電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cの定量のための高感度で特異的な定量法

この手順の全体的な目標は、血清サンプル中の心筋ミオシン結合タンパク質Cと心筋トロポニンIを同時に定量することです。これは、最初に96ウェルプレートを心筋ミオシン結合タンパク質C抗体でコーティングしてプレックスアッセイを行うか、または事前にコード化されたthreeplexアッセイを使用することによって達成されます。第2ステップでは、コーティングされたプレートをキャリブレーターおよび血清サンプルとインキュベートします。

次に、最終ステップで標識検出抗体を添加し、化学発光シグナルを産生し、これをプレートリーダーで検出します。最終的に、血清サンプル中に存在する目的の心臓タンパク質のレベルは、単一または多重のイムノアッセイによって決定できます。実験の前日、ゼラチンフリーマウスモノクローナル抗心筋ミオシン結合タンパク質C抗体を96ウェル味噌スケールの裸の標準プレートの各ウェルの下隅に30マイクロリットルピペットで固定します。

次に、プレートの側面を軽くたたいて、抗体溶液を各ウェルの底に広げます。密封後、プレートを振らずに摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、溶液をシンクの上からペーパータオルの山に軽くたたいます。

次に、PBS中の1%ブロッカーAを150マイクロリットルずつ各ウェルに加え、非特異的結合をブロックします。ブロッキングステップ中に700RPMで振とうしながら、室温で1時間密封したプレートをインキュベートし、組換え心筋ミオシン結合タンパク質CフラグメントをPBS中の1%ブロッカーAで開始濃度2000ナノグラム/ミリリットルに希釈します。次に、この溶液を 5 倍に連続希釈して、合計 7 つの標準試料に希釈します。

次に、示したようにブロッキング溶液を取り出し、PBSで0.05%tween 20の150マイクロリットルでプレートを3回洗浄します。3回目の洗浄後、シンクの上でプレートを勢いよくフリックし、完全に乾くまでペーパータオルの層でプレートをしっかりとたたきます。次に、各標準液とサンプルを25マイクロリットルを適切なウェルにピペットで移します。

次に、密封されたプレートを室温で1時間シェーカー上でインキュベートしながら、スルoagで標識したカスタムメイドの心筋ミオシン結合タンパク質C検出抗体をPBS中の1%ブロッカーAに1ミリリットルあたり1マイクログラムに希釈します。今示したようにプレートを慎重に洗浄した後、各ウェルに25マイクロリットルの検出抗体溶液を加え、インキュベーション期間中に振とうしながら室温で1時間密封したプレートをインキュベートし、LEDライトでデモプレートを動かしてセクターイメージャーの適切な機能を確認し、ソフトウェアがこの時点でもリードバッファーを希釈します。前に示したようにプレートを慎重に洗浄した後、マルチチャンネルピペットを使用して、気泡を避けながら各ウェルに150マイクロリットルのリードバッファーを追加し、スリープレックスアッセイを開始する前にすぐにセクターイメージャーでプレートをスキャンします。

96ウェルのスリープレックスプレートと希釈液を室温まで平衡化させます。次に、PBS中の1%ブロッカーAを25マイクロリットルをプレートに加え、ウェル全体が溶液で覆われていることを確認し、密封されたプレートを室温で30分間振とうしながらインキュベートします。その間に、組換え心筋ミオシン結合タンパク質C-C-K-M-Bと心筋トロポニンIをPBS中の1%ブロッカーAで一緒に希釈して、心筋ミオシン結合タンパク質C1ミリリットルあたり2000ナノグラム、CKMB1ミリリットルあたり100ナノグラム、心筋トロポニン1ミリリットルあたり25ナノグラムを含む標準品を作成します。

次に、この混合物を5倍にして、PBS中の1%ブロッカーAを使用して、各標準希釈サンプルに対して少なくとも100マイクロリットルの最終容量まで2回連続希釈します。次に、標準とサンプルの2 25マイクロリットルの技術的な複製を、3つのプレックスプレートのウェルにすでに存在するブロッキングバッファーの25マイクロリットルに加え、密封されたプレートを振とうしながらインキュベートした後にのみ希釈剤のブランクを含め、3つのSUL oag検出抗体を一緒に希釈して、2時間後に1%溶液ブロッカーAおよびPBSでそれぞれ1ミリリットルあたり1マイクログラムの最終濃度にします。示したようにプレートを洗浄し、マルチチャンネルピペットを使用してそれぞれに25マイクロリットルの検出抗体溶液を加えます。

インキュベーション期間中、700 RPMで振とうしながら、密封されたプレートを1時間十分にインキュベートします。デモプレートを実行し、示したようにReidバッファーを希釈します。次に、PBSで0.05%tween 20でプレートを洗浄した後、マルチチャンネルピペットを使用して、気泡を避けて各ウェルに150マイクロリットルのリードバッファーを追加し、すぐにセクターイメージャーでプレートをスキャンします。

この図では、プレックスアッセイにおける心筋ミオシン結合タンパク質Cの標準曲線と、スプレックスアッセイにおける心筋ミオシン結合タンパク質Cの標準曲線を比較しています。どちらのアッセイも、非常に高い感度と高いダイナミックレンジを示しています。アッセイの検出領域は、プレックスと3プレックスの両方で灰色で表示されます。

心筋ミオシン結合タンパク質Cの標準曲線は同様です。検出下限、定量下限、および定量上限レベルは、プレックスアッセイとスリープレックスアッセイの両方で同等です。これらのグラフは、スリープレックスプレートの心筋トロポニンIおよびCKMB標準曲線を示しています。

どちらのキャリブレータも高感度と広いダイナミックレンジを示しました。アッセイの検出領域は灰色で表示されます。検出抗体と他の2つのキャリブレーターとの交差反応性は、3つのキャリブレーターすべての個々の標準曲線を単一の検出抗体でインキュベートすることによって研究されました。CKMBキャリブレーターと心筋トロポニンIおよび心筋ミオシン結合プロテインC検出抗体との間にはわずかな交差反応性のみが見られました。

他のキャリブレーターと検出抗体との間に交差反応性は観察されなかったものの、このアッセイが心損傷の検出に適用可能であることを証明するものとして、心筋梗塞の被験者16人の血清レベルを、心筋ミオシン結合タンパク質C-C-K-M-Bと心筋トロポニンの3つのプレックスプレート血清レベルを用いて対照群と比較しました。私は、心筋梗塞の患者では、対照群と比較して、3つのバイオマーカーすべてが増加していると判断しました。