Name: 電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cの定量のための高感度で特異的な定量法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶ 電気化学発光免疫測定法による血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cと心臓トロポニンIの高感度定量法。マルチプレックスアッセイで心筋梗塞の診断精度を向上させる臨床応用を探索する。

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11PRE7240022（氏Barefield）と13POST14720024（博士ゴヴィンダン）、本研究では、健康補助R01HL105826とK02HL114749（博士Sadayappan）とアメリカ心臓協会中西部フェローシップの国立研究所によって資金を供給された。作者は感謝してアッセイを開発する上で、その優れた技術とサポートのための文学博士のジミー·ペイジ、ジルClampitとドクタージョンハドソン、MSD、の支援を認める。

1。 Uniplex cMyBP-Cアッセイ<ol><li>実験前日、コート捕捉抗体と96ウェルMSD裸標準プレート。 cMyBP-Cの場合は、リン酸緩衝食塩水（PBS）で希釈した5μgの/ mlの濃度でマウスモノクローナル抗cMyBP-C抗体（ゼラチン無料）30μlのボリュームを使用しています。 </li><li> 、疎水性であるため、井戸の底の隅にソリューションをピペットで、次に全体を優に超えるソリューションを広めるために、プレートの側面をタップします。 </li><li>プレートは、プレートシーラーで覆い、振とうせずに4℃でO / Nインキュベートする。 </li><li>シンクの上にして、ペーパータオルのスタック上にソリューションをタップして、捕捉抗体溶液を除去。プレートへの非特異的結合を各ウェルに、PBS中の5％（w / v）のブロッカー（ハイグレードBSA）溶液を150μlを添加することにより遮断される。 </li><li> 700 rpmで振とうしながら室温で1時間、プレートとインキュベートを封印。 </li><li>ブロッキングステップの間、基準とsを準備amples。 1％（w / v）のブロッカー/ PBSで2,000 ngの/ mlでの出発濃度に - 換えcMyBP-Cタンパク質断片（271アミノ酸1）を希釈することによって標準のシリーズを作る。次いで、直列1％（w / v）のブロッカー/ PBSで5倍に希釈する。 7規格の合計+ 1ブランク（1％（w / v）のブロッカー/ PBS単独）を用いた。 </li><li>ブロッキング溶液を取り出し、150μlの0.05％（v / v）のTween-20/PBSで3回プレートを洗浄。たびに、シンク上反転プレートによって洗浄溶液を除去。第三の洗浄ステップの後、精力的にシンク上のプレートをフリックして、それが完全に乾燥するまで、ペーパータオルの層の上に積極的にプレートをなでる。インキュベーション体積が小さいので、これは重要なステップであり、残りの洗浄溶液が大幅次のインキュベーションを希釈する。 </li><li>ウェルに基準やサンプルのピペット25μlの。 1時間700rpmで振とうしながら、室温でプレートとインキュベートを封印。 </li><li> 1％ブロッカー/ PBSで1μgの/ mlで検出抗体溶液を準備します。 CUMSDスルホ-TAG標識検出抗体として働くと - STOMはcMyBP-C抗体（14エピトープのアミノ酸2）を作った。キットは、任意の抗体を標識するための比較的簡単な手順で作り、スルホ-TAGの標識に利用可能です。 </li><li>ステップ1.4で説明したように洗浄工程を繰り返します。 </li><li> 、各ウェルに検出抗体溶液25μlの追加プレートを密封し、シェーカーは700rpmでセットプレート上で1時間室温でインキュベートする。 </li><li>潜伏期間中は、セクターイメージャとソフトウェア（試薬の項を参照）の適切な機能を確保するために、MSDのデモプレート（LEDライトが付いているプレート）を実行します。また、15リードバッファ4倍mlの蒸留水5mlを添加することにより、MSDによって提供され、読み取りバッファを希釈する。 </li><li>ステップ1.4で説明したように洗浄工程を繰り返します。 </li><li>マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに読み取りバッファー150μlのを追加します。気泡（リバースピペッ​​ティングが適切な方法である）を回避してください。読み取りバッファの添加後、直ちに分野におけるプレートをスキャンイメージャ。 </li></ol> 2。 3プレックスcMyBP-C、CK-MB、およびcTnIのアッセイ<ol><li> 96ウェル-3 - プレックス板と希釈溶液は、使用前に室温に平衡化させている。このプレートは、MSDによるcMyBP-C、CK-MB、およびcTnIのための捕捉抗体で予めコーティングされている。 </li><li>各ウェルに1％（w / v）のブロッカー/ PBS25μlのを追加します。全体をうまくが溶液で覆われていることを確認するために、プレートの側面をタップします。 </li><li>プレートシーラーでプレートをシールし、プレートシェーカー上にプレートを置き、30分間700rpmで振る。 </li><li>その間に、個々のカリブレータの希釈系列を調製する。各ウェル3捕捉抗体を持っているので3キャリブレータは混合されると、連続的に使用する前に希釈する必要があります。 2,000 ngの/ mlのcMyBP-C、100 ngの/ mlの一つのサンプルを作成するために1％を一緒に換えcMyBP-C、CK-MB（MSD）、およびcTnIの（MSD）（w / v）のブロッカー/ PBSを希釈CK- MB、および25 ngの/ mlのcTnIの（サンプル）。 </li><li>少なくとも100μlの最終体積は、各規格のために準備される。へスタンダードシリーズを完了し、順次サンプルが5倍に希釈している。試料を25μl使用100μlの1％（w / v）のブロッカー試料Cを作成するために、100μlの1％（w / v）のブロッカー/ PBSで、サンプルBを25μl使用その後、試料Bを作成する/ PBSでなどが挙げられる。 MIの16科目と16の対照被験者からのヒト血清サンプルをcMyBP-C、CK-MB、およびcTnIのレベルを測定するために使用された。これらのサンプルを1％（w / v）のブロッカー/ PBSで2倍希釈した。 </li><li> 3プレックスプレートのウェル内に既に存在する25μlに25規格の添加および希薄化後のサンプルを追加します。また、空白にして（希釈剤のみ）を含めることが重要です。技術を確立するために、サンプルは技術的三連でロードされる。それ以外の場合は、重複で十分です。 </li><li>再びプレートをシール（プレートシーラーを再利用できる）、2時間室温でプレートシェーカー（700 rpm）でのインキュベート。 </li><li>インキュベーションが完了する直前に、検出抗体溶液を調製する。使用される希釈剤は、PBS中1％（w / v）の遮断薬である。すべてTHReeのSULFO-タグ検出抗体は、1μgの/ mlの各々の最終濃度に一緒に希釈する。検出抗体は、典型的には50倍のストック濃度に設けられている。 </li><li>フル96ウェルプレートの場合は、合計希釈液の2,700μlを（エラーが含まれているピペッティングで）必要とされる。 2,538μlの1％（w / v）のブロッカーPBS /に各検出抗体54μLを加える。 </li><li> 2時間後、精力的にシンク上プレートをフリックでソリューションを削除します。のTween-20、PBS中の0.05％150μlのウェルに3倍を洗ってください。ウェルマルチチャンネルピペットを用いて各検出抗体溶液25μlを添加し、プレートの側面が全体ウェル溶液で覆われていることを確認するためにタップされている。 </li><li>プレートを密封し、700rpmで振とうしながら1時間インキュベートする。 </li><li>潜伏期間中は、セクターイメージャとソフトウェアの適切な機能を確保するために、MSDのデモプレート（LEDライトが付いているプレート）を実行します。またの4倍の読み取り5ミリリットルを追加することで、MSDによって提供される読み取りバッファー、希釈15ミリリットルの蒸留水にバッファ。 </li><li>ステップ2.8で説明した洗浄手順を繰り返します。 </li><li>よくマルチチャンネルピペットを用いてそれぞれに読み取りバッファー150μlのを追加します。気泡を避けることが重要です（リバースピペッ​​ティングは、適切な方法である）。読み取りバッファーを添加した後、直ちにセクターイメージャでプレートをスキャン。 </li></ol>

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</ol>

人間の体液にcMyBP-Cの劣化やリリースに関連するリスク要因を決定するために：完全特許出願（05/04/12。出願番号464分の13、466、パブ号米国2012/0282618 A1と日付）保留されているおよびヒト体液中cMyBP-Cのレベルを定量する。

本研究では、患者からの血清中の複数の心臓のバイオマーカーの検出のためのマルチプレックスイムノアッセイの適用可能性を示しています。この技術は、伝統的なELISA比べて数多くの利点を有する。まず、アッセイキットでECLを比色検出の代わりに使用されている。 ECLにおいて、電気信号は、このような背景14を減少させる信号から刺激イベントを切り離す、測定された特性（光）の現地生産を刺激する。これは、 表2に見られるように、高感度を可能にする。 アッセイを多重化すると、 図2及び表2に見られるように、cMyBP-Cを検出するための感度の損失をもたらさない。 uniplexで測定cMyBP-Cは、CK-MBとcTnIの13で同時に測定cMyBP-Cに匹敵する感度と検出範囲を示した。同時測定は、実質的measuremenに必要な試料の量を減らす希少生物試料と同様、複数uniplexアッセイを実行に費やす時間を減らすことで作業する際の重要な要因となりうるT...

血清などの複雑な生物学的サンプル中のタンパク質の少量の測定は、患者管理のための成長臨床的重要性、並びに​​基礎科学である。例えば、このようなトロポニンなどの心臓マーカーの血清レベルの増加は、私は、臨床で急性心筋梗塞（MI）1と一致する。それは、高感度を有しており、検体の絶対的定量を可能にするような血清試料中のタンパク質を検出するために、標準的な酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）は、最も頻繁に使用される技術である。しかしながら、従来のELISA法では、試料の比較的多量（典型的には100μl）を必要とするいくつかの生物学的液体中の高バックグラウンド信号を有し、ELISA 2ごとに1つだけの検体の測定に制限される。 最近では、新しい免疫測定技術は、これらの欠点の多くを回避することを導入されました。この修​​正されたアッセイは、MSDが開発した、electrochemiluminescを使用しています少量のサンプル量の使用を可能にする、非常に低いバックグラウンドおよび感度の向上を可能にする信号検出用リファレンス（ECL）。電気化学発光を検出抗体に添付されたレポーター分子ルテニウム（II）trisbipyridal、に基づいています。このレポーター分子は、それら3に一体化炭素電極を有する96ウェルプレートの底部の電気的な刺激により620nmで発光する。また、スポットコーティングを使用することによって、複数の捕捉抗体は、単一の試料4中の異なるタンパク質の同時定量を可能にする、1つのウェル（96ウェルプレート上で10まで）に塗布することができる。この技術は、近年、血清5,6の炎症性サイトカインプロファイルを測定するために使用されている。 MSDから多重プレートは他のマルチプレックスアッセイプラットフォームに好意的に7を比較します。 主要なアッセイプラットフォームとしてMSD使用して、我々はさらに3プレックスプレートCそのカスタムメイドを開発同時に心臓ミオシン結合タンパク質-C（cMyBP-C）、クレアチンキナーゼMB（CK-MB）、および心臓トロポニンI（cTnIの）のレベルを定量化し、その結果をcMyBP-Cのモノプレックス検出と比較した。 CK-MBとcTnIのはMIのための十分に確立されたバイオマーカーである。しかし、これらのバイオマーカーの増加はMI、 例えば心筋炎または腎不全8以外の病態が原因で発生することができます。これは、MI診断の特異性を増大させる付加的なバイオマーカーの付加のために主張している。我々は、最近cMyBP-Cはまた、MI 9の潜在的なバイオマーカーであることが示されている。 cMyBP-Cは心臓、10-12でなく、骨格または平滑筋に発現しているタンパク質を関連付け太いフィラメントです。このように、循環系におけるcMyBP-Cの増加レベルは、心臓障害13の具体的な指標である。 本研究では、血清レベルのを測定するためのカスタム3プレックスアッセイの使用とcMyBP-Cのuniplex検出を比較したMI患者の血清中cMyBP-C、CK-MB、およびcTnIの。将来的には、この署名技術は、緊急治療室での胸痛を呈する患者で心筋梗塞を診断するために使用されるかもしれません。 ロヨラ大学シカゴの機関審査委員会（IRB）はdeidentifiedヒトサンプルの使用とイムノアッセイの使用（LU＃20392）のための研究を承認した。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>MSD Read-Buffer T (4X) with Surfactant</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>R92TC-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>トゥイーン-20</td><td>アクロス</td><td>9005-64-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MSDブロッカーA</td><td>メソスケールディスカバリー</td><td>R93BA-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水、10X</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399-4</td><td>フィルター使用前に</td></tr><tr><td>ミオシン結合タンパク質C抗体、マウスモノクローナル(E7)、ゼラチンフリー</td><td>サンタクルス</td><td>SC-137180L</td><td>コーティングの場合、抗体はゼラチンフリー</td></tr><tr>である必要があります<td colspan="4">Plates and Equipment</td></tr><tr><td>Multi-Array 96ウェル標準プレート</td><td>メソスケール</td><td>ディスカバリーL15XA-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>プロトタイプの3プレックス、4スポット、96ウェルプレート、cMyBP-C、cTnI、CK-MB</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>N452A-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>サーマシールシーリングフィルム</td><td>ライフサイエンスプロダクツ株式会社</td><td>ST-3098</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MSD SECTOR Imager 2400A</td><td>メソスケールディスカバリー</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MTS 2/4 デジタルマイクロタイターシェーカー</td><td>IKA</td><td>3208001</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-cの定量のための高感度で特異的な定量法

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

バイオマーカーだけでなく、基礎科学、意思決定の臨床でますます重要になってきています。診断心筋梗塞（MI）は、主に心筋障害の指標として患者の血清または血漿中の心臓特異的タンパク質を検出することによって駆動される。心臓ミオシン結合タンパク質-C（cMyBP-C）はMI後に血清中で検出可能であることが最近示されたので、我々は、MIの可能性バイオマーカーとして提案している。バイオマーカーは、典型的には、従来のサンドイッチ酵素免疫アッセイによって検出される。しかし、この技術は、大規模なサンプル量を必要とする小さいダイナミックレンジを有しており、同時に複数のタンパク質を測定することができる。 ここでは、3つの心臓タンパク質を高感度で同時に測定することができる多重イムノアッセイを示す。クレアチンキナーゼMBや心筋トロポニンとともにuniplexでcMyBP-Cを測定するか、または私が同等の感度を示した。この手法は、メソスケールディスカバリーを使用しています検出のための電気化学発光と組み合わせる96ウェルプレートに多重化（MSD）メソッド。わずかなサンプル量が必要とされているが、高感度、広いダイナミックレンジが得られる。このテクニックを使用して、我々はcMyBP-C、クレアチンキナーゼMB、および心筋トロポニンMIと16科目からの血清サンプル中の私はレベルを測定し、16対照被験者と比較を行った。我々は、これらのサンプルのすべての3つのマーカーを検出することができたとMI後に増加するすべての3つのバイオマーカーを発見した。この技術は、したがって、血清サンプル中の心臓マーカーの高感度検出に適している。

3 -プレックスアッセイの基本的な原理およびワークフローを図1に示し、全体的なワークフローを表1に記載されている。 Uniplexアッセイは、底面全体が1つのウェル捕捉抗体で被覆されていることを除いて同じ原理に沿って動作する。信号検出は、電気信号​​がウェルの底部に適用したECLによって行われる。これは、順番に、検出抗体にSULFO-TAGラベルを読み取りバッファの化学反応を通る光の現地生産を開始する。これは、低バックグラウンドおよびアッセイの高感度につながる。 図2では、uniplexアッセイにおけるcMyBP-Cの標準曲線は、3プレックスアッセイにおいてcMyBP-Cのそれと比較される。両方のアッセイは、非常に高感度、高ダイナミックレンジを示す。検出レベルと定量化レベルは、 表2に示し、uniplexおよび3 -プレックスアッセイの両方に匹敵するている。 cTnIのとCK-MBの検出レベルは、ALSであるoが図3<...

複雑な生体試料中のバイオマーカーの測定はますます意思決定臨床指導されています。私たちは、同時に心臓ミオシン結合タンパク質C、クレアチンキナーゼMB、および心筋梗塞と健常者の被験者からの血清サンプル中の心筋トロポニンIを測定する高感度な方法を説明します。

電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cの定量のための高感度で特異的な定量法

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

本手順の全体的な目的は、血清サンプル中の心筋ミオシン結合タンパク質Cおよび心筋トロポニンIを同時に定量することである。これは、まず、プレックスアッセイ用に96ウェルプレートを心筋ミオシン結合タンパク質C抗体でコーティングするか、またはあらかじめコード化されたスリープレックスアッセイを使用することによって達成される。第2ステップでは、コーティングしたプレートをキャリブレーターおよび血清サンプルとともにインキュベートする。最終ステップで標識検出抗体を添加すると、化学発光信号が発生し、これをプレートリーダーで検出します。最終的に、血清サンプル中に存在する目的の心臓タンパク質のレベルを、シングルまたはマルチプレックス免疫測定法によって決定できます。実験の前日に、96ウェルMeso Scale Discovery標準プレートの各ウェルの底隅に、ゼラチンフリーのマウス心筋ミオシン結合タンパク質C抗体（モノクローナル）を30 µLピペッティングします。次に、プレートの側面を軽く叩き、抗体溶液を各ウェルの底に広げます。密閉後、4 °Cで振盪せずに一晩インキュベートします。翌朝、溶液をシンクへ、続いてペーパータオルの山の上に叩き出して除きます。次に、非特異的結合をブロックするため、各ウェルにPBSで調製した1%blocker Aを150 µL加えます。ブロッキング工程の間、プレートを密閉し、700 RPMで振盪しながら室温で1時間インキュベートします。一方、リコンビナント心筋ミオシン結合タンパク質C断片を、PBSで調製した1%blocker Aを用いて、開始濃度2000 ng/mLに希釈します。その後、この溶液を5倍段階希釈し、計7段階の標準液を調製します。先ほど示したようにブロッキング液を除去し、次に0.05%tween 20含有PBS 150 µLでプレートを3回洗浄します。3回目の洗浄後、プレートをシンクに向けて勢いよく振り、その後、ペーパータオルの上にプレートを強く押し当てて完全に乾かします。次に、各標準試料およびサンプル 25 µLを、適切なウェルにピペッティングします。次に、密封したプレートをシェーカーで室温にて1時間インキュベートしている間に、sul oagで標識した特製心筋ミオシン結合タンパク質C検出抗体を、1% blocker A含有PBSを用いて1 µg/mLに希釈します。先ほど示した方法でプレートを慎重に洗浄した後、各ウェルに検出抗体溶液を25 µLずつ加え、密封したプレートを室温で1時間インキュベートします。その際、インキュベーション中はシェーカーで撹拌してください。また、セクターイメージャーとソフトウェアが正常に機能しているか確認するため、LEDライトを用いてデモプレートを走らせ、同時にRead Bufferの希釈も行います。前述の方法でプレートを慎重に洗浄した後、マルチチャンネルピペットを使用して、気泡が入らないように注意しながら、各ウェルに150 µLのRead Bufferを加えます。その後、スリープレックスアッセイを開始する直前に、セクターイメージャーでプレートをスキャンします。96ウェル・スリープレックスプレートと希釈溶液を室温に戻します。次に、PBS溶解1%ブロッキング剤Aを25 µLプレートに分注し、ウェル全体が溶液で覆われていることを確認して、プレートを密閉し、振盪しながら室温で30分間インキュベートします。その間に、リコンビナント心筋ミオシン結合タンパク質C、CK-MB、および心筋トロポニンIをPBS溶解1%ブロッキング剤Aで共希釈し、心筋ミオシン結合タンパク質Cが2000 ng/mL、CK-MBが100 ng/mL、心筋トロポニンが25 ng/mLとなる標準液を調製します。次に、この混合液をPBSに含まれる1% blocker Aを用いて、各標準希釈試料について最終的に少なくとも100 µLとなるまで5倍段階希釈を2回行います。続いて、3-plexプレートのウェルに既に分注してある25 µLのブロッキングバッファーに、標準試料およびサンプルを25 µLずつ2連（テクニカルレプリケート）で添加します。この際、希釈液のみのブランクも含めてください。密閉したプレートを振盪しながらインキュベートした後、3種類のSUL oag検出抗体を、1% solution blocker AおよびPBSを用いて、それぞれ最終濃度1 µg/mLになるように合わせて希釈します。2時間後、先ほど示した方法でプレートを洗浄し、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに25 µLの検出抗体溶液を添加します。密封したプレートを、インキュベーション期間中700 RPMで振盪しながら1時間インキュベートします。デモプレートを使用し、先ほど実演した通りにReidバッファーを希釈してください。その後、0.05% Tween 20含有PBSでプレートを洗浄し、マルチチャンネルピペットを用いて、気泡が入らないように各ウェルに150 µLのReidバッファーを分注し、直ちにセクターイメージャーでプレートをスキャンします。この図では、plexアッセイにおける心筋ミオシン結合タンパク質Cの標準曲線と、three plexアッセイにおける心筋ミオシン結合タンパク質Cの標準曲線が比較されています。どちらのアッセイにおいても、非常に高い感度と広いダイナミックレンジが示されています。plexおよびthree plexの両アッセイにおける検出領域が灰色で表示されています。心筋ミオシン結合タンパク質Cの標準曲線は同様の結果を示しています。検出下限、定量下限、および定量上限のレベルは、プレックスアッセイとスリープレックスアッセイの両方で同等です。これらのグラフは、スリープレックスプレートにおける心筋トロポニンIおよびCKMBの標準曲線を示しています。どちらのキャリブレーターも高い感度と広いダイナミックレンジを示しました。アッセイの検出領域は灰色で表示されています。検出抗体と他の2つのキャリブレーターとの交差反応性を調べるため、3つすべてのキャリブレーターの個別の標準曲線を単一の検出抗体のみでインキュベートしたところ、CKMBキャリブレーターと、心筋トロポニンIおよび心筋ミオシン結合タンパク質Cの両方の検出抗体との間で、わずかな交差反応性のみが認められました。他のキャリブレーターと検出抗体の間で交差反応は観察されず、心損傷の検出に対する本アッセイの適用性が証明されました。心筋梗塞患者16名と対照群における血清レベルを、心筋ミオシン結合タンパク質C（cMyBPC）、CK-MB、および心トロポニンIの3項目を測定するマルチプレックスプレートを用いて比較しました。その結果、対照群と比較して、心筋梗塞患者ではこれら3つのバイオマーカーすべてが上昇していることが判明しました。

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生物学

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学ぶ 電気化学発光免疫測定法による血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cと心臓トロポニンIの高感度定量法。マルチプレックスアッセイで心筋梗塞の診断精度を向上させる臨床応用を探索する。

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