電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cの定量のための高感度で特異的な定量法
2013年8月8日
複雑な生体試料中のバイオマーカーの測定はますます意思決定臨床指導されています。私たちは、同時に心臓ミオシン結合タンパク質C、クレアチンキナーゼMB、および心筋梗塞と健常者の被験者からの血清サンプル中の心筋トロポニンIを測定する高感度な方法を説明します。
この手順の全体的な目標は、血清サンプル中の心筋ミオシン結合タンパク質Cと心筋トロポニンIを同時に定量することです。これは、最初に96ウェルプレートを心筋ミオシン結合タンパク質C抗体でコーティングしてプレックスアッセイを行うか、または事前にコード化されたthreeplexアッセイを使用することによって達成されます。第2ステップでは、コーティングされたプレートをキャリブレーターおよび血清サンプルとインキュベートします。
次に、最終ステップで標識検出抗体を添加し、化学発光シグナルを産生し、これをプレートリーダーで検出します。最終的に、血清サンプル中に存在する目的の心臓タンパク質のレベルは、単一または多重のイムノアッセイによって決定できます。実験の前日、ゼラチンフリーマウスモノクローナル抗心筋ミオシン結合タンパク質C抗体を96ウェル味噌スケールの裸の標準プレートの各ウェルの下隅に30マイクロリットルピペットで固定します。
次に、プレートの側面を軽くたたいて、抗体溶液を各ウェルの底に広げます。密封後、プレートを振らずに摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、溶液をシンクの上からペーパータオルの山に軽くたたいます。
次に、PBS中の1%ブロッカーAを150マイクロリットルずつ各ウェルに加え、非特異的結合をブロックします。ブロッキングステップ中に700RPMで振とうしながら、室温で1時間密封したプレートをインキュベートし、組換え心筋ミオシン結合タンパク質CフラグメントをPBS中の1%ブロッカーAで開始濃度2000ナノグラム/ミリリットルに希釈します。次に、この溶液を 5 倍に連続希釈して、合計 7 つの標準試料に希釈します。
次に、示したようにブロッキング溶液を取り出し、PBSで0.05%tween 20の150マイクロリットルでプレートを3回洗浄します。3回目の洗浄後、シンクの上でプレートを勢いよくフリックし、完全に乾くまでペーパータオルの層でプレートをしっかりとたたきます。次に、各標準液とサンプルを25マイクロリットルを適切なウェルにピペットで移します。
次に、密封されたプレートを室温で1時間シェーカー上でインキュベートしながら、スルoagで標識したカスタムメイドの心筋ミオシン結合タンパク質C検出抗体をPBS中の1%ブロッカーAに1ミリリットルあたり1マイクログラムに希釈します。今示したようにプレートを慎重に洗浄した後、各ウェルに25マイクロリットルの検出抗体溶液を加え、インキュベーション期間中に振とうしながら室温で1時間密封したプレートをインキュベートし、LEDライトでデモプレートを動かしてセクターイメージャーの適切な機能を確認し、ソフトウェアがこの時点でもリードバッファーを希釈します。前に示したようにプレートを慎重に洗浄した後、マルチチャンネルピペットを使用して、気泡を避けながら各ウェルに150マイクロリットルのリードバッファーを追加し、スリープレックスアッセイを開始する前にすぐにセクターイメージャーでプレートをスキャンします。
96ウェルのスリープレックスプレートと希釈液を室温まで平衡化させます。次に、PBS中の1%ブロッカーAを25マイクロリットルをプレートに加え、ウェル全体が溶液で覆われていることを確認し、密封されたプレートを室温で30分間振とうしながらインキュベートします。その間に、組換え心筋ミオシン結合タンパク質C-C-K-M-Bと心筋トロポニンIをPBS中の1%ブロッカーAで一緒に希釈して、心筋ミオシン結合タンパク質C1ミリリットルあたり2000ナノグラム、CKMB1ミリリットルあたり100ナノグラム、心筋トロポニン1ミリリットルあたり25ナノグラムを含む標準品を作成します。
次に、この混合物を5倍にして、PBS中の1%ブロッカーAを使用して、各標準希釈サンプルに対して少なくとも100マイクロリットルの最終容量まで2回連続希釈します。次に、標準とサンプルの2 25マイクロリットルの技術的な複製を、3つのプレックスプレートのウェルにすでに存在するブロッキングバッファーの25マイクロリットルに加え、密封されたプレートを振とうしながらインキュベートした後にのみ希釈剤のブランクを含め、3つのSUL oag検出抗体を一緒に希釈して、2時間後に1%溶液ブロッカーAおよびPBSでそれぞれ1ミリリットルあたり1マイクログラムの最終濃度にします。示したようにプレートを洗浄し、マルチチャンネルピペットを使用してそれぞれに25マイクロリットルの検出抗体溶液を加えます。
インキュベーション期間中、700 RPMで振とうしながら、密封されたプレートを1時間十分にインキュベートします。デモプレートを実行し、示したようにReidバッファーを希釈します。次に、PBSで0.05%tween 20でプレートを洗浄した後、マルチチャンネルピペットを使用して、気泡を避けて各ウェルに150マイクロリットルのリードバッファーを追加し、すぐにセクターイメージャーでプレートをスキャンします。
この図では、プレックスアッセイにおける心筋ミオシン結合タンパク質Cの標準曲線と、スプレックスアッセイにおける心筋ミオシン結合タンパク質Cの標準曲線を比較しています。どちらのアッセイも、非常に高い感度と高いダイナミックレンジを示しています。アッセイの検出領域は、プレックスと3プレックスの両方で灰色で表示されます。
心筋ミオシン結合タンパク質Cの標準曲線は同様です。検出下限、定量下限、および定量上限レベルは、プレックスアッセイとスリープレックスアッセイの両方で同等です。これらのグラフは、スリープレックスプレートの心筋トロポニンIおよびCKMB標準曲線を示しています。
どちらのキャリブレータも高感度と広いダイナミックレンジを示しました。アッセイの検出領域は灰色で表示されます。検出抗体と他の2つのキャリブレーターとの交差反応性は、3つのキャリブレーターすべての個々の標準曲線を単一の検出抗体でインキュベートすることによって研究されました。CKMBキャリブレーターと心筋トロポニンIおよび心筋ミオシン結合プロテインC検出抗体との間にはわずかな交差反応性のみが見られました。
他のキャリブレーターと検出抗体との間に交差反応性は観察されなかったものの、このアッセイが心損傷の検出に適用可能であることを証明するものとして、心筋梗塞の被験者16人の血清レベルを、心筋ミオシン結合タンパク質C-C-K-M-Bと心筋トロポニンの3つのプレックスプレート血清レベルを用いて対照群と比較しました。私は、心筋梗塞の患者では、対照群と比較して、3つのバイオマーカーすべてが増加していると判断しました。
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概要
本記事では、血清試料中の心疾患バイオマーカーを同時に測定するための高感度な手法を紹介します。特に心筋梗塞に関連して、心筋ミオシン結合タンパク質C、クレアチンキナーゼMB、および心筋トロポニンIに焦点を当てます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 循環器内科
- バイオマーカー測定
- 臨床診断
背景
- バイオマーカーは、臨床における意思決定において極めて重要な役割を果たします。
- 心タンパク質の測定は、心筋梗塞の診断に有用です。
- 既存の手法では、感度や特異度が不足している場合があります。
- 本研究は、心バイオマーカーの検出能を向上させることを目的としています。
研究目的
- 心筋ミオシン結合タンパク質Cおよび心筋トロポニンIを定量する方法を開発すること。
- 患者および健康対照者の血清サンプルにおけるこれらのタンパク質レベルを評価すること。
- 心筋梗塞の診断精度を向上させること。
使用した手法
- 心筋ミオシン結合タンパク質C抗体による96ウェルプレートのコーティング。
- キャリブレーターおよび血清試料を用いたインキュベーション。
- 化学発光信号を生成するための標識検出抗体の添加。
- 解析のためのシングルまたはマルチプレックス免疫測定法の利用。
主な結果
- 血清試料中の心疾患バイオマーカーの定量に成功。
- 心筋梗塞検出における本アッセイの感度を実証。
- 患者と健常対照群におけるバイオマーカーレベルの比較。
- 臨床現場における本手法の有効性の検証。
結論
- 開発された手法は、心疾患バイオマーカーを測定するための信頼性の高いアプローチを提供します。
- 本手法は、心筋梗塞の臨床評価に大きく寄与することが可能です。
- 今後の応用として、より広範な臨床診断や研究への活用が期待されます。
よくある質問
産業界における重要性
本手法により、血清中の心疾患バイオマーカーの高感度かつマルチプレックスな検出が可能となり、心筋損傷の早期かつ正確な評価が支持されます。cMyBP-CをCK-MBおよびcTnIと共に定量することで、心血管系治療薬開発におけるターゲット検証のためのバイオマーカーパネルの信頼性が向上します。電気化学発光プラットフォームは、最小限のサンプル量で高い感度と広いダイナミックレンジを提供し、前臨床およびトランスレーショナル研究のワークフローを促進します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 複数のバイオマーカーを同時に測定することで、心機能障害経路の解析が可能になります。
- 運用の価値： 1つのウェルで3つのタンパク質をマルチプレックス化することにより、サンプル消費量とアッセイ時間を削減します。
- 予測的価値： 定量的で再現性のあるリードアウトを提供し、心血管標的バリデーションにおける標的への信頼性の向上とメカニズム的なリスク低減をサポートします。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： アッセイの適格性評価およびスクリーニングへの適用に適した、標準化された定量的なバイオマーカー読み取り値を生成する。
- 運用上の価値： ハイスループットな96ウェルフォーマットに対応したMSD電気化学発光プラットフォームを使用する。
- 拡張性： 一貫した化合物評価のために、プレックスおよびスリープレックス構成全体で再現可能な標準曲線の作成を可能にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな継続性：cMyBP-C、CK-MB、およびcTnIにおける心筋梗塞（MI）誘発性の変動を検出することで、バイオマーカー測定による発見から前臨床検証への橋渡しを行います。
- 疾患関連システム：ヒト血清サンプルを使用し、MI後の臨床的に重要なバイオマーカーの動態を反映させます。
- リスク調整済み推進：傷害モデルにおけるターゲットへの結合およびパスウェイ調節を確認することで、go/no-go判断を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期の仮説検証からリード化合物の最適化、そしてメカニズムの検証に至るまで、バイオマーカーの測定を可能にし、創薬探索から前臨床に至る一連の流れに適合します。
- 探索生物学：損傷モデルにおけるバイオマーカー放出量を定量化することで、パスウェイの解明およびターゲットバリデーションを支援します。
- スクリーニング：心損傷パスウェイに対する化合物の影響を評価するため、アッセイにそのまま利用可能な再現性のある定量的な出力を提供します。
- 分析：定義されたLLOQおよびULOQを持つ化学発光ベースの定量リードアウトを提供し、条件間の比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：臨床的な心筋梗塞（MI）の呈示を反映したヒト血清中のバイオマーカー変化を検出することで、前臨床段階との整合性を確保します。
- エンタープライズ再利用：探索プロジェクト全体で利用可能な、心血管バイオマーカーパネルのための再利用可能な免疫測定プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 心損傷バイオマーカーの特異的かつ感度の高い検出により、予測の信頼性を向上させる。
- 運用上の価値： 標準化、少量のサンプル量での実施、およびマルチプレックス検出能力を確保する。
- 戦略的価値： バイオマーカーパネルの信頼性を向上させ、ターゲット検証アッセイにおける偽陰性を減少させる。
- ポートフォリオへの影響： 損傷モデルにおけるオンターゲットな生物学的活性を確認することで、リスク層別化に基づいた開発推進を可能にする。
実施上の留意点
- イムノアッセイの最適化および電気化学発光検出に関する専門知識が必要である。
- MSDセクターイメージャーおよびプレートリーダーのインフラストラクチャに依存する。
- 施設間で標準化されたブロッキング、洗浄、およびインキュベーションプロトコルが必要となる。
- 抗体ペアのバリデーションを行うことで、他の心疾患または非心疾患バイオマーカーにも適応可能である。
- 抗体の入手可能性および、経験的な試験を必要とする潜在的な交差反応性によって制限される。
