Name: 代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶマウス脳切片における代替プレmRNAスプライシングのin situハイブリダイゼーション法。ショックアンチスタティックエクソンジャンクションプローブと信号増幅技術を用いて、スプライシングパターンを高感度に検出し、神経組織における選択的スプライシング機構を解明する。

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この作品は、アメリカの心臓協会 [HL を費 0365274B] によって支えられた国立がん研究所 [Z.W. に GI 胞子 P50CA150964] 国立衛生研究 [オフィスの研究インフラ共有計装グラント S10RR031845 にケース ウエスタン リザーブ大学の施設をイメージング、光学顕微鏡 】、【 名大 】 を中国奨学金理事会。 著者は彼の助けの光顕微鏡イメージング コア スライドのスキャニングとリチャード ・ リーをありがとうございます。

すべての実験では、マウスを含むここに記載は、ケース ウエスタン リザーブ大学機関動物のケアおよび使用委員会によって承認されています。2016-0068 プロトコルのタイトル (PI: 華楼) は、「代替の Pre-mrna スプライシング脊椎動物の発生での役割」.
注意: 装置、試薬およびこのプロトコルで使用される供給のすべての情報は、テーブルの材料に含まれます。
1. ホルマリン固定パラフィン埋め込まれたセクション (FFPE)
<ol><li>
頚部転位によって 1 の CD1 のマウスと 1 c57bl/6 j マウスを安楽死させます。慎重にカット オープン外科はさみ鉗子とスカル。スコップで脳を削除します。 注: 1 歳 5 か月 CD1 雄マウス 3 ヶ c57bl/6 j マウス使用し、同様の結果を示した。<ol>
<li>PBS で脳を洗います。ホルマリン溶液 50 mL に脳全体を置くことによって常温 (RT) 10% ホルマリンを含む溶液で 30 h の脳全体を固定します。</li>
		<li>定着液を PBS に変更し、4 ° C で一晩 PBS で脳を孵化させなさい脱水、キシレンやパラフィン標準手順18を使用して脳を埋め込みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ミクロトームを使用して、5 μ m のセクションに埋め込まれた組織をカットします。最初のそして、リボンを広めるため 45 ° C の水浴中 RT の水浴のパラフィン リボンを置きます。
	<ol>
<li>しわや折り目にリボンが消えて、すぐにスライド ガラスのセクションをマウントします。使用する前に 60 ° C で 1 時間焼く RT。 スライドで一晩乾燥スライドを空気します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 試料の前処理
<ol><li>
組織切片を deparaffinize します。発煙のフードで次の手順を実行します。
	<ol>
<li>新鮮なキシレン、250 ml の 100% エタノールの 2 つの 250 の mL で 2 皿洗い (図 1 a) を入力します。次の表 1に示されている順序とインキュベーション時間皿洗いの洗濯ラック洗濯ラック (図 1 a)、場所に組織スライドを挿入します。</li>
		<li>各孵卵中リフト洗濯ラックを上下 3 回以上洗濯皿に。各インキュベーション後すぐに組織切片の乾燥を防ぐために次の洗濯料理に洗濯ラックを移動します。</li>
		<li>インキュベーションの手順を完了した後洗浄皿からスライド洗濯ラックを削除します。スライドが完全に乾くまで、5 分または 60 ° C のインキュベーターでラックを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>疎水性障壁ペンでティッシュ セクションを囲む 0.75 'x 0.75' 障壁を描画します。空気乾燥室温 3 分のための障壁</li>
	<li>
スライスを前処理します。
	<ol>
<li>試薬と機器を準備します。<ol>
<li>ハイブリダイゼーション オーブン (図 1 b) をオンにし、温度を 40 ° C 使用前に 30 分に設定します。</li>
			<li>蒸留水と加湿の紙 (図 1E) を完全に濡れているし、湿度コントロール トレイ (図 1、左)。ハイブリダイゼーション オーブンで湿度コントロール トレイをおいてください。</li>
			<li>10 x ターゲット検索試薬の 70 mL に dH2O の 630 mL を追加して新鮮な 1 x ターゲット検索試薬の 700 mL を準備します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>過酸化水素を適用します。<ol>
<li>Deparaffinized のスライドをベンチに置きます。組織を完全にカバーするセクションに過酸化水素 5-8 滴を追加します。室温 10 分間インキュベートします。</li>
			<li>過酸化水素のソリューションは、一度に 1 つのスライドを削除する吸収紙の上のスライドをタップします。すぐに洗濯ラックにスライドを挿入して dH2o. でいっぱい洗濯料理にラックを移動</li>
			<li>用蒸留水でラックを上下に移動することによって、スライドを洗って 3-5 回。新鮮な水と洗浄スライド 1 つより多くの時間をいっぱい洗濯料理に洗濯ラックを移動します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ターゲットの検索を実行します。<ol>
<li>ホット プレートに 1,000 mL ガラス製ビーカーを置きます。ビーカーに新鮮な 1 x ターゲット検索試薬の 700 mL を追加し、箔でカバーします。フォイル カバー (図 1) をビーカーに温度計を挿入します。ホット プレートをオンにし、10-15 分のために高い設定します。</li>
			<li>検索試薬の温度 98 ° C に達すると、穏やかな沸騰を維持するために低高からホット プレートの温度制御を切り替えます。15 分以上沸騰していません。</li>
			<li>一方、慎重に箔を開くし、検索リージェント内のスライスを洗濯ラックを置きます。ビーカーを再びふたをして 15 分間インキュベートします。</li>
			<li>DH2O および 15 のリンス 200 mL でいっぱい洗濯料理にビーカーからラックを削除する使用鉗子 s。</li>
			<li>100% 新鮮なエタノールを含んでいる洗浄皿にラックを移動し、3 分のスライドを削除し、10 分の 60 ° C の定温器に乾燥するために座らせてください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>プロテアーゼ III を適用します。<ol>
<li>染色ラック (図 1右) にスライドを配置します。組織を被覆するプロテアーゼ III の 5 滴を追加します。慎重に湿度コントロール トレイ (図 1、左) でラックを置くし、40 ° C ハイブリダイゼーション オーブン トレイに挿入します。30 分間インキュベートします。</li>
			<li>スライド ラックを取り外し、トレイにオーブンに戻します。余分な液体は、一度に 1 つのスライドを削除するスライドをタップします。洗濯ラックにスライドを挿入、洗浄皿のラックの場所に満ちて dH2O. 移動ラックを上下のスライドを洗うが 3-5 回。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. っぽいアッセイ
<ol><li>
材料を準備します。
	<ol>
<li>あらかじめ 20 分ミックス 2.94 L dH2O および 50 の 60 mL の洗浄バッファー洗浄バッファー x 1 x 40 の ° C の定温器の洗浄バッファー x 50 を温めます。</li>
		<li>100 mL コンテナーでも dH21 N 水酸化アンモニウムの 1.43 mL を 250 mL の dH2o ・ ミックスに追加することによって O. 準備 0.02% (w/v) アンモニア水 100 mL にギルのヘマトキシリンを追加することによって 50% ヘマトキシリン染色液を準備します。</li>
		<li>プローブを入れて、アンプ 0-6 RT 30 分使用前に試薬。40 ° C ハイブリダイゼーション オーブンで湿度コントロール トレイをおいてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
っぽいの手順 注: アイソ フォーム選択的スプライシングNf1の式を調べて、エクソン 23 a、エクソン 23 a 付属のアイソ フォームを対象とする 3 つの異なるっぽいプローブの値を (PSI) 融着接続パーセントを計算するには、エクソン 23a 除外アイソ フォームまたは両方のアイソ フォームは、使用される (図 2).プローブは、隣接してカットするティッシュ セクションで使用されます。計算の正確さを保つ 3 つの切片が扱われることが重要です交配、増幅および信号の検出手順で同じ。<ol>
<li>プローブの交配。<ol>
<li>洗濯ラックからスライドを削除し、スライドから余分な液体をタップします。染色ラックにスライドを配置します。</li>
			<li>プローブ名とスライドのラベルに鉛筆を使用します。一緒に 3 つの異なる Nf1 のプローブ (図 2) と交配させるための 3 つの隣接してカット脳組織スライドを置きます。スライドの同じ順序の以降の手順を実行します。</li>
			<li>組織を被覆するプローブの 4 滴を追加します。セクションが乾くを防ぐために同時にこの 1 つのスライドを行います。湿度コントロール トレイに染色ラックを置き、2 h の 40 ° C のオーブンにそれを挿入します。</li>
			<li>スライドを洗浄バッファーで 2 回洗浄します。各洗浄のための洗浄バッファー × 1 200 mL で染色の皿を満たしし、洗濯ラックを配置します。同時に紙タオル 1 枚のスライドに余分な液体をタップし、洗濯ラックにすばやく挿入します。スライド ラックを上下に移動するための皿で 3 ~ 5 回右で 2 分間</li>
			<li>2 番目の洗浄では、新鮮な洗浄バッファーを使用します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>信号増幅。<ol>
<li>スライドから過剰な洗浄バッファーをタップし、染色ラック内に配置します。組織を被覆する AMP 0 の 4 滴を追加します。湿度コントロール トレイの汚れのラックを置き、40 ° C で 30 分間オーブンで挿入</li>
			<li>スライドを上記のように洗浄液で 2 回洗浄します。</li>
			<li>1-6 次の順序、表 2の条件のアンプでこの手順を繰り返します。交配の各ステップ後 2 回スライドを洗ってください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>信号検出<ol>
<li>スライドから過剰な洗浄バッファーをタップし、染色ラック内に配置します。高速赤 120 μ L を高速赤 B の 2 μ L を追加微量遠心チューブに (1: 60 の比)。よく混ぜるし、ティッシュ セクションを完全にカバーするために追加。 注: 赤い A の容量/B のミックスは、数とティッシュ セクションのサイズに基づいて。0.75 'x 0.75' 領域、120 μ L は、1 つのセクションに十分です。5 分以内でミックスを使用し、ミックスの直射日光や紫外線への暴露を避けます。</li>
			<li>トレイを閉じますと廃棄物コンテナーにソリューション ルート削除で 10 分間インキュベートすぐに洗濯ラックにスライドを挿入して水道水で満たされた洗浄皿にラックを置きます。新鮮な水道水でもう一度すすぎます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スライドの counterstaining
	<ol>
<li>洗濯ラックを水道水から外し、余分な水分を除去する吸収紙の上をすばやくタップします。50% ヘマトキシリン染色液にラックを置くし、すぐに数回上下ラックを移動します。室温 2 分間インキュベートします。</li>
		<li>水道水皿にスライド ラックを転送します。ラックを上下に移動、スライドが明確な脳組織が紫のままになるまで、新鮮な水道水を変更する 3-5 回を洗います。</li>
		<li>0.02% アンモニア水を含んでいる皿にラックを移動します。ラック上下に 2-3 回まで移動組織が青色に変わります。染色皿に新鮮な水道水で 3 ~ 5 回スライドを洗います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サンプルの実装
	<ol>
<li>60 の ° C の定温器に染色の皿からスライド ラックを移動し、スライドが完全に乾燥するまで、少なくとも 15 分間インキュベートします。</li>
		<li>スライド上で、慎重に媒体をマウントの場所 40 μ L 組織切片上 24 ミリメートル x 50 mm の coverslip に置きます。室温 30 分間空気乾燥スライド</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. データの収集と分析
注: は、40 倍の倍率で画像をスキャンするのにスライド スキャナーを使用します。
<ol><li>
正と負のコントロール
	<ol>
<li>各実験の正と負のコントロール (図 3) が含まれます。良い肯定的な制御として信号が 20-40 倍の倍率で点状のドットとして表示されます。</li>
		<li>肯定的な制御として - PPIB - 1 zz (Mm) にマウスを使用。このプローブは、一般的なハウスキーピング遺伝子 PPIB を対象します。マイナス コントロールの 20 X 顕微鏡フィールドごと染色の背景を表示するすべての 20 のセルに 1 つのドットは、許容。</li>
		<li>ネガティブ コントロールとして DapB 1 zz プローブを使用します。このプローブは、細菌の遺伝子 dapB を対象します。これらのコントロールのプローブは、多くっぽい試金19で使用されています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
信号検出およびNf1エクソン 23 a の発現パターンの解析
	<ol>
<li>交配のシグナルに点状のドットとして表示されて、手動でドットを数えます。ドットの数が特定のプローブによって検出された成績証明書のレベルと相関しています。ドットの数には、ImageJ または SpotStudio ソフトウェアによって分析できます注意してください。</li>
		<li>3 つのプローブを使用すると、エクソン 23a 含む、エクソン 23a 欠けてアイソ フォーム、または合計nf1 で成績証明書 (図 2) に交配させます。3 つのプローブは、同時に使用することはできません、各プローブに交配させる 3 つの隣接する脳組織切片を使用します。<ol>
<li>エクソン 23 a のスプライス (PSI) のパーセントを計算するには、細胞といくつかの脳領域でドットの数をカウントします。興味の地域ごとの図 4に示すようにいくつかのサブ領域から 400 以上のセルを個数します。</li>
			<li>3 つのプローブごとに同じサブ領域からデータを収集します。エクソン 23a 封入プローブを用いた細胞あたりのドットの数として PSI を計算/(エクソン 23a 封入プローブ + プローブをスキップ、exon23a のセルあたりのドットの数でセルあたりのドットの数) x 100%。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

この通信は、マウスの脳のセクションでの発現パターンを検討する BaseScope RNA っぽいの使用を報告します。そのアンチセンス エクソン エキソン接合プローブ エクソン包含およびしっかりと具体的にアイソ フォームをスキップを標的に 50 のヌクレオチドより短いことを示しています。さらに、結果として得られる信号は代替エクソンの PSI を計算する使用できます。
いくつかのバリエーションは、手順でテストされました。たとえば、クライオスタット切片によって生成される凍結するティッシュ セクションおよびこのっぽいプロトコルで使用するために成功するために示されているテストされました。ただし、この場合、2.1 に deparaffinization ステップは、5 分を PBS で 10 月の洗濯に変更されました。さらに、ACD によって提供されるハイブリダイゼーション オーブンを使用すると非常に便利ですが、染色、免疫組織化学用トレイ スライドと組み合わせて 40 ° C で設定簡単なインキュベーターの使用は、同等の結果を与えます。重要なことは、ボックスでプロシージャ全体で湿式ろ紙を含める...

代替選択的スプライシング (AS) は、mRNA の成熟過程で発生する一般的なプロセスです。このプロセスで、エクソンは成熟した mRNA の差動含めることできます。したがって、AS を介して 1 つの遺伝子コードを生成できる多く Mrna その異なるタンパク質製品。推定されているヒトの遺伝子の 92-94% が代替スプライシング1,2を受けること。パターンをスプライシング異常の代わりに起因する遺伝の突然変異は、多数の疾患、筋萎縮性側索硬化症、筋強直性ジストロフィーがん3,4などにリンクされています。つまり、調査し、人間の病気の新しい治療法を見つけるための代替選択的スプライシング制御機構を理解することが重要。
多くの場合セル型固有の方法で調整されます。特定の生物学的システムでの特定の遺伝子として発現パターンを調べることが重要です。しかし、これは脳や心臓などの細胞の多くの異なる種類を含む複雑な器官を学んだとき複雑になります。この場合、アッセイ システムの理想的な選択肢は、RNAの in situハイブリダイゼーション (っぽい) ティッシュを使用してセクションの特定の遺伝子として発現パターンを多くの細胞のタイプで同時に検出できます。確かに、エクソン特異的プローブは、代替エクソン5,6、7の発現レベルを評価するために使用されています。ただし、この方法は次の理由ではパターン分析としての適していません。まず、従来の ISH 法は通常 300 以上のプローブを使って bp、脊椎動物の内部エクソン (ない最初または最後エクソン) の平均のサイズは 170 ヌクレオチド8,9。第二に、内部代替エキソンの選択的スプライシングのパターンを調べるエクソン特異的プローブを使用すると、プローブによって検出のみの mRNA アイソ フォームは、エクソンは検出できませんなし mRNA アイソ フォームながら、エクソンが含まれている 1 つであります。したがって、代替のエクソンの値を (PSI) 融着接続割合の計算は複雑です。さらに、従来の蛍光っぽいはしばしば免疫染色は、検出効率と堅牢性を軽減っぽいを兼ね備えています。たとえば、ストレス誘発性を検討した研究ではスプライシング アイソ フォーム切り替えアセチルコリンエステラーゼ (AChE) の mRNA、ジゴキシゲニンっぽいプローブに編入され、アンチ ジゴキシゲニン抗体を使用して検出されました。また、ビオチン標識プローブは、アルカリ性ホスファターゼ/ストレプトアビジン共役およびアルカリホスファターゼの10のための基板によって検出されました。どちらのメソッドでは、任意の拡大戦略を使用して、検出の感度を上げます。その結果、それは低レベルで発現する mrna の検出に挑戦します。したがって、表現のパターンとしてその場で分析する単純で丈夫っぽいアッセイ システムが必要です。
BaseScope は最近 RNAscope、老舗のプラットフォームをベースに開発され、広くっぽいアッセイ システムを使用します。両方のアッセイ系では、検出11,12の感度を高めるターゲット固有の増幅技術を採用しています。その他から 1 つを区別するものは BaseScope、50 のヌクレオチドと RNAscope の 300-1,000 ヌクレオチドとして短いターゲット シーケンスの長さです。したがって、ターゲット特定の代替の mRNA のアイソ フォームの検出するエクソン エキソン接合設計プローブすることが可能です。現在の研究では、神経線維腫の発現パターン入力 1 (Nf1) エクソン 23 a、同じ研究室13,14,15で手広く研究代替エクソンを調べる手順を設立,16,17マウスの脳のセクションで。結果は、BaseScope がNf1エクソン 23 a原の発現パターンを研究する理想的なシステムであることを示します。このアッセイ システムは、多くの代替のエクソンの発現パターンとして分析に適応できますが、それは AS の研究の強力な新しいツールを表します

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>湿度制御トレイ(蓋付き)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Stain Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>インペリアルIII汎用インキュベータ</td>ー<td>ラボライン</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>スライドスキャナー</td><td>ライカ</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>前処理キット</ストロング></td><td>アドバンスドセルダイアグノスティック</td><td>ス 322381</td><td></td></tr><tr>過<td>酸化水素</td><td>アドバンスドセルダイアグノスティック</td>ス <td>2000899</td><td></td></tr>プロ<tr><td>テアーゼIII*</td><td>アドバンストセルダイアグノスティック</td>ス <td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x ターゲットリトリーバル</td><td>アドバンスドセルダイアグニ</td>スティックス <td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection Reagent Kit</td><td>アドバンスドセルダイアグノスティック</td>ス<td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>アドバンスト セル診断</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td> アドバンス<td>ト セル診断</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td> アドバンス<td>ド セル診断</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>アドバンスト セル診断</td><td>3</td> 2001817 <td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>アドバンスド セル診断</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>アドバンスト・セル・ダイアグノスティック</td>ス <td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>アドバンスド・セル・ダイアグノスティック</td>ス <td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>ファスト・レッド-A</td><td>アドバンスド・セル・ダイアグノ</td>スティックス <td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>ファスト・レッド-B</td><td>アドバンスド・セル・ダイアグノスティック</td>ス <td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x ウォッシュ・バッファー</td><td>アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>ネガティブ・コントロール・プローブ- マウス DapB-1ZZ</td><td>アドバンストセルダイアグノスティック</td>ス <td>701021</td><td></td></tr><tr><td>ポジティブコントロールプローブ-マウス (mm)-PPIB-1ZZ</td><td>アドバンストセルダイアグノスティック</td><td>ス 701081</td><td></td></tr><tr><td>コントロールスライドマウス 3T3細胞ペレット</td><td>アドバンスドセルダイアグノスティックス</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>その他の消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加湿紙</td><td>高度な細胞診断</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>洗浄ラック</td><td>アメリカンマスターテック サイエンティフィック</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>ウォッシングディッシュ</td><td>アメリカンマスターテック サイエンティフィック</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>疎水性バリアペン</td><td>ベクトル研究所</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス、24 mm x 50 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% エタノール (EtOH)</td><td>デコン ラボ</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルド溶液</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン I</td><td>アメリカン・マスター・テック サイエンティフィック</td>・サイエンティフィック <td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>マウンティング ミディアム</td><td>ベクター ラボ</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

代替の pre-mrna スプライシング rna in situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

代替選択的スプライシング (AS) は、ヒトの遺伝子の 90% 以上で発生します。オルタナティブスプ エクソンの表現パターンは多くの場合セル型固有の方法で調整されます。パターンは通常 RT-PCR および RNA シーケンスによって分析される表現としての RNA のサンプルを使用してセルの人口から分離されました。試験では、その場の特定の生物学的構造の表現のパターンとしては、RNAの in situハイブリダイゼーションによる (っぽい) エクソン特異的プローブを用いた実施できます。ただし、代替のエクソン、一般的にエクソン特異的プローブの設計には短すぎるので、ISH のこの特定の使用が制限されています。本報告では、BaseScope、RNA ISH で短いアンチセンス オリゴヌクレオチドを用いる最近開発された技術の使用はマウスの脳のセクションで式パターンとして分析する説明。神経線維腫型 (Nf1) 1 のエクソン 23 a は、短いエクソン エキソン接合プローブがマウスの脳のセクションの RNA っぽい分析に高い特異性と堅牢な交配のシグナルを示すことを説明するために例として使用されます。もっと重要なは、エクソン包含とスキップ特定プローブで検出される信号は確実にNf1エクソン 23a 式マウス脳の別の解剖学的領域での値でスプライス % を計算する使用できます。実験プロトコル、分析としての計算方法が掲載されています。BaseScope 式パターンとしてその場で評価するために強力な新しいツールを提供することが示唆されました。

BaseScope っぽいが 3 つのマウス系統を用いたを行った: CD1 野生型マウス、c57bl/6 j 野生型マウスとNf123aIN/23aIN変異マウス c57bl/6 j バック グラウンドでどのエクソン 23 a の結果としてすべてのセルのタイプに含まれています設計スプライス部位突然変異14,15。
最初のステップとしてっぽいアッセイ システムを提供する会社の試薬を使用してテストされた: 3T3 細胞と陰性と陽性があるスライドっぽいプローブします。図 3に示すとおり、ポジティブ コントロール プローブを使用した場合、多くの点状のドットが検出された一方、陰性コントロール プローブを使用した場合、信号は検出されません。
...

その場で交配 (っぽい) プロトコル マウス脳セクションの代替の Pre-mrna スプライシング パターンを検出する短いアンチセンス オリゴヌクレオチドを使用して記述されています。

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

この方法は、選択的プレmRNAスプライシングの分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。具体的には、組織スライス中の選択的スプライシングパターンをin situで調べるための堅牢で高感度なアッセイシステムを提供します。この方法により、マウスの脳などの複雑な生物学的構造に含まれる多くのサブタイプで、選択的スプライシングを同時に分析できます。この技術の主な利点は、mRNAの衝撃型帯電防止エクソンジャンクションプローブをin situハイブリダイゼーションして、アイソフォーム特異的ハイブリダイゼーションシグナルを生成することです。ビル信号増幅技術により、検出感度が向上し、堅牢なハイブリダイゼーション信号が得られます。検出されたシグナルは、マウス脳のさまざまな解剖学的領域におけるバイタルのスプライスの割合を計算するために使用される特定のプローブから逃げるエクソン封入体でした。この研究では、NF1エクソン23aを例として、アッセイシステムの使用を説明するために使用されます。しかし、このシステムは、多くの代替エクソンの発現パターンの解析に適合させることができます。マウス脳切片Dのパラフィン化を開始するには、2つの洗濯皿に250ミリリットルのキシレンを入れます。そして、ヒュームフード内に250ミリリットルの100%エタノールが入った別の2つ。ティッシュスライドを洗濯ラックに挿入します。次に、キシレン入りディッシュに洗濯ラックを入れ、ラックを少なくとも3回上下に動かしながら5分間インキュベートし、2番目のキシレンディッシュで繰り返します。次に、ラックをエタノール入りディッシュに入れ、同じ上下の動きで2分間インキュベートし、次に2番目のエタノールディッシュで繰り返します。スライドを乾燥させるには、2番目のエタノール皿からラックを移動し、摂氏60度のインキュベーター内に5分間置きます。疎水性バリアペンを使用して、ティッシュセクションの周りに0.75インチ×0.75インチのバリアを描き、室温で3分間風乾します。ハイブリダイゼーションオーブンの電源を入れ、温度を摂氏40度に設定します。加湿紙を蒸留水で完全に濡らした後、湿度調整トレイに置きます。次に、湿度制御トレイをハイブリダイゼーションオーブンに挿入します。乾燥させたスライドをベンチに置いた後、各スライドの組織切片を5〜8滴の過酸化水素溶液で完全に覆います。室温で10分間インキュベートします。吸収紙にスライドを1枚ずつ叩いて過酸化水素溶液を取り出し、スライドを洗浄ラックに挿入します。水を入れた洗濯皿にラックを浸し、上下に3〜5回動かしてスライドを洗います。ホットプレート上に置かれた1リットルのガラスビーカーに700ミリリットルの1Xターゲット除去処理を充填し、ホイルで覆います。ホイルカバーに温度計を挿入し、ホットプレートの電源を入れ、高温に10〜15分間設定します。回収試薬の温度が98°Cに達したら、ホットプレートを低温にして穏やかな沸騰状態を保ちます。次に、ホイルを慎重に取り外し、ラックをビーカーの中に置きます。ビーカーをホイルで覆い、15分間インキュベートします。鉗子を使用して、ラックをビーカーから200ミリリットルの蒸留水が入った洗浄皿に移し、15秒間インキュベートします。15秒後、ラックを100%エタノールを含む洗浄皿に入れ、3分間インキュベートします。ラックを皿から取り出し、摂氏60度で10分間乾かします。スライドをステインラックに置いた後、スライドごとに5滴のプロテアーゼ3で組織切片を覆います。ラックを湿度制御トレイに慎重に置き、トレイをハイブリダイゼーションオーブンに挿入し、摂氏40度で30分間インキュベートします。ラックをトレイから取り外した後、スライドをタップして余分な液体を取り除き、洗浄ラックに挿入します。蒸留水を入れた洗浄皿にラックを置き、ラックを上下に3〜5回動かしてスライドを洗います。in situハイブリダイゼーションの準備として、プローブとAMP試薬を室温で30分間インキュベートします。湿度制御トレイをハイブリダイゼーションオーブンに挿入し、摂氏40度に設定します。プローブハイブリダイゼーションの場合は、スライドを洗浄ラックから取り外し、軽くたたいて余分な液体を取り除きます。スライドをステインラックに置きます。鉛筆を使用して、スライドにプローブ名のラベルを付けます。隣接して切断された3つの脳組織スライドを配置し、3つの異なる神経線維有糸分裂タイプ1プローブとハイブリダイズします。アイソフォーム特異的プローブは非常に異なるため、隣接して切断された組織切片を使用します。これらの切片をハイブリダイゼーション、増幅、およびシグナル検出のステップでまったく同じように扱うことは、計算におけるパーセンテージスプライスの精度を確保するために重要です。切片の乾燥を防ぐために、切片ごとに一度に1枚のスライドで、組織切片を4滴のプローブで覆います。次に、ステインラックを湿度制御トレイに置き、摂氏40度のオーブンに2時間挿入します。次に、200ミリリットルの1Xウォッシュバッファーで満たされた洗濯皿にウォッシングラックを置きます。次に、ペーパータオルで各スライドを一度に1つずつ軽くたたいて、余分な液体を取り除きます。そしてすぐに各スライドを洗濯ラックに挿入します。新鮮な洗浄バッファーを充填した皿で室温で2分間インキュベートし、ラックを3〜5回上下に動かし、新しい皿で洗浄を繰り返します。シグナル増幅のためには、各スライドをタップして余分な洗浄バッファーを取り除き、ステインラックに置きます。各スライドの組織切片をAMPゼロ試薬4滴で覆います。次に、ラックを湿度制御トレイに置き、トレイをオーブンに挿入し、摂氏40度で30分間インキュベートします。この実験で以前に行ったように、スライドを洗浄バッファーで2回洗浄します。テキストプロトコルで説明されているように、AMP試薬1〜6でシグナル増幅ステップを繰り返し、各ステップの後にスライドを洗浄します。シグナル検出のために、スライドから余分な洗浄バッファーを軽くたたいて取り除き、ステインラックに置きます。次に、2マイクロリットルの高速赤色Bと120マイクロリットルの高速赤色Aをマイクロ遠心チューブに混合します。各スライドの組織切片に溶液を添加して、それらを完全に覆います。ステインラックを調湿トレイに置き、トレイに蓋をして室温で10分間インキュベートします。次に、溶液を取り出し、スライドを洗浄ラックに挿入します。水道水が入った洗濯皿にラックを置いてスライドを洗い、洗濯を繰り返します。2回目の洗濯後、吸収紙を軽くたたいて余分な水分を取り除きます。次に、50%ヘマトキシリン染色溶液が入った皿にラックを置きます。ラックを数回上下に動かします。そして、室温で2分間インキュベートします。水道水が入った洗濯皿にラックを移します。ラックを5回上下に動かし、スライドが透明になるまで洗浄を繰り返しますが、ティッシュ切片は紫色のままです。次に、ラックを0.02%のアンモニア水が入った皿に移します。ラックを上下に 2 回から 4 回動かして、セクションが青色に変わります。汚れた皿でスライドを水道水で3〜5回洗います。次に、ラックをインキュベーター内に置き、摂氏60度で15分間インキュベートしてスライドを乾燥させます。完全に乾いたら、各スライドに封入剤を1滴加えてスライスを覆います。次に、24 x 50 mmのカバースリップを各スライドの組織切片に慎重に置きます。スライドを室温で30分間風乾した後、データ収集を進めます。エクソン23aのスプライシング率またはPSI値を計算するために、皮質の3つのサブ領域の細胞とドットの数、および海馬CA3がカウントされます。RNAin situハイブリダイゼーションアッセイは、3つの異なるNF1特異的プローブを使用して、CD1野生型マウスの脳切片で実施されます。皮質と海馬のセクションで観察された赤い点状のドットは、NF1合計、包含特異的、およびスキップ特異的プローブによる正の信号を示しています。次に、3つのプローブからのISH信号がカウントされ、PSIの計算に使用されます。RNAin situハイブリダイゼーションアッセイは、エクソン23aがすべての細胞タイプに含まれるC57ブラック6J野生型マウスおよびC57ブラック6J変異マウスの皮質で実施されます。C57黒色6J野生型マウスの皮質で観察された赤い点状点は、NF1トータル、介在物特異的、およびスキップ特異的プローブによる正のシグナルを示しています。C57 black 6J変異マウスでは、NF1トータルプローブおよびインクルージョン特異的プローブによって同様のシグナルが得られます。しかし、スキップ特異的プローブを使用した場合、シグナルは検出されず、エクソンインクルージョンまたはスキップを標的とする2つのプローブが非常に特異的であることを示しています。この手順では、同じ組織スライド上のマルチカラーラベリングはまだ利用できないため、異なる組織スライドで異なるプローブが使用されます。正確なスプライシング率の値を得るには、この手順全体で、隣接するカットスライドを使用し、スライドをまったく同じ方法で処理することが重要です。この手順を補完するのは、免疫組織化学のような手段であり、差次的に発現するスプライシングアイソフォームの局在と機能に関する追加の質問に答えるために実行できます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

このビデオでは、セロトニン症候群に罹患したラットの脳組織において、オリゴヌクレオチドプローブを用いたセロトニン受容体RNA合成の検出を実演しています。このプロトコールには、組織の前処理、プローブハイブリダイゼーション、および顕微鏡下でセロトニン受容体RNA発現を可視化および定量するための酵素検出が含まれます。...

オリゴヌクレオチドプローブを用いたラット脳切片におけるRNA発現の研究のためのin situハイブリダイゼーション

出典:Jolly, S., et.al.二重蛍光In Situハイブリダイゼーションと免疫標識を組み合わせて、マウス脳切片における3つの遺伝子の発現を検出します。J. Vis. Exp. (2016).このビデオでは、ダブル蛍光in...

マウス脳切片における遺伝子発現を検出するための二重蛍光In Situハイブリダイゼーションの実施

選択的スプライシング制御は、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおける必須の細胞プログラムである上皮間葉転換(EMT)に寄与することが示されています。ここでは、EMT中の選択的スプライシングの検出に誘導性EMTモデルを利用する方法について説明します。...

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

RNA in situハイブリダイゼーション(ISH)は、細胞や組織内のRNAの可視化を可能にします。ここでは、RNAscope...

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

特定の細胞タイプへの遺伝子発現の局在化は、特異的な抗体がないために困難な場合があります。ここでは、ダブル蛍光 RNA in situ ハイブリダイゼーションと免疫染色を組み合わせることにより、遺伝子発現を 3...

ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

ここでは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とプロトコルについて説明します。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおける親及び抵抗性のトランスクリプトームプロフィールを分析し、候補遺伝子を検証するための定量RT-PCRベースの方法を確立しました。...

に薬剤耐性に関連する新規スプライス変異体を検出するために、RNA配列決定を使用して、<em&gt;インビトロ</em&gt;がんモデル

ここでは、マウス胚組織における遺伝子発現をプロファイルする多重化単一細胞mRNAシーケンシング法を提示した。多重化戦略と組み合わせた液滴ベースの単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)法は、複数のサンプルから単一細胞を同時にプロファイルできるため、試薬コストを大幅に削減し、実験的なバッチ効果を最小限に抑えることができます。...

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

選択的スプライシング(AS)および選択的ポリアデニル化(APA)は、転写産物アイソフォームとその産物の多様性を拡大します。ここでは、バルクRNA-seqを分析するためのバイオインフォマティクスプロトコルと、実験条件によって変化するASおよびAPAを検出および視覚化するための3'エンドシーケンシングアッセイについて説明します。...

RNA-seqデータにおける選択的スプライシングおよびポリアデニル化の同定(英語)

私たちは、マウス脈絡叢のインスリン受容体アイソフォームIR-AおよびIR-BをマッピングするためのDuplex in situ...

RNA In Situ ハイブリダイゼーションアッセイによるマウス脳内のインスリン受容体AおよびBの精密な可視化

このプロトコルは、初期のエンハンサー転写産物を定量化するための合理化された計算パイプラインを提供します。クロマチンアクセシビリティ、クロマチン特徴、転写データを統合することで、複雑な遺伝子内領域におけるエンハンサー活性の正確な検出と鎖特異的分析を可能にし、広範なバイオインフォマティクスのトレーニングを受けなくても研究者がアクセスできるようにします。...

マウス胚性幹細胞における遺伝子間/遺伝子内エンハンサーRNA定量のための計算パイプライン

学ぶマウス脳切片における代替プレmRNAスプライシングのin situハイブリダイゼーション法。ショックアンチスタティックエクソンジャンクションプローブと信号増幅技術を用いて、スプライシングパターンを高感度に検出し、神経組織における選択的スプライシング機構を解明する。

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

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