプルを混ぜて nutator にサンプル チューブを維持します。6.7 のステップに進みます。</li>
	<li>アダルト アンテナ頭全体をまず解剖 4% の約 200 μ L でそれを修正、PFA (パラホルムアルデヒド) 室温で 1 時間。</li>
	<li>0.2% の 200 μ L で 3 x を洗って 10 分 PBT です。孵化の間に、nutator のサンプルを保ちます。</li>
	<li>固定ヘッドからの第 2 触角セグメントの細かい解剖の解剖顕微鏡へ戻る。頭を安定させる、2 番目から 3 番目の触角セグメントを優しくプル/ピンチに鉗子を使用してください。</li>
	<li>4% の約 200 μ L に切り裂かれた第 3 触角セグメントを移す PFA (パラホルムアルデヒド) し、室温で 30 分間それらを修正します。</li>
	<li>0.2% の 200 μ L で 3 x を洗って 10 分 PBT です。孵化の間に、nutator のサンプルを保ちます。</li>
	<li>4 ° C で試料を保存か全体マウント免疫組織化学的に直接進みます。 注: 抗体が使用されていると、染色の効率が変わります。このメソッドは、以下の豊富なタンパク質タグの適切なまたは弱い抗体をする必要があります。しかし、時に、それは (アイデンティティまたは固定液の量や固定の時間) プロトコルの最適化を必要があります。</li>
</ol>

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</ol>

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この議定書は遺伝子と転写プログラム開発ショウジョウバエ嗅覚組織だけでなく、これらのプログラムの比較分析ショウジョウバエで動作を識別するのに興味を持って実験室のための有用なリソース種。それは、将来の研究のためのプライマーとしてさまざまな発達段階からシステム レベルの転写プロファイルが必要な場合に便利です。ここで説明されているプロトコルはステージし、分化される前のパターンから嗅覚システムの開発の 4 つの主要段階からサンプルを取得するショウジョウバエの嗅覚組織の開発を分離する方法を示します分子および免疫組織学的研究.ショウジョウバエの解剖触角ディスクとさまざまな蛹段階でアンテナは定量的 RT-PCR による RNA シーケンスによるシステム レベルまたは個々 の遺伝子レベルでの嗅覚系開発時の遺伝子発現プロファイルを識別する使用できます。サンプルは、体内の組織特異的遺伝子発現のパターンを識別する免疫組織および上皮内交配のため使用できます。このプロトコルの追加の利点は、解離の標準的な方法を使用して、FAC 並べ替えなど、セル型固有の分子分...

発達神経生物学、システム神経科学、神経生理学、行動学、行動の進化1,2,3、ショウジョウバエの嗅覚システムは広く使用されているシステム 4。ショウジョウバエ嗅覚組織の水力発電と熱感覚ニューロン1,5,6に加えて揮発性化学手掛かりを検出嗅覚受容神経細胞 (ORNs) 家します。この原稿の全体的な目標は、ステージおよびショウジョウバエ種の蛹と大人の嗅覚組織の開発を分析する方法を示すことです。この技術のための理論的根拠は体内組織ラベリング技術にさらに RNAseq、定量的 RT-PCR など、周辺の嗅覚システムの分子・発達的分析に蛹の段階からサンプルを生成するには.この手法は、特定型のセルのすべての遺伝子導入試薬を持っていない非キイロショウジョウバエ ショウジョウバエの種から開発大人嗅覚システムの転写プロファイルのダイナミクスを識別する特に役立ちますラベリングと分析。本稿では、触角のディスクと蛹と大人のショウジョウバエ種からアンテナを分析する方法を示します。まず、ショウジョウバエの蛹殻形成過程 (APF、白い蛹や前蛹) 発達のステージングと種特異的な高齢化のための 0 h を識別する方法を示します。次に、触角ディスクと 3 番目の触角セグメントを分析する方法を示す具体的には、目のディスクと RNAseq または RT-Pcr に必要な組織の純度の第 2 触角セグメントからそれらを分離する方法。キイロショウジョウバエ約このプロトコルで記述されている段階対応済みパターンの触角 (前蛹)、前駆体、触角からの選択ディスク (8 h APF) ORNs (40 h APF) の分化の開始とアダルト アンテナ。メソッドを使用して分離された大人アンテナからと生体内での免疫組織化学の最後に、我々 は、定量的 RT-PCR 法の例を与えます。このメソッドは、RNA ・ DNA 分析、ショウジョウバエ種から末梢の嗅覚組織の開発に免疫組織化学のサンプルを生成する使用できます。

<table><tbody><tr><td>10X リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>RNase 遊離水</td></tr><tr><td>CO2 タンク</td><td>エアガス</td><td>CD R200</td><td></td></tr><tr><td>2 つの鋭い鉗子 (Dumont #55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA Isolation solutions</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>氷<td></td><td></td><td></td><td>が入った小さなバケツ</td></tr><tr><td>P20およびP200マイクロピペットとチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7mLマイクロフュージチューブ</td><td></td><td></td><td>最良の結果を得るためにヌクレアーゼフリーを購入</td></tr><tr><td>0.2mL PCRチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド粉末</td><td>ポリサイエンス</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>10% トリトンX-100</td><td>テクノバ</td><td>T1105</td><td>1X PBS</td></tr><tr><td>2インチペトリ皿</td><td></td><td></td><td></td></tr>55mm濾紙で0.2%v/vに希釈します <tr><td></td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>水で濡らし、ペトリ皿に入れて蛹を湿らせます</td></tr><tr><td>25 Cインキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr>脱<tr><td>イオンH2O</td><td></td><td></td><td>ヌクレアーゼフリーを購入するか、DEPC</td></tr><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td></td><td>で処理しますテリザキのプレートカバーから解剖パッドを作るのに使用します。</td></tr><tr><td>蓋付きMicroWellミニトレイ</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td>蓋は、シリコーン解剖パッドを作るために使用することができます</td></tr><tr><td>ウサギ抗GFP抗体</td><td>MBL国際企業</td><td>PM005</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>マウス 抗RAT CD2</td><td>AbD seroTec</td><td>MCA154RHDL</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>ADL195(抗ラミン、マウス)</td><td>Dev研究 hydoma ban</td><td>ADL195-s</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>アレクサフロー&reg;488 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>invitrogen</td><td>A11008</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>Cy3 ヤギ抗マウス IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-166-003</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>Triton X-100、タンパク質グレード界面活性剤、10% 溶液、滅菌ろ過</td>済み <td>CALBIOCHEM</td><td>648463</td><td>界面活性剤</td></tr><tr><td>ラボ ローテーター</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td>ローテーター</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーウォーター</td><td>Growcells.com</td><td>NUPW-0125</td><td>水</td></tr><tr><td>用軽量ティッシュワイパー</td><td>VWR</td><td>82003-822</td><td>洗浄解剖用品</td></tr><tr><td>上付き文字II</td><td>invitrogen</td><td>18064014</td><td>逆転写酵素&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAshredder (50)</td><td>RNA抽出</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td></tr><tr><td>Oligo(dT)12-18 Primer</td><td>RT</td><td>life technologies</td><td>18418012</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)RNA</td> <td>extraction</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td></tr><tr><td>FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>04913850001</td></tr><tr><td>FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER&nbsp;</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td></td></tr><tr><td>06402712001 LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>04729692001</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix</td><td>qPCR</td><td>NEB</td><td>M0541S</td></tr></tbody></table>

周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

ショウジョウバエの嗅覚は発達神経生物学、システム神経科学、神経生理学、行動、行動の進化で広く使われているシステムです。ショウジョウバエ嗅覚組織の水力発電と熱感覚ニューロンに加え揮発性化学手掛かりを検出嗅覚受容神経細胞 (ORNs) 家します。このプロトコルでは大人のショウジョウバエ種の嗅覚の末梢組織の開発の解剖について述べる。最初にステージングして、半ば蛹と大人からアンテナの解剖によって続いて蛹初期から続く、触角の解剖によってショウジョウバエ幼虫の年齢方法について述べる。我々 も準備を qRT PCR、RNAseq、または免疫組織化学の RNA の抽出など、分子生物学の手法で活用できるメソッドに示します。これらのメソッドは、種特異的な蛹の発育度の決定、および適切な高齢化の各段階の計算後、他のショウジョウバエの種に適用もできます。

切り裂かれた発展途上の嗅覚組織遺伝子発現を評価する RT-PCR による RNA 抽出の使用ことができますまたはその表現パターンとの遺伝子の細胞内の局在を決定する免疫プロトコルによって取ることができます。関心します。このセクションのいずれかのプロトコルからの代表的な結果を提案する.図 1は、代表定量的 RT-PCR 野生型アダルト アンテナの細胞表面受容体と嗅覚受容体遺伝子の転写を示します。図 2は、6-8 h と Rn EGFP トランスジェニックに 12 h APF の触角染色ハエを使用して抗 GFP (1: 1000) と反ラミン抗体 (1: 100) (図 2Aおよび2 b)。Rn EGFP 蛹初期触角ディスク内の特定領域にラベルを付けます。40 h APF 蛹触角抗 GFP 抗体染色Or67d GAL4 UA ...

ここでは、ステージし、解剖ショウジョウバエ種から嗅覚の組織を開発するためのプロトコルを提案する.解剖組織は、免疫組織化学または上皮内などの生体内解析だけでなく、定量的 RT-PCR (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応) や RNA 配列 (RNAseq) などの分子生物学的解析の後で使用できます。交配。

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

ショウジョウバエ種における発育中の瞳孔および成体の末梢嗅組織を病期分類および解剖する全体的な目標は、末梢嗅組織の分子的および発達的分析のためのサンプルを生成することです。この方法は、嗅覚系の発生および進化分野における重要な疑問、例えば、発生中の末梢嗅組織における特定の遺伝子の発現動態レベルおよびパターンなどに答えるのに役立ちます。この方法により、ショウジョウバエ種における末梢嗅覚系の発達過程についての洞察を得ることができます。また、末梢味覚系や視覚系などの他の感覚系にも適用できます。RNAシーケンシング実験では、100〜200個のアンテナディスクまたはアンテナを4つの異なる発生段階に収集することを計画します。免疫組織化学では、10〜20匹のハエを解剖する計画を立てます。解剖に関与するすべての材料を70%エタノールを使用して洗浄します。次に、RNase中和剤で材料をさらに洗浄します。また、すべての溶液はヌクレアーゼフリーまたはDEPC処理水を使用して製造します。蛹を収集するには、30分間隔で幼虫を監視します。そして、ゼロアワーAPF蛹段階で蛹を集めます。幼虫は動かず、非常に明るく、ほぼ白い色の蛹のケースに囲まれます。この段階で、幼虫を湿った濾紙で小さな2インチのペトリ皿に移します。ゼロ時間APFステージ解剖の場合は、すぐに蛹前触角椎間板の採取に進みます。それ以外の場合は、皿をパラフィンフィルムで覆い、動物が関心のある発達段階になるまで、摂氏25度で成長させます。他のショウジョウバエ種の蛹の発育を段階的に行うには、0時間の蛹前の幼虫を収集し、それらを新鮮なバイアルに選別します。次に、蛹になるまでの日数を記録します。そして、今回は単にメラノガスターのタイムラインにスケーリングします。まず、RNaseフリーの1.5mmチューブで150マイクロリットルのRNA分離溶液を冷却します。次に、解剖パッド上にPBSのいくつかの別々の液滴を沈着させます。PBSの各滴に、解剖する1匹の蛹を置きます。0〜2時間の蛹の場合は、鉗子を使用してマウスフックをつかみ、これらの構造を引っ張って脳と想像上の椎間板を引き裂いて露出させます。8時間の蛹の場合、最初に蛹の最も前方の四分の一から蛹のケースをそっと剥がし、発育中の頭を露出させます。次に、首の関節で頭を外します。触角円盤は、発達のこの段階では頭の中にあります。次に、触角椎間板を含む組織をPBSの別の液滴に移します。次に、視葉で脳に接続されている眼触角椎間板を特定します。鉗子を使用して、眼触角椎間板を外し、新しい液滴に移します。8時間の蛹では、目の椎間板が触角の椎間板をカップに入れ、両方とも脳の前方にあります。次の液滴で、鉗子を使用して目と触角椎間板を分割します。次に、P20ピペットチップを使用して、解剖した組織を最小限の液体で静かに収集します。椎間板をRNA単離溶液試薬に沈着させ、少なくとも100個が収集されるまで触角椎間板の解剖を続けます。蛹形成後40時間で、成虫のアンテナは最終的な形をしていますが、まだ透明です。この段階では、RNA配列の収集には少なくとも50個の蛹が必要です。まず、150マイクロリットルのチルドRNA単離溶液を調製します。解剖パッドで、蛹をPBSの液滴に入れます。次に、1対の鉗子で体を安定させ、最も前方の四分の一から蛹のケースをそっと剥がして頭を露出させます。次に、首の関節で頭を慎重に取り外します。次に、ヘッドをPBSのきれいな液滴にそっと移します。そこでヘッドを囲む膜を取り除くために、PBSでヘッドを上下にピペッティングします。このクリーニングにより、アンテナが見えるようになります。次に、セグメントジョイントの2番目と3番目のセグメントの間のメンブレンからアンテナを外します。第3のセグメントには、触角嗅覚受容体が含まれています。次に、ピペットを使用して、解剖した組織をRNA単離溶液に穏やかに移し、移動する液体の量を最小限に抑えます。RNA抽出には、CO2パッドで麻酔をかけた成体を解剖します。まず、CO2パッドと鉗子をRNase阻害剤で処理します。次に、成虫に麻酔をかけ、解剖顕微鏡でパッドを観察します。2対の鉗子を使用して体を安定させ、2番目の触角セグメントから3番目の触角セグメントをそっと引き出すかつまんで組織を収集します。鉗子を液体に浸して離すことにより、アンテナをRNA分離溶液のチューブに移します。アンテナは水没させる必要があります。アンテナが側壁にくっついていると、RNAは早期に分解されます。十分なアンテナを採取したら、RNAの抽出を進めます。または、収集チューブを摂氏80度で無期限に保管してください。アンテナが免疫組織化学を目的としている場合は、フライをPBSに沈めた状態で、Tritonの有無にかかわらず、この解剖パッドでこの解剖を行います。解剖された発生中の嗅覚組織は、RNA抽出に使用でき、続いてRT-PCRを使用して遺伝子発現を評価することができます。例えば、表面受容体転写産物および嗅受容体転写産物の発現は、この方法で研究することができる。あるいは、この組織を免疫組織化学に使用して、目的の遺伝子の発現パターンと細胞内局在を決定することもできます。例えば、Rn-EGFPトランスジェニックフライは、抗GFP抗体および抗ラミニン抗体で染色することができます。この解析では、蛹形成後40時間で、Or67d遺伝子がアンテナ内の特定の細胞で活性化し、GAL4-UASシステム下でのGFPの発現を促進することが明らかになった。一度マスターすれば、適切に行えば1時間で解剖を行うことができます。この手順を試行する間は、各ショウジョウバエ種の蛹の発育期間に基づいて、時間と適切にスケジュールされたピッキング、老化、解剖を忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、qRT-PCR、免疫組織化学などの他の方法、およびその他のin vivo染色および転写プロファイリング技術を実行して、発生中の組織内のシステムレベルでの転写のパターンとプロファイルに関する追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、感覚系の進化と発達の分野の研究者が、ショウジョウバエ種の他の感覚系における転写ダイナミクスと新規遺伝子発見を探求するための道を開くでしょう。鋭利な鉗子、一部のRNA抽出溶液、ホルムアルデヒドを使用した作業は非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行する際には、細かい運動能力、高い注意力、適切な実験服の着用を発達させるために、解剖の事前の実践などの予防策を常に講じる必要があります。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

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