代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

この方法は、選択的プレmRNAスプライシングの分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。具体的には、組織スライス中の選択的スプライシングパターンをin situで調べるための堅牢で高感度なアッセイシステムを提供します。この方法により、マウスの脳などの複雑な生物学的構造に含まれる多くのサブタイプで、選択的スプライシングを同時に分析できます。

この技術の主な利点は、mRNAの衝撃型帯電防止エクソンジャンクションプローブをin situハイブリダイゼーションして、アイソフォーム特異的ハイブリダイゼーションシグナルを生成することです。ビル信号増幅技術により、検出感度が向上し、堅牢なハイブリダイゼーション信号が得られます。検出されたシグナルは、マウス脳のさまざまな解剖学的領域におけるバイタルのスプライスの割合を計算するために使用される特定のプローブから逃げるエクソン封入体でした。

この研究では、NF1エクソン23aを例として、アッセイシステムの使用を説明するために使用されます。しかし、このシステムは、多くの代替エクソンの発現パターンの解析に適合させることができます。マウス脳切片Dのパラフィン化を開始するには、2つの洗濯皿に250ミリリットルのキシレンを入れます。

そして、ヒュームフード内に250ミリリットルの100%エタノールが入った別の2つ。ティッシュスライドを洗濯ラックに挿入します。次に、キシレン入りディッシュに洗濯ラックを入れ、ラックを少なくとも3回上下に動かしながら5分間インキュベートし、2番目のキシレンディッシュで繰り返します。

次に、ラックをエタノール入りディッシュに入れ、同じ上下の動きで2分間インキュベートし、次に2番目のエタノールディッシュで繰り返します。スライドを乾燥させるには、2番目のエタノール皿からラックを移動し、摂氏60度のインキュベーター内に5分間置きます。疎水性バリアペンを使用して、ティッシュセクションの周りに0.75インチ×0.75インチのバリアを描き、室温で3分間風乾します。

ハイブリダイゼーションオーブンの電源を入れ、温度を摂氏40度に設定します。加湿紙を蒸留水で完全に濡らした後、湿度調整トレイに置きます。次に、湿度制御トレイをハイブリダイゼーションオーブンに挿入します。

乾燥させたスライドをベンチに置いた後、各スライドの組織切片を5〜8滴の過酸化水素溶液で完全に覆います。室温で10分間インキュベートします。吸収紙にスライドを1枚ずつ叩いて過酸化水素溶液を取り出し、スライドを洗浄ラックに挿入します。

水を入れた洗濯皿にラックを浸し、上下に3〜5回動かしてスライドを洗います。ホットプレート上に置かれた1リットルのガラスビーカーに700ミリリットルの1Xターゲット除去処理を充填し、ホイルで覆います。ホイルカバーに温度計を挿入し、ホットプレートの電源を入れ、高温に10〜15分間設定します。

回収試薬の温度が98°Cに達したら、ホットプレートを低温にして穏やかな沸騰状態を保ちます。次に、ホイルを慎重に取り外し、ラックをビーカーの中に置きます。ビーカーをホイルで覆い、15分間インキュベートします。

鉗子を使用して、ラックをビーカーから200ミリリットルの蒸留水が入った洗浄皿に移し、15秒間インキュベートします。15秒後、ラックを100%エタノールを含む洗浄皿に入れ、3分間インキュベートします。ラックを皿から取り出し、摂氏60度で10分間乾かします。

スライドをステインラックに置いた後、スライドごとに5滴のプロテアーゼ3で組織切片を覆います。ラックを湿度制御トレイに慎重に置き、トレイをハイブリダイゼーションオーブンに挿入し、摂氏40度で30分間インキュベートします。ラックをトレイから取り外した後、スライドをタップして余分な液体を取り除き、洗浄ラックに挿入します。

蒸留水を入れた洗浄皿にラックを置き、ラックを上下に3〜5回動かしてスライドを洗います。in situハイブリダイゼーションの準備として、プローブとAMP試薬を室温で30分間インキュベートします。湿度制御トレイをハイブリダイゼーションオーブンに挿入し、摂氏40度に設定します。

プローブハイブリダイゼーションの場合は、スライドを洗浄ラックから取り外し、軽くたたいて余分な液体を取り除きます。スライドをステインラックに置きます。鉛筆を使用して、スライドにプローブ名のラベルを付けます。

隣接して切断された3つの脳組織スライドを配置し、3つの異なる神経線維有糸分裂タイプ1プローブとハイブリダイズします。アイソフォーム特異的プローブは非常に異なるため、隣接して切断された組織切片を使用します。これらの切片をハイブリダイゼーション、増幅、およびシグナル検出のステップでまったく同じように扱うことは、計算におけるパーセンテージスプライスの精度を確保するために重要です。

切片の乾燥を防ぐために、切片ごとに一度に1枚のスライドで、組織切片を4滴のプローブで覆います。次に、ステインラックを湿度制御トレイに置き、摂氏40度のオーブンに2時間挿入します。次に、200ミリリットルの1Xウォッシュバッファーで満たされた洗濯皿にウォッシングラックを置きます。

次に、ペーパータオルで各スライドを一度に1つずつ軽くたたいて、余分な液体を取り除きます。そしてすぐに各スライドを洗濯ラックに挿入します。新鮮な洗浄バッファーを充填した皿で室温で2分間インキュベートし、ラックを3〜5回上下に動かし、新しい皿で洗浄を繰り返します。

シグナル増幅のためには、各スライドをタップして余分な洗浄バッファーを取り除き、ステインラックに置きます。各スライドの組織切片をAMPゼロ試薬4滴で覆います。次に、ラックを湿度制御トレイに置き、トレイをオーブンに挿入し、摂氏40度で30分間インキュベートします。

この実験で以前に行ったように、スライドを洗浄バッファーで2回洗浄します。テキストプロトコルで説明されているように、AMP試薬1〜6でシグナル増幅ステップを繰り返し、各ステップの後にスライドを洗浄します。シグナル検出のために、スライドから余分な洗浄バッファーを軽くたたいて取り除き、ステインラックに置きます。

次に、2マイクロリットルの高速赤色Bと120マイクロリットルの高速赤色Aをマイクロ遠心チューブに混合します。各スライドの組織切片に溶液を添加して、それらを完全に覆います。ステインラックを調湿トレイに置き、トレイに蓋をして室温で10分間インキュベー

次に、溶液を取り出し、スライドを洗浄ラックに挿入します。水道水が入った洗濯皿にラックを置いてスライドを洗い、洗濯を繰り返します。2回目の洗濯後、吸収紙を軽くたたいて余分な水分を取り除きます。

次に、50%ヘマトキシリン染色溶液が入った皿にラックを置きます。ラックを数回上下に動かします。そして、室温で2分間インキュベートします。

水道水が入った洗濯皿にラックを移します。ラックを5回上下に動かし、スライドが透明になるまで洗浄を繰り返しますが、ティッシュ切片は紫色のままです。次に、ラックを0.02%のアンモニア水が入った皿に移します。

ラックを上下に 2 回から 4 回動かして、セクションが青色に変わります。汚れた皿でスライドを水道水で3〜5回洗います。次に、ラックをインキュベーター内に置き、摂氏60度で15分間インキュベートしてスライドを乾燥させます。

完全に乾いたら、各スライドに封入剤を1滴加えてスライスを覆います。次に、24 x 50 mmのカバースリップを各スライドの組織切片に慎重に置きます。スライドを室温で30分間風乾した後、データ収集を進めます。

エクソン23aのスプライシング率またはPSI値を計算するために、皮質の3つのサブ領域の細胞とドットの数、および海馬CA3がカウントされます。RNAin situハイブリダイゼーションアッセイは、3つの異なるNF1特異的プローブを使用して、CD1野生型マウスの脳切片で実施されます。皮質と海馬のセクションで観察された赤い点状のドットは、NF1合計、包含特異的、およびスキップ特異的プローブによる正の信号を示しています。

次に、3つのプローブからのISH信号がカウントされ、PSIの計算に使用されます。RNAin situハイブリダイゼーションアッセイは、エクソン23aがすべての細胞タイプに含まれるC57ブラック6J野生型マウスおよびC57ブラック6J変異マウスの皮質で実施されます。C57黒色6J野生型マウスの皮質で観察された赤い点状点は、NF1トータル、介在物特異的、およびスキップ特異的プローブによる正のシグナルを示しています。

C57 black 6J変異マウスでは、NF1トータルプローブおよびインクルージョン特異的プローブによって同様のシグナルが得られます。しかし、スキップ特異的プローブを使用した場合、シグナルは検出されず、エクソンインクルージョンまたはスキップを標的とする2つのプローブが非常に特異的であることを示しています。この手順では、同じ組織スライド上のマルチカラーラベリングはまだ利用できないため、異なる組織スライドで異なるプローブが使用されます。

正確なスプライシング率の値を得るには、この手順全体で、隣接するカットスライドを使用し、スライドをまったく同じ方法で処理することが重要です。この手順を補完するのは、免疫組織化学のような手段であり、差次的に発現するスプライシングアイソフォームの局在と機能に関する追加の質問に答えるために実行できます。