急性心筋梗塞と心血管疾患のマイクロ Rna を循環の定量化デジタル PCR

この方法は、マイクロRNAが心血管疾患の有効なバイオマーカーであるかどうかなど、診断分野における重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。定量的リアルタイムPCRと比較して、デジタルPCRは、循環中のマイクロRNAを定量するための優れた技術的品質を示します。サンプルは約 20, 000 個の液滴に分割されるため、重複測定は不要で、定量化に標準曲線も必要ありません。

この方法は、心血管患者におけるマイクロRNAの定量化に関する洞察を提供する可能性がありますが、他のマイクロRNAが癌進行のバイオマーカーとして有望であることが示されているため、他の患者や疾患にも適用できる可能性があります。一般に、この方法に不慣れな人は、生成された液滴が壊れやすく、注意して取り扱う必要があるため、苦労します。血清サンプルからRNAを単離した後、逆転写を続行して、dPCR用のより安定した相補的DNAを取得します。

まず、逆転写キットを氷上で解凍します。次に、酵素とプライマーをスピンダウンします。次に、テキストプロトコルで説明されているようにマスターミックスを準備します。

10マイクロリットルのマスターミックスと5マイクロリットルの抽出RNAを96ウェルプレートの各ウェルで組み合わせます。次に、プレートを摂氏4度で2,000xgで2分間遠心分離します。テキストプロトコルに詳述されているように、逆転写を続行します。

まず、市販のdPCRミックス、cDNAおよびPCRプライマーを氷上で解凍し、使用直前に遠心分離します。次に、テキストプロトコルで説明されているようにマスターミックスを準備します。1.33マイクロリットルの容量の逆転写産物を18.67マイクロリットルの容量のマスターミックスに加え、短時間遠心分離します。

ピペットを使用して、20マイクロリットルのサンプルを8ウェルカセットの中列の各ウェルに移します。次に、70マイクロリットルの液滴発生オイルをカセットのオイルウェルにピペットで移します。次に、カセットの上にガスケットを置き、液滴発生器に入れます。

液滴発生器を閉じ、3つのインジケーターライトが緑色に点灯するまで待ちます。ピペットを使用して、液滴形成されたサンプルの40マイクロリットルを96ウェルプレートの別々のウェルに慎重に移します。次に、プレートをdPCRホイルで摂氏180度で4秒間シールします。

密封されたPCRプレートをサイクラーに置き、テキストプロトコルに概説されているサイクリング指示に従ってください。プレートをサーモサイクラーから取り外し、プレートホルダーのベースに移します。次に、プレートホルダーの上部をPCRプレートに置きます。

最後に、商用dPCRソフトウェアを起動します。このプロトコルでは、デジタルPCRを使用して、心血管疾患患者の血清中のマイクロRNAを定量しました。サンプルは、経皮的介入前、経皮的介入の8時間後、および16時間後に16人の患者から採取されました。

ST上昇型心筋梗塞の患者は、安定した冠動脈疾患の患者と比較して、miR-499レベルの有意な増加を示しました。この手法を習得すると、正しく行えば、96サンプルの液滴形成に約1時間で完了します。この手順を試みるときは、飛沫の取り扱いに注意することが重要です。

このビデオを見れば、正しい液滴形成、サイクリング、読み取り、分析など、デジタルPCRを正しく行う方法について十分に理解できるはずです。