Name: 急性心筋梗塞と心血管疾患のマイクロ Rna を循環の定量化デジタル PCR (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: 学ぶデジタルPCRを用いた循環miRNAの定量法。血清サンプルからmiRNAを抽出し、絶対定量で心血管疾患のバイオマーカーとしての有効性を検証する正確なプロトコルです。

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1. 血漿/血清中からマイクロ Rna の抽出
注: Mirna を適切に定量化するために血漿/血清中から正しいマイクロ Rna 分離は重要なステップです。心に留めて、さまざまなプロトコルが存在するために特に重要なことは、サンプルの処理中に同じワークフローに準拠するためです。このプロトコルでは、miRNA が 50 μ L の血清から抽出されます。この制限の正しい抽出プロセスとしてよりも 200 μ L を使用しないでください。
<ol><li>血清の準備または凍結試料を凍結解除。</li>
	<li>250 μ L (5 冊) 商業溶解試薬を 50 μ L の血清に追加します。ボルテックスによって、換散をサポートします。5 分間室温でベンチにライセートとチューブを配置します。</li>
	<li>スパイク スパイクの制御 (1.6 倍 107コピー/μ L) の 3.5 μ L でライセート、ボルテックスでそれらをミックスします。</li>
	<li>相分離のクロロホルム (すなわち、開始の血清サンプルほど等しい金額) の 50 μ L を追加します。15 s. 場所 2 〜 3 分間室温でベンチにチューブのチューブを積極的に振る。</li>
	<li>相分離の 4 ° C 15 分で 12,000 × g でチューブを遠心します。 注: サンプルは、RNA、白い中間期およびより低い、ピンクの有機相を含む上部の水相に今区切られます。</li>
	<li>新しい管に RNA を含む上部水様段階 (100 μ L) を転送します。これは正しい RNA 数を偽って、白い界面材料を転送していません。</li>
	<li>100% エタノール 150 μ L を (すなわち、転送されたサンプルの量 × 1.5) を追加します。それらを上下にピペッティングにより材料を混ぜます。それらを遠心分離しないし、すぐに次のステップに移りましょう。</li>
	<li>ピペット 2 mL 採取管の商業スピン列にサンプルを 250 μ l 添加します。カバーを閉じます。遠心分離機の位置にある列 > フロースルー - 15 s. 破棄のため室温で 8,000 × g。</li>
	<li>1 商業洗浄バッファー数 700 μ L をスピン列に追加します。蓋を閉めるし、遠心分離機の位置にある列 > 室温 15 s. 破棄スルー洗浄バッファーで 8,000 × g。</li>
	<li>2 商業洗浄バッファー数 500 μ L をスピン列に追加します。蓋を閉めるし、遠心分離機の位置にある列 > 8, 000 15 s. 破棄スルー洗浄液は室温において g x。</li>
	<li>スピン列に 80% エタノール 500 μ L をピペットします。ふたを閉じる、遠心分離機の位置にある列 > 8, 000 x g 2 分の室温でフローとコレクションの管を破棄します。</li>
	<li>回転カラムを新しい 2 mL のコレクションの管に転送します。膜を乾燥する開いた蓋にフルスピードで列を遠心します。流れとコレクションの管を破棄します。</li>
	<li>新しい 1.5 mL コレクション チューブにスピン列を転送します。RNase フリーの水の 30 μ L 膜の中心に直接に適用することによって、RNA を溶出します。カバーを閉じます。1 分のフルスピードで列を遠心します。</li>
	<li>-70 ° C で RNA を保存します。 注:-70 ° C ~-20 ° C の間に RNase フリー水で浄化された RNA の記憶により 1 年間の RNA の劣化はありません。製造元のプロトコル、RNA を希釈するための水の RNase フリーの最小量は 10 μ L. 10 μ L が十分に膜をメタンハイド レートし、総 RNA の収穫を減らすより小さいを使用しています。</li>
</ol>2. 逆のトランスクリプション
注: 次の 15 μ L の逆のトランスクリプション (RT) プロトコル (全反応ボリューム) を使用して相補的 DNA (cDNA) が合成されました。
<ol><li>雪解けの氷の上 RT キット。酵素を分解からそれらを防ぐため、使用する前にそれらをスピンダウンし可能な限りの冷凍庫において。氷の上 RT プライマーを解凍し、使用する前にそれらをスピンダウンします。</li>
	<li>表 1に示すようにマスター ミックスを準備します。</li>
	<li>マスター ミックスの 10 μ L、5 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートで抽出した RNA を結合します。</li>
	<li>2 分のための 4 ° C で 2,000 x g でウェル プレートを遠心します。</li>
	<li>逆のトランスクリプションの表 2に示す熱サイクル プロトコルを使用します。 注: 以下で説明された cDNA が直接処理デジタル PCR マシンで (材料の表を参照)。また、それは、-20 ° C で保存されるかもしれない</li>
</ol>3. 液滴生成とデジタル PCR
注: デジタル 40 μ L の次のプロトコルを使用して PCR を行った。
<ol><li>商業 dPCR ミックス、準備された cDNA および氷の上、PCR のプライマーを解凍します。使用直前にそれらを遠心します。</li>
	<li>に従ってマスター ミックスを準備テーブル 3.
</li>
	<li>RT 製品の 1.33 μ L/ウェルを追加し、簡単にそれを遠心します。</li>
	<li>8 よくカセット (中行) の各ウェルに試料の 20 μ L をピペットします。 注: 8 もカセットが完全に入力されていない場合テンプレート以外のコントロール (NTCs) cDNA (すなわち、抽出した RNA の代りに水で生産された RT 製品) を省略すると残りの井戸を埋めるまたは dPCR 商業バッファー。NTC は、コンタミネーション コントロールとして機能します。液滴形成の質が低下するので、残りの井戸で水を使用ない必要があります。</li>
	<li>8 もカセットの油田 (下の行) に、プローブの液滴生成油の 70 μ L をピペットします。</li>
	<li>8 もカセットの上にガスケットを配置し、液滴形成配列装置のカセットを配置します。液滴形成配列装置を閉じます。3 つのインジケーター ライトが緑色に点灯するまで待ちます。 注: 液滴が生成されている今。</li>
	<li>丁寧にゆっくりとピペッティングによる 96 ウェル プレートの別の井戸に液滴状サンプル (上の行) の 40 μ L を転送します。</li>
	<li>サンプルの液滴形成を完了すると、シール 4 180 ° C で pierceable dPCR 箔で PCR プレート s。</li>
	<li>Cycler の箔シール PCR プレートを置き、2.5 のランプに入る率で表 4で説明されているようにそれをサイクル ° C/s。</li>
</ol>4. 液滴の読書と分析
<ol><li>プレート ホルダーのベースに、熱 cycler からプレートを転送します。PCR プレート プレート ホルダーの上部に配置することによって PCR プレートを締めます。</li>
	<li>商業 dPCR ソフトウェアを起動します。</li>
	<li>セットアップにサンプル名、実験、およびターゲットの名前を入力します。絶対数量を選択します。</li>
	<li>液滴を実行] をクリックして読み取りを開始します。加水分解プローブを操作するとき、検出化学としてファム/HEXまたはファム/ヴィックを選択します。 注: 商業 dPCR ソフトウェアは、自動 - データを分析します。</li>
	<li>確実に正しい液滴生成結果テーブル内の液滴の数字を確認します。</li>
	<li>同じ定量化された miRNA とすべての井戸を選択し、分析] をクリックします。肯定的な液滴をマークし、自動分析データ (図 1) を手動で修正する 2D のしみを使用します。</li>
</ol>5. サンプルの計算を修正します。
<ol><li>正規化係数 (NF) サンプルを乗じてサンプルを正規化します。 NF = 中央 [c. の elegansミール 39 測定]すべてのサンプル/[c. の elegansミール-39]ある特定のサンプル
</li>
	<li>希釈倍率 (DF) の調整、最終 miRNA 血清濃度を計算します。 [miRNA]最終DFRT DFdPCR Ex DF x x x [miRNA]生の値を = どこ： [miRNA]生の値= 商業 dPCR ソフトウェアにより定量化 miRNA DFRT = 逆のトランスクリプション; でテンプレートの希釈係数 DFdPCR = dPCR; でテンプレートの希釈係数 Ex DF 抽出で希釈倍率を =。</li>
</ol>6. 合成オリゴヌクレオチド希釈系列
<ol><li>氷の上の凍結乾燥の合成オリゴヌクレオチドを解凍します。簡単にそれを遠心分離機します。</li>
	<li>ヌクレアーゼ フリー水 10 pmol の最終的な集中に凍結乾燥させた合成オリゴヌクレオチドを希釈/μ L。 簡単に遠心分離機のそれ。</li>
	<li>表 5に示すヌクレアーゼ フリー水で希釈します。10 の 8,000 の x g で各希釈段階間簡潔に希釈を遠心分離機 s。</li>
	<li>手順 2 で説明した逆のトランスクリプションを続行し、手順 3 と手順 4 で説明したようにデジタル PCR のサンプルを分析します。</li>
</ol>

<ol><li>Schulte, C., Zeller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-based+diagnostics+and+therapy+in+cardiovascular+disease+-+summing+up+the+facts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts.</a> Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).</li>
<li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microRNAs+in+myocardial+infarction%3A+from+molecular+mechanism+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li>
<li>Dimmeler, S., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+for+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases.</a> European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Oerlemans, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+assessment+of+acute+coronary+syndromes+in+the+emergency+department%3A+the+potential+diagnostic+value+of+circulating+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).</li>
<li>Olivieri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+potential+of+circulating+miR-499-5p+in+elderly+patients+with+acute+non+ST-elevation+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction.</a> Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).</li>
<li>Navickas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+circulating+microRNAs+as+biomarkers+of+cardiovascular+disease%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review.</a> Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).</li>
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<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+as+a+novel+detection+method+for+quantifying+microRNAs+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction.</a> Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).</li>
<li>D'Alessandra, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+are+new+and+sensitive+biomarkers+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).</li>
<li>Forootan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+limit+of+detection+and+limit+of+quantification+in+quantitative+real-time+PCR+%28qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).</li>
<li>Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+droplet-digital+PCR+vs+real-time+quantitative+PCR+to+inhibitory+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances.</a> Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
</ol>

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デジタル PCR は比較的新規エンドポイントにより、核酸サンプル内の直接の絶対定量 PCR 法であります。メソッドでは、減少の変動、高められた日常の再現性、優れた感度11,12など、特定の利点を所有しています。さらに、サンプルは約 20,000 の単一反応やエンドポイント分析に分配による dPCR は堅牢に定量的 RT-PCR 法16と比較して PCR の妨害物質。DPCR これらの資質は、定量化のための診断ツールとして定量的 RT-PCR 法に魅力的な代替手段です。Mirna を循環として多い低血清濃度で存在、これまで科学者たちが挑戦されている PCR9Mirna を適切に定量化します。その一方で、dPCR は適切に低カウント miRNA 定量化17点の問題を軽減する血清中式でも低の miRNA を定量化できます。DPCR の能力を非常に低い miRNA 式でも数/μ L を直...

循環の miRNAs は、疾患、心血管疾患の1を含む数の有望なマーカーとして識別されています。Mirna が小さい、単一座礁させた RNA 分子の非コーディング (約 22 ヌクレオチド長い) が関与している、転写後調節を介してメッセンジャー RNA の翻訳および影響を及ぼす遺伝子表現2の変化され、生理学的および病理学的状態の循環に解放されます。特定の miRNAs の定量的表現は、病理学にリンクすることし、いくつかの miRNAs 示し高組織疾患特異性1。心血管疾患における Mirna PCR 方法論3の助けを借りて定量化する新規バイオ マーカーが血清で非常に安定して、簡単にすることができますので、魅力的な候補となっています。小規模の研究で心筋梗塞のバイオ マーカーとしての miRNAs の潜在的な価値を評価が大規模なコホートで検証、2を欠けています。たとえば、ミール 499 は心筋の筋肉において高い発現があるし、亜美4,5,6で大幅に増加することが示されています。さらに、それを調節するプログラムされた細胞死 (アポトーシス) 心筋細胞の分化と従って次亜美7いくつかのメカニズムに関与しています。別にいくつかの小さな研究優位性と AMI の診断のための Mirna の増分値を報告、高感度心臓 troponins に優位性等はまだ証明されていない大規模な研究2,5 ,6,8。大規模なコホートでより多くの前向き研究は、したがって、miRNAs の潜在的な診断価値を評価するために必要。さらに、マイクロ Rna 定量法の最適化が必要な9のプロトコル標準化された同等を使用しています。標準化されたアッセイは、一貫性のない結果が減り、バイオ マーカーが臨床適用性を確保するため再現性のある方法で定量化する必要がある潜在的なバイオ マーカーのルーチンの臨床応用を目指しての Mirna が役立つことがあります。
最近では、dPCR は、エンドポイント分析として導入されています。それは約 20,000 の個々 の反作用10にサンプルをパーティション分割します。DPCR システムは、数学的なポアソンの統計的分析蛍光信号 (正と負の反応)、標準曲線10なし絶対定量を有効にするを利用します。加水分解蛍光プローブと dPCR を組み合わせて、miRNAs の非常に特定の直接の絶対定量が可能です。MiRNA のレベルを定量化するための優れた技術的な資質 (減少の変動、増加の日常的な再現性、高い直線性、高感度など) を展示するデジタル ポリメラーゼの連鎖反応を示しました、定量的リアルタイム PCR10,11と比較して循環。これらの優れた技術的な資質のバイオ マーカーとして循環の miRNAs の使用上の現在の制限を軽減するために役立つかもしれないし、大規模な多施設循環器臨床試験におけるバイオ マーカーと診断法として、miRNAs の確立につながる可能性があります。一般的です。以前の研究では、最近、AMI 患者の miRNAs の循環の絶対的な定量化のための dPCR を適用し、qPCR12の miRNAs の定量化と比較して優れた診断能力を発揮することができた。
この文書の dPCR を使用してが直接心血管の miRNAs の循環の定量化の正確かつ再現性のある方法であることを実証したいです。デジタル PCR を用いる血清中マイクロ Rna レベルの絶対定量は、大規模なマルチ センター心臓血管臨床試験で使用するため潜在的なを示しています。この文書で述べるデジタル PCR を効果的に実行する方法、および血清の miRNA 絶対コピー数を検出する方法。

<table><tbody><tr><td>RNA-Extraction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasyセラム/プラズマキット (50)</td><td>Qiagen-Sample &Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>217184</td><td>マイクロRNA抽出用キット.キットには商用バッファRWT(原稿ではナンバーワンと呼ばれています)が含まれています&nbsp;およびRPE(原稿では2番目と呼ばれています)。</td></tr><tr><td>miRNeasyセラム/プラズマスパイクインコントロール;Syn-cel-miR-39 miRNA;10pmol</td><td>キアゲン-サンプル&Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>219610</td><td>Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'</td></tr><tr><td>Reverse Transcription</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4366597</td><td>microRNA 逆転写キット</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays M</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assays used in reverse transcription</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assay Number 001352</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assay Number 000200</td></tr><tr><td>PCR Plate, 96-well, セグメント化、セミスカート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ</td>州、米国 <td>AB0900</td><td>96 逆転写用</td></tr><tr><td>プレート マイクロシール 'B&rsquo;シールシール</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>MSB1001</td><td>適切な保管を確保するためのホイル</td></tr><tr><td>C1000 タッチサーマルサイクラー</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1851196</td><td>逆転写に使用されるサイクラー</td></tr><tr><td><ストロング>ドロップレットデジタルPCR</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 nmole RNAオリゴ has-miR-499-5p</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>カスタム</td><td>Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR</td></tr> <tr><td>Supermix for Probes (No dUTP)</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863024</td><td>Supermix used in droplet generation</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe)</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assay Number 001352, commercial primers</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assay Number 000200, commercial primers</td></tr><tr><td>DG8 Cartridges and Gaskets</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1864007</td><td>Cartridge takes to 8 samples for droplet generation</td></tr><tr><td>DG8 カートリッジホルダー</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863051</td><td>液滴生成液</td></tr>滴<tr><td>生成用カートリッジを保持 プローブ用液滴生成オイル</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863005</td><td>液滴生成用オイル</td></tr><tr><td>ddPCR 96ウェルプレート</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>12001925</td><td>ddPCR PCR用96ウェルプレート</td></tr><tr><td>ヒートシール、ホイル、ピアス可能</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1814040</td><td>Pierceable foil, compatible with droplet reader</td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Oil</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863004</td><td>Droplet</td></tr><tr><td>Generator QX100 または QX200 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863002</td><td>Droplet Generatorは、サンプル/オイルエマルジョン</td></tr><tr><td>PX1 PCRから液滴を生成します。プレートシーラー</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1814000</td><td>PCR 前にプレートをシール</td></tr><tr><td>C1000 タッチサーマルサイクラー</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1851196</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>QX100またはQX200 Droplet Reader</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863003</td><td>光学検出器</td></tr><tr><td>でPCR陽性およびPCR陰性の液滴を読み取りますプローブ用ddPCRバッファー制御</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863052</td><td>ブランク制御&nbsp;8ウェルカセットの残りのウェルを埋める</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantaSof Software</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1864011</td><td>液滴読み取りプログラム</td></tr><tr><td>Prism Windows 5</td><td>GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA</td><td></td><td>統計解析プログラム</td></tr></tbody></table>

急性心筋梗塞と心血管疾患のマイクロ rna を循環の定量化デジタル pcr

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

循環血中マイクロ Rna (Mirna) は、循環に心血管系の細胞から放出される心血管疾患および急性心筋梗塞 (AMI) のバイオ マーカーとしての約束を示しています。循環の miRNAs は非常に安定した、定量化することができます。特定の miRNAs の定量化は、病理学といくつかの miRNAs ショー高組織および疾患特異性にリンクできます。心血管疾患の新規バイオ マーカーを見つけることは医学研究のための重要です。ごく最近、デジタルのポリメラーゼの連鎖反応 (dPCR) が発明されています。dPCR、加水分解蛍光プローブと組み合わせて特定の直接絶対定量ができます。dPCR は、変動の少ない、高直線性の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) に比べて感度が高いなど、優れた技術的な資質を展示します。したがって、dPCR は、特に大規模な多施設循環器臨床試験で使用するための Mirna を直接定量化のより正確で再現性のある方法です。この文書では血清中絶対コピー数を把握するためにデジタル PCR を効果的に実行する方法をについて説明します。

加水分解蛍光プローブと組み合わせてデジタル PCR 直接コピー/μ L に特定の miRNAs の絶対的な量を定量化することも可能。 にします。DPCR のサンプルは約 20,000 の個々 の PCR の反作用でパーティション分割された dPCR は技術不要、10をレプリケートします。DPCR システム (反応と正と負の異なる) 蛍光信号の数学的なポアソン統計分析を利用して10曲線の標準のための必要性なしに絶対的な数量を有効にします。許容滴数、濃度を正しく計算するために必要です (&gt; 15,000)。テンプレート コントロールは、かなり非特異的増幅を除外しないようにするため。分析に含まれるすべてのサンプルは、得られた結果の妥当性を強化するため、同じボリューム、メソッド、および PCR のプロトコルを使用して処理されます。DPCR で得られた濃度がスパイクの合成と分析したすべてのサンプルの間で中央値の正規化の手順を使用して、正規化線虫ミール 39<sup...

循環のマイクロ Rna は、心血管疾患および急性心筋梗塞のバイオ マーカーとして約束を示しています。本研究ではマイクロ Rna の抽出、逆のトランスクリプションおよび心血管疾患患者の血清中の miRNAs の絶対的な定量化のためデジタル PCR のためのプロトコルについて述べる。

急性心筋梗塞と心血管疾患のマイクロ Rna を循環の定量化デジタル PCR

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

この方法は、マイクロRNAが心血管疾患の有効なバイオマーカーであるかどうかなど、診断分野における重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。定量的リアルタイムPCRと比較して、デジタルPCRは、循環中のマイクロRNAを定量するための優れた技術的品質を示します。サンプルは約 20, 000 個の液滴に分割されるため、重複測定は不要で、定量化に標準曲線も必要ありません。この方法は、心血管患者におけるマイクロRNAの定量化に関する洞察を提供する可能性がありますが、他のマイクロRNAが癌進行のバイオマーカーとして有望であることが示されているため、他の患者や疾患にも適用できる可能性があります。一般に、この方法に不慣れな人は、生成された液滴が壊れやすく、注意して取り扱う必要があるため、苦労します。血清サンプルからRNAを単離した後、逆転写を続行して、dPCR用のより安定した相補的DNAを取得します。まず、逆転写キットを氷上で解凍します。次に、酵素とプライマーをスピンダウンします。次に、テキストプロトコルで説明されているようにマスターミックスを準備します。10マイクロリットルのマスターミックスと5マイクロリットルの抽出RNAを96ウェルプレートの各ウェルで組み合わせます。次に、プレートを摂氏4度で2,000xgで2分間遠心分離します。テキストプロトコルに詳述されているように、逆転写を続行します。まず、市販のdPCRミックス、cDNAおよびPCRプライマーを氷上で解凍し、使用直前に遠心分離します。次に、テキストプロトコルで説明されているようにマスターミックスを準備します。1.33マイクロリットルの容量の逆転写産物を18.67マイクロリットルの容量のマスターミックスに加え、短時間遠心分離します。ピペットを使用して、20マイクロリットルのサンプルを8ウェルカセットの中列の各ウェルに移します。次に、70マイクロリットルの液滴発生オイルをカセットのオイルウェルにピペットで移します。次に、カセットの上にガスケットを置き、液滴発生器に入れます。液滴発生器を閉じ、3つのインジケーターライトが緑色に点灯するまで待ちます。ピペットを使用して、液滴形成されたサンプルの40マイクロリットルを96ウェルプレートの別々のウェルに慎重に移します。次に、プレートをdPCRホイルで摂氏180度で4秒間シールします。密封されたPCRプレートをサイクラーに置き、テキストプロトコルに概説されているサイクリング指示に従ってください。プレートをサーモサイクラーから取り外し、プレートホルダーのベースに移します。次に、プレートホルダーの上部をPCRプレートに置きます。最後に、商用dPCRソフトウェアを起動します。このプロトコルでは、デジタルPCRを使用して、心血管疾患患者の血清中のマイクロRNAを定量しました。サンプルは、経皮的介入前、経皮的介入の8時間後、および16時間後に16人の患者から採取されました。ST上昇型心筋梗塞の患者は、安定した冠動脈疾患の患者と比較して、miR-499レベルの有意な増加を示しました。この手法を習得すると、正しく行えば、96サンプルの液滴形成に約1時間で完了します。この手順を試みるときは、飛沫の取り扱いに注意することが重要です。このビデオを見れば、正しい液滴形成、サイクリング、読み取り、分析など、デジタルPCRを正しく行う方法について十分に理解できるはずです。

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ここでは、サンプルの限られた量を扱う場合は特に、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルのコストと時間効果のハイスループットスクリーニングのツールと​​してのマイクロ流体プラットフォームとの組み合わせで最適化された多重逆転写定量PCR（定量RT -...

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

複雑な生体試料中のバイオマーカーの測定はますます意思決定臨床指導されています。私たちは、同時に心臓ミオシン結合タンパク質C、クレアチンキナーゼMB、および心筋梗塞と健常者の被験者からの血清サンプル中の心筋トロポニンIを測定する高感度な方法を説明します。...

電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cの定量のための高感度で特異的な定量法

循環マイクロRNAは、最近様々な癌および他の疾患のための有望で新規なバイオマーカーとして浮上している。この記事の目的は、マイクロRNAの循環の豊富さを定量化し、決定するために利用可能である三つの異なるプローブベースのリアルタイムPCRプラットフォームと方法を議論することです。...

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

色素ベースの化学および液滴デジタルPCR技術を使用した無細胞マイクロRNA定量のための高感度で正確な方法が説明されています。...

DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

マイクロRNAは、重要な調節的役割を果たし、様々なヒト疾患のための新規治療標的として浮上しています。 miRNAが、高密度リポタンパク質に運ばれることが示されています。私たちは、急速にヒト血漿からのmiRNA解析に適した精製されたHDLを分離するために簡略化された方法を開発しました。...

高度に精製された高密度リポタンパク質からのmiRNAのハイスループット分離のための高速かつ簡便法

このレポートでは、中古増幅の有無、定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたプラズマ miRNA の絶対レベルを測定するためのプロトコルについて説明します。このプロトコル プラズマ miRNAs...

定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたカニクイザルにおける血中マイクロ Rna の絶対定量

マイクロ Rna (Mirna) は、メッセンジャー Rna (Mrna) の転写調節因子として、短いと高い相同性の RNA シーケンスです。現在の miRNA 検出方法は、感度と特異度で変わる。In situハイブリダイゼーションや免疫染色マウス心臓ティッシュ セクションのマイクロ Rna...

マウス心臓のセクションを使用してその場で交配で発現組織固有の miRNA

がん患者からの血漿サンプル マイクロ Rna (Mirna) の循環の表現のレベルを評価するためのプロトコルを提案します。特に、マイクロ Rna 抽出および逆のトランスクリプションを循環させるため市販のキットを使用しました。最後に、斑点を付けられた前のリアルタイム プローブ カスタム プレートを使用して 24 選択した Mirna...

転移性大腸癌患者における循環マイクロ Rna カスタム パネルの検出

このプロトコルでは、ダイバージェントプライマーを使用して細胞内の環状RNA(circRNA)レベルを正確に定量するためのデジタルドロップレットPCR(dd-PCR)の詳細な方法について説明します。...

デジタル液滴PCRを用いた環状RNAの定量

急性心筋梗塞（AMI）のラットモデルでは、心臓の病態生理学的および生理学的機能に関するMIの結果を研究するのに便利です。...

ラットにおける急性心筋梗塞

学ぶデジタルPCRを用いた循環miRNAの定量法。血清サンプルからmiRNAを抽出し、絶対定量で心血管疾患のバイオマーカーとしての有効性を検証する正確なプロトコルです。

急性心筋梗塞と心血管疾患のマイクロ Rna を循環の定量化デジタル PCR

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