Name: 光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（アオコ緑膿菌）フローサイトメトリーを使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーと分子プローブを用いたシアノバクテリアの細胞死判定プロトコル。Microcystis aeruginosaを用いて生理状態をリアルタイムで解析し、微生物群集の動態理解に貢献する最適化手法を習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、研究施設のための支援と資金調達のための博士課程の学生デイブハートネルとボーンマス大学を承認したいと思います。

分子プローブおよびフローサイトメーターの作製<ol><li>超純濾過H 2 Oに必要な濃度のアリコートにジメチルスルホキシド（DMSO）中の5 mM溶液として供給されている核酸プローブのストック溶液を希釈</li><li> 25°Cの使用まで- -5°Cの間の暗いところでの核酸プローブを保管してください。 </li><li>フローサイトメーターおよびロード・ソフトウェア・パッケージ（FCM仕様のための材料/機器の表を参照）をオンにします。 </li><li>試料注入プローブ（SIP）の空の溶血チューブ（12×75 mm）を置いて、邪魔を除く、その後FCM洗浄プロセスを開始するためにフラッシュバックをクリックします。 注 ：SIPのためのいくつかのサンプルステージはマイクロ遠心チューブなどのチューブのいくつかのタイプを収容することができます。 FCM装置に用いられる分子プローブの希釈剤とシース液は分析グレード「タイプ1」、0.22μmのメンブレンフィルターのソースからです。 </li><li>場所15分と速いために、流体の速度（または&gt; 66マイクロリットル/分の流速） - SIPの超純フィルタリングの H 2 O 2 mlの新鮮な溶血管は、10の時間制限を設定します。 </li><li>新しいデータセルを選択し、バックグラウンドノイズを低減し、「実行」をクリックする蛍光および光散乱チャネルに関連したしきい値に置きます。 </li><li>秒あたりの総イベントは、製造業者の推薦の下にない場合は、高速で2分間の除染液2mlのサンプルを実行して、手順1.4＆1.5を繰り返します。 注 ：彼らはモデル間で変化させることができるよう、FCM起動クリーニングプロトコルについては、メーカーの推奨事項を確認してください。特定のしきい値のテストはまた、いくつかの機器は、ユーザは、光検出器から記録された電気信号を増強または減少する光電子増倍管（PMT）に電圧ゲインを適用することを可能にするようFCMモデルに沿ったものであることが必要です。このexperiで使用されるFCMモデルメントは、電圧のPMTを固定し、2.0ミクロンと電子ノイズよりも小さな粒子を除外80,000前方光散乱（FSC-H）のしきい値を使用しています。 </li></ol>文化と初期細胞数の調製<ol><li> 120 O℃で20分間、250mlビーカー中で藻類メディア（X50濃度）の超高純度フィルタH 2 Oおよび2ミリリットルのオートクレーブ98ミリリットル</li><li> SIPの下のチューブにサンプル2mlの高い定常状態密度代わりにM.aeruginosa（PCC 7806）の初期のモノカルチャーから。ボルテックスまたは超音波処理20により任意のコロニー形成を脱凝集し、光学顕微鏡を通して均等に分散した細胞を確認します。 注 ：超音波への過度の露出は、細胞溶解につながることができますし、注意して使用する必要があります。 （M.aeruginosaのような種に見られるような）超音波処理は、側方光散乱（SSC-H）の強度として出力をよりSEになることができるガスの小胞を折りたたむことができますので、nsitive。 </li><li> FCMソフトウェアの中では、前方光散乱（FSC-H）からのデータを記録し、軸に対数スケールで表示するには、「ログイン」をクリックして、プロットの仕様を設定するには、ヒストグラムプロットを選択します。 </li><li>別の出力では、このようなアクセサリ光合成色素フィコシアニン（FL4-H、675±12.5 nm）のM.aeruginosaで見つかった、などの自然蛍光を記録する（軸をログ）別のヒストグラムを選択します。 </li><li>フィコシアニンと得られる蛍光からの排出量をフィルタリングすることができる検出器を励起することができる光源を使用してください。 注 ：フィコシアニンは、600 nmでオーバー励起され、唯一の赤色光源21で検出されるのに対し、このようなクロロフィルなどの光合成色素は、一般的に使用される488nmの青色レーザーで励起することができます。ここでは、励起光源のためのフローサイトメーターのメーカーと発光検出器のスペクトルに確認してください両方488 nmおよび640 nmのレーザーを一緒に使用されました675±12.5 nmの光学フィルタ。 </li><li>標的生物（10ミクロン）のコアサイズと比較的遅い流速（14μL/分）に最も近い最高の解像度を選択した設定を記録するために。 注 ：最高の解像度のサンプルについては、1秒あたりのイベント勧告を製造しているに応じて実行する必要があります。 </li><li>データ取得は、ゲートに電子バックグラウンドノイズまたは細胞サンプルの破片によって引き起こされる光散乱および/または蛍光シグナルをしきい値を使用する前に。 </li><li>新しいデータセルを選択し、ログスケールのFSC-HおよびSSC-Hのパラメータを持つ密度プロットを作成して実行]をクリックします。 </li><li>サンプル密度が過剰イベント率につながる場合、希釈工程は、正確さと精度を高めるために取ることができます。 </li><li>密度プロットでは、バックグラウンドノイズやゴミ（FSC &lt;32万）によって製造される低レベルの散乱信号を除外するために、前のヒストグラムからソフトウェアゲートを適用します。逆にゲートより高い相対蛍光フィコシアニン細胞からの信号だけでは、これらのイベント（ - 1,950,000 FL4、56000）が挙げられます。 </li><li>ゲートされた領域に記録する細胞の数を使用し、1mlあたりどのように多くのセルを動作させるには、FCMを通過した試料の全容量で割り。 注 ：ここで使用されるFCMモデルは、試料体積を決定することを可能にするマイクロプロセッサ制御蠕動ポンプシステムを有しています。他のFCM装置を較正ビーズ懸濁液又は全試料容量を確認するためにH 2 O重量/体積の差の計算を必要とするかもしれません。 </li><li> M.aeruginosaのバッチ増殖サイクル（250,000細胞/ mlで）を開始するために新たに調製した培地に細胞の必要量を加えます。 注 ：種はそうバッチサイクルがライフサイクルの位相を決定するために、事前に記録されるべきであるそれらのインサイチュー環境パラメータおよび栄養素利用可能性に応じて成長速度が異なるであろう。 </li></ol> 3.のOptim分子プローブの細胞取り込みの化<ol><li> M.aeruginosa文化の収穫の半分は対数期から、ステップ2で調製し、「ライブ」コントロールとして使用します。 注 ：ストレート指数期に高密度培養物から希釈されたサンプルは、初期の遅れ/誘導期から接種した培養物のそれに比べて、死んだ細胞のターンオーバーを介して最適化の結果に影響を及ぼす可能性があります。 </li><li> 1時間、パラホルムアルデヒドまたは30分6,11,22のための4％ホルムアルデヒド、60°Cの時に、このような70％エタノール、加熱サンプルのような方法を使って、「死んだ」コントロールとして残りの半分を準備します。サンプルの微小環境の変化（ 例えば 、pH値）を確認してください。 注 ：M.aeruginosaで陽性、熱殺菌された、「死んだ」制御フィコシアニン信号での減少を通じ「ライブ」のサンプルとは区別されます。他の方法により死亡率を誘導することは、同じ出力を発生させません。VARます種のY。 </li><li>異なる比を使用して混合試料を設定する「ライブ」および「死んだ」サンプル（ 例えば 、0％、25％、50％、100％）。 </li><li>ボルテックスまたは超音波処理によって、コロニー形成を脱凝集し、pHを確認してください。 </li><li> 488 nmの緑色（FL1、530±15 nm）のからの蛍光を記録することができ、検出器と一緒にレーザーとオレンジ（FL2、585±20 nm）の核酸プローブとそれぞれの検出器をフィコシアニン信号を記録する640 nmのレーザーを選択します。 注 ：DNAに結合すると、オレンジ色の核酸プローブは、570 nmで547 nmおよび放射極大励起波長を有する一方で、緑の核酸プローブは、523 nmで504 nmおよび発光最大値のおおよその蛍光励起波長を有します。 488nmのアルゴンイオン固体レーザが両方の分子プローブを励起するために使用することができる、しかし、（547ナノメートルまで）緑色レーザは、より高いオレンジ色の蛍光を生成します。 </li><li>出発点として、ご紹介メーカーとの分子プローブは、50％の「ライブ」50％「死んだ「文化への濃度を推奨し、暗闇の中でインキュベートします。 </li><li>新しいデータセルを選択し、バックグラウンドノイズ（FSC-H 80,000）削減するしきい値とトリガーとSIPの下にサンプルを配置します。 </li><li> FSC-HおよびSSC-Hパラメータ、および3つのヒストグラムと密度プロットを作成します。フィコシアニンの排出量（FL4-H）と他のFSC-H、すべてのログスケールで検出するために、それぞれの分子プローブの光検出器チャンネル（FL1または2）、1つを使用して1つのヒストグラム。 </li><li>時点（1、5、10、15、30および60分）の数で、別のデータセルに記録し、最大60分間、暗闇の中で核酸プローブとM.aeruginosaのサンプルをインキュベートします。 注 ：特定の化学物質からの潜在的な反応のために製造して例えばpHチェックなどのパラメータを調整するとき（テスト核酸ためのバッファがリン酸または一価または歌姫の高いレベルを含めることはできませんプローブDNAとの結合が減少されるように）、陽イオンを貸し。 </li><li>それぞれの蛍光プローブチャネルヒストグラムに、セルサイズの生物標的に対して - のみFSC-Hヒストグラム（150万32万）を含むようにソフトウェアゲートを適用します。 注意 ：このプロトコルで使用される濃度はM.aeruginosa試料または核酸プローブの初期ストック溶液の体積を増加または減少のいずれかによって変更することができ0.05、0.1、0.5、1、5、10、50および100μMでした。 </li><li>蛍光プローブチャネルでは、ヒストグラムの最高ピークに別の包括的なソフトウェアゲートを適用（緑FL1-H 24万 - 165万、オレンジFL2-H 30,000 - 165,000）、続いてゲートそのポジティブプローブ蛍光密度プロットに。 </li><li>分子プローブの濃度（例えば、x〜0.1×10）、および/または温度およびpHレベルを必要に応じて調整し、100％の「ライブ」、100％の「死んだ &#39;とすべての混合培養試料で3.11 - を実行して、3.1を繰り返します。 </li> &lt;LI&gt;核酸で染色した細胞の合計割合を見つけるために、（合計の半分のFSC-Hまたは100％ &#39;死んだ「文化から取られた）「死んだ」細胞の元の細胞密度に正の分子プローブの蛍光シグナルの数を比較プローブ。 </li><li>非特異的な染色（一方向ANOVAまたはクラスカル・ウォリス検定で手段を使用を生じることなく、細胞の核酸プローブの取り込みの割合が最も高いのための最適なプロトコルを見つけるために、各濃度内の各時間帯のためにこれを行い、データは、ノンパラメトリックである場合）。 </li></ol> 4.分子プローブの蛍光差別<ol><li>真性または非特異的な細胞染色からの蛍光干渉/重複のテストのために50％の「ライブ」50％「死んだ」混合培養データを選択して、すべてのゲートを脱ぎます。 </li><li>フィコシアニンに、標的生物の細胞の大きさのために - FSC-Hヒストグラム（150万32万）にのみ含まれるようにソフトウェアゲートを適用しますチャネルヒストグラム。 </li><li>門「死んだ」とラベルされた最低のピークを追加した「ライブ」として最高フィコシアニンピークとラベル、。 </li><li>平均波長の両方を記録し、一度に一つ、「ライブ」、次に「死んだ」フィコシアニン（FL4）信号を使用して、それぞれの分子プローブの蛍光ヒストグラムチャネルにさらにゲートステップを実行します。 注記 ：この実験では死亡率を誘導するためのモードは、このプロトコルの下で明らかにフィコシアニン信号を減少させる熱処理によって行われました。 「死んだ」細胞の集団を産生する他の方法は、取得した実行で異なる出力をもたらすことができます。 </li><li>比プラスの分子プローブの蛍光（ &#39;死んだ&#39;）および固有/非固有の信号（「ライブ」）の平均波長は、プロトコルの感度を決定します。 注：「ライブ」と「死んだ」populの蛍光識別を改善するために、ationsは、細胞壁の透過性、得られる蛍光信号6を改善するために栄養枯渇細胞又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）で活性染色取り込みの炭素源を増加させます。スペクトル重複のためのいくつかのFCMモデルで限定補償はサンプル取得（PMT電圧が変化する）の間または後分析専用ソフトウェアからのユーザー操作ペアごとの補正によって行うことができます。 </li><li> 「死んだ」細胞の最高額が発生非特異的な染色せずに染色された最適化されたプロトコルを選択します。テストの数は、同様の結果を持っている場合は、良好な蛍光信号識別とともに、最低濃度およびインキュベーション時間でプロトコルを受け入れます。フォローサイトメーターはシャットダウン手順のための指示を製造しています。 </li></ol>

<ol><li>Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+Activity+in+Readily+Culturable+Bacteria%3A+A+Review+and+Discussion+of+the+Practical+Issues%5BTitle%5D)+AND+%22Anton.+Leeuw.+Int.+J.+G%22%5BJournal%5D)">Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues.</a> Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).</li>
<li>Adams, D. G., Duggan, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tansley+Review+No.+107.+Heterocyst+and+Akinete+Differentiation+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria.</a> New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).</li>
<li>Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Physiological+Heterogeneity+in+Microbial+Population+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior.</a> Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).</li>
<li>Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Nutrient-Replete+Microcystis.+PCC+7806+Cultures+is+Inhibited+by+an+Extracellular+Signal+Produced+by+Chlorotic+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures.</a> Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).</li>
<li>Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+Microbial+Viability+Using+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).</li>
<li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life%2C+Death%2C+and+In-Between%3A+Meanings+and+Methods+in+Microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microb%22%5BJournal%5D)">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li>
<li>Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+Flow+Cytometry%22">Practical Flow Cytometry</a>. , 273-410 (2003).</li>
<li>Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-Cytometric+Total+Bacterial+Cell+Counts+as+a+Descriptive+Microbiological+Parameter+for+Drinking+Water+Treatment+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes.</a> Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past%2C+Present+and+Future+Applications+of+Flow+Cytometry+in+Aquatic+Microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology.</a> Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).</li>
<li>Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Flow+Cytometry+of+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria.</a> Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).</li>
<li>Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Applicability+of+Fluorescent+Vitality+Probes+on+Phytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton.</a> J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).</li>
<li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Viability+and+Antibiotic+Susceptibility+Testing+with+SYTOX+Green+Nucleic+Acid+Stain%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).</li>
<li>Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Senescence+and+Death+in+Emiliania+huxleyi.+and+Thalassiosira+pseudonana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Staining%2C+Chlorophyll+Alterations%2C+and+Dimethylsulfoniopropionate+%28DMSP%29+Metabolism.+Limnol.+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana.</a> Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).</li>
<li>Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+SYTOX+Green+Stain+for+Bacterial+Viability+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).</li>
<li>Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Activity+and+Membrane+Integrity+Changes+in+Microcystis+aeruginosa.-+New+Findings+on+Hydrogen+Peroxide+Toxicity+in+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria.</a> Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).</li>
<li>Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Experimentally+Generated+Turbulence+on+the+Mash01+Unicellular+Microcystis+aeruginosa+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain.</a> Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).</li>
<li>Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Microcystin+production+in+the+Cell+Cycle+of+Microcystis+viridis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+toxicol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis.</a> Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).</li>
<li>Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Control+of+HAB+Species+using+Low+Biosurfactant+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+Algae%22%5BJournal%5D)">On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations.</a> Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).</li>
<li>Bouchard, J. N., Purdie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Elevated+Temperature%2C+Darkness%2C+and+Hydrogen+Peroxide+Treatment+on+Oxidative+Stress+and+Cell+Death+in+the+Bloom-Forming+Toxic+Cyanobacterium+Microcystis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis.</a> J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).</li>
<li>Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+Natural+Microcystis+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Phycol.+J%22%5BJournal%5D)">Enumeration of Natural Microcystis Populations.</a> Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).</li>
<li>Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarie%2C+D+%22Algal+culturing+techniques%22">Algal culturing techniques</a>. Andersen, R. A. , Academic press. 253-268 (2005).</li>
<li>Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+method+for+the+assessment+of+the+minimal+inhibitory+concentrations+of+antibacterial+agents+to+Mycoplasma+agalactiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae.</a> Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).</li>
<li>Davey, H. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting+of+Heterogeneous+Microbial+Populations%3A+The+Importance+of+Single-Cell+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+rev%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses.</a> Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).</li>
<li>Franklin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explaining+the+Causes+of+Cell+Death+in+Cyanobacteria%3A+What+Role+for+Asymmetric+Division%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plankton+Res%22%5BJournal%5D)">Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division?</a> J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).</li>
<li>Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+Physiological+Heterogeneity+within+Starved+Cultures+of+Micrococcus+luteus.+by+Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).</li>
<li>Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaggoner%2C+A+%22Flow+cytometry+and+sorting%22">Flow cytometry and sorting</a>. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. , 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).</li>
<li>Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Sleeping+Beauty%22%3A+Quiescence+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">"Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).</li>
<li>Keer, J. T., Birch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+for+the+Assessment+of+Bacterial+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability.</a> J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。

15,19,22,23 -分子プローブを使用して出版物の増加した数は、信頼性が高く、有益なデータが5,6,8を得ることができることを示しています。まだのと同じ濃度およびインキュベーション時間6,10を持つすべての種にわたって有効であることができる細胞の生存率には完璧な汚れがありません。変更された蛍光発光を有するプローブであっても同じタイプが正しい濃度およびインキュベーション時間（表1＆3）を確立する必要性を示しています。このプロトコルを使用するときに見られるように、オレンジ色の核酸プローブの最適な濃度及びインキュベーション時間は緑、核酸プローブは、半分の濃度を必要とするのに対し、1μMで10分間であるが、3倍の時間（ 図5および6）をとります。 1.0μM以上の濃度でこれらの細胞非透過性シアニンモノマーの両方が非膜損傷細胞とスペクトル排出量の重複を生成するために始めました。 SIのこの重なりgnalsは「ライブ」細胞は分子プローブを取っている場合は...

細胞は常に生理的パラメータを変更し、その機能を変化させることにより環境に応答する複雑なシステムです。 3 -同質遺伝子の微生物集団の個体群動態自然の中で、実験の両方が比較的一定の環境条件下でさえ1を発生する、亜集団の発展によって影響されます。自然の微生物群集の多様性は、環境条件の非常に可変性に起因して生じます。これら時々確率過程はその後、人口の平均に非常に異なっている部分集団を生成します。最近の証拠は、これらの生理学的な亜集団は、環境条件に異なった反応をし、劇的に影響し、全体的な人口の3,4に影響を与えるシグナル化合物または阻害剤を産生することができることを明らかにしました。 集団内の異質性を定義するための方法を確立することは、国連への鍵ですなどなどアナベナなどの種は異質のような特殊化した細胞を開発し、環境変動に応じて、形態学的不均一性を示す人間の水の安全保障に大きく影響を与える。有毒アオコなど、様々な環境での微生物の生態をderstandingと迷惑シアノバクテリアの知識を構築する際に不可欠ですそして、akinetes 2。これとは対照的に、 アオコ細胞は、ストレス応答の間に明らかな形態学的な不均一性を表示しません。実行可​​能と非生存細胞との区別は、生理的分化の最も重要な側面であり、微生物の個体群動態をよりよく理解することができます。しかし、細菌の生存率そのものの概念の問題は難しいと特徴付けが乏しい1,5,6のまま。 フローサイトメトリー（FCM）は、個々の細胞を分析の信頼性が高く、迅速な方法です。単一細胞生理の理解を高めるためにFCMスルーでれっと、分子プローブは、代謝および生化学的プロセス7の数を区別するために使用されてきました。これは、携帯電話や人口レベルでの種の増加の知識につながったし、今度は水資源管理8,9を支援してきました。しかし、生物は、分子プローブ設計およびプロトコル実装6,10,11の数につながっている携帯壁や膜中の細孔やポンプ、に分子プローブの取り込みと排出の点で異なります。商業用および研究目的のために利用可能な分子プローブは、しばしば、非常に異なる細胞型にも適用可能である一般的なプロトコルを用いて供給されています。一つは、別の6に一つの細胞型のために開発されたプロトコルを転送するのに非常に慎重でなければならない、それは、したがって、効果的に使用する前に分子プローブを最適化するために不可欠な作業です。 緑とオレンジの核酸プローブは、最小限のベースとのダブルと一本鎖核酸の両方に結合し選択ivityとは、細胞の原形質膜の完全性を評価するために使用されます。緑色の核酸プローブは、また、細胞生存率の指標として機能することができるヨウ化プロピジウム系化合物12のような他の分子プローブに比べて著しく改善された細胞標識蛍光シグナルを有します。ここで用語「細胞生存率は、「DNA分解は、原形質膜完全性の喪失後に発生することを想定しています。核酸プローブは、3つの正電荷を有する非対称シアニン色素であり、真核生物の11,13および原核生物14,15の両方で、特徴づけられた濃度の下で、無傷の膜を有する細胞を入力することはできません。核酸に核酸プローブの結合は、それらの膜完全性が損なわれている細胞における内因性信号からの蛍光発光の&gt; 500倍の増加までをもたらすことができます。このような緑色の核酸プローブとして分子プローブは、単一の細胞生理学の良い指標となることができますが、必要性のトンがありますだけではアオコの実験では0.5μM15 - - 0.1μMから30分であり、濃度範囲- 19インキュベーション時間は7分まで変化させてきたように、O、目的の標的生物に各プローブを最適化します。 ここでは、緑のサイトメトリーアッセイと（これまでにシアノバクテリア種M.aeruginosa上でテストされていない）比較的新しいオレンジ色の核酸プローブを最適化するためのプロトコルを提示します。次の発展の方法は、他の種に移し、それによって微生物およびそれらの生態行動の理解を増加させる他の分子プローブでプロトコルを最適化するためのプラットフォームとして使用することができます。

<table><tbody><tr><td>シアノバクテリア培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3061-500ML</td><td>BG-11 淡水濃縮溶液 (x50希釈)</td></tr><tr><td>除染液</td><td>BD Biosciences 653155</td><td></td><td>出力が高速または流量66 & マイクロで毎秒12イベントを超える場合、2分間実行します。l/min.&nbsp;続いて、シース H2O を 2 分間使用します。</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td>ご要望に応じて</td><td>BD Accuri C6</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>核酸染色剤 &ndash; DMSO 中の 5 mM 溶液</td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S11368</td><td>核酸染色剤 &ndash; DMSO 中の 5 mM 溶液</td></tr></tbody></table>

光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（<em&gt;アオコ緑膿菌</em&gt;）フローサイトメトリーを使用して

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

微生物分野での亜集団と実験室での研究は、形態学的および生理学的パラメータに高い不均一性を示すことが示されてきました。微生物が細胞分裂および代謝活性が低下していることにより休眠状態で存在することができるように微生物細胞のリアルタイムの状態を決定することは、生死のカテゴリーを超えました。微生物の検出および定量化の必要性を考えると、分子プローブを用いたフローサイトメトリー（FCM）は、集団全体の生存率を決定するのを助けるために迅速かつ正確な方法を提供します。膜の完全性を検出するためのモデルシアノバクテリアのMicrocystis aeruginosaのでSYTOX緑とSYTOXオレンジを使用することにより、我々は単一細胞死亡率の急速な適応のための譲渡方法を開発。 actioの同等のモードを有する類似の励起波長および発光波長を有する他の製品があるが、このジャーナル内で使用される分子プローブは、（それぞれ緑またはオレンジ核酸プローブと称しますnは、我々は、具体的に前面に参照）プローブを述べました。分子プローブを使用したプロトコルは濃度およびインキュベーション時間で、主に異なる、種間で変動します。 M.aeruginosaに出るこのプロトコルに続いて緑の核酸プローブは、10分後に1μMで30インキュベーションの分とオレンジの核酸プローブの後、0.5μMの濃度で最適化しました。両方のプローブで述べた最適未満の濃度は、膜の損傷による細胞の下に報告につながりました。逆に、両方のプローブで5μMの濃度と高いが「非生存」細胞数の過剰表現につながる、「ライブ」細胞が標的の蛍光を生成することにより非特異的な染色の種類を示しました。ポジティブコントロール（加熱殺菌）コントロールの生成の妥当性が議論の対象に残るものの、検証可能な死んだバイオマスを提供しました。我々はデ・緑とオレンジの核酸プローブを最適化するためのステップの論理的順序を実証することにより、効果的にシアノバクテリアの生理学的状態を分析するために使用できるプロトコルを作成する方法monstrate。

対数期におけるM.aeruginosaのバッチ培養からの前方光散乱（FSC）および側方光散乱（SSC）出力は、それぞれのセルの大きさ（直径）と内部粒度に関する情報（ 図1A）を提供します。 FSCはM.aeruginosaことには大きすぎるおよび/ ​​または小である細胞を識別することができます。この差別またはゲーティングはFSC出力（ 図1C）の特定の点の間の精錬データによって行うことができます。赤色光源によって問い合わせたときフィコシアニンは、M.aeruginosa光合成装置の主要な構成は、強い信号を生成する（例：640; EM：675±12.5 nm）のFSCで行われたものと同様、さらにゲート集団に使用することができ、ゲーティングが、蛍光を発する（ 図1D）。 FSCと蛍光信号から、データは、fに対するM.aeruginosa上の特定のデータに元の出力（ 図1A）</stron...

微生物集団は、全体的な動作を決定することができる実質的な細胞の不均一性を、含まれています。フローサイトメトリーを介して、分子プローブ分析は、細胞の生理的状態を決定することができ、しかし、そのアプリケーションは、種間で変化します。本研究では、偽陽性の結果を過小評価または記録することなく、正確にシアノバクテリアの集団内の細胞の死亡率を決定するためのプロトコルを提供します。

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

本手順の目的は、フローサイトメトリーと分子プローブを用いて、シアノバクテリアの生理学的状態を効果的に分析できるプロトコルの作成方法を提示することです。このプロトコルは、微生物コミュニティの細胞生理に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手順の主な利点は、最適化された蛍光プローブプロトコルを用いることで、個々の細胞レベルでのシアノバクテリアの生理学的状態をリアルタイムで区別できることです。この手順の実演は、ボーンマス大学のサイトメトリー研究室で研究を行っている博士課程の学生、David Hartnellが行います。実験を開始する前に、空の溶血チューブをサンプル注入プローブにセットしてください。「unclog（詰まり解消）」をクリックします。その後、バックフラッシュを行い、フローサイトメトリーの洗浄プロセスを開始します。バックフラッシュの終了後、2 mLの超純水フィルター水を満たした新しい溶血管をサンプル注入プローブ（SIP）にセットし、制限時間を10〜15分に、流速を「速い（fast）」に設定します。次に、新しいデータセルを選択し、背景ノイズを低減させるために、適切な蛍光および光散乱の閾値を設定します。次に、「run」をクリックします。1秒あたりの総イベント数がメーカーの推奨値より少ない場合は、除染溶液2 mLを「fast」設定で2分間流します。その後、バックフラッシュと超純水によるフラッシングの手順を繰り返します。M.aeruginosaの一次単一培養物を調製するため、250 mLビーカーに超純水ろ過水98 mLと藻類培地2 mLを混ぜ合わせ、120 °Cで20分間オートクレーブ滅菌します。培養物が高密度の定常状態に達したら、2 mLの細胞をボルテックスで分散させます。その後、細胞をサンプル注入プローブの下に移動させます。光学顕微鏡を用いて、細胞が均一に分散していることを確認します。次に、フローサイトメーターのソフトウェアでヒストグラムプロットを選択し、前方散乱光（FSC）データを記録します。そして、「log」をクリックして、x軸を対数スケールで表示します。別の出力ウィンドウで、M.aeruginosa細胞の自然蛍光を記録するために、もう一つの対数軸ヒストグラムを設定します。次に、フィコシアニンを励起できる光源と、それによって生じる蛍光の放出光をフィルタリングできる検出器を選択します。最高解像度で記録するには、標的生物のコアサイズに最も近い設定を選択してください。そして、比較的低速の流速に設定します。データを取得する前に、電子的なバックグラウンドノイズや細胞サンプルのデブリによって生じる光散乱および蛍光信号を除外するためのしきい値を設定してください。その後、新しいデータセルを選択します。前方散乱光と側方散乱光のパラメータを対数スケールで密度プロットとして作成し、「run」をクリックします。次に、前方散乱光および自然蛍光ゲートを前方散乱光対側方散乱光のデータに適用し、低レベルの散乱信号を除外して、相対的に高い蛍光フィコシアニン信号のみを抽出します。その後、サンプルの測定が終了するまでイベントを収集し、そのデータを用いて初期細胞数を決定します。分子プローブの細胞取り込みを最適化するため、あらかじめ調製した単層培養の半分を、死細胞コントロールを作成するための適切な条件にさらします。サンプルの微小環境における変化を確認し、培養細胞の死滅を確認してください。その後、先ほど実演した通りにコロニー形成を分散させます。次に、488 nmのレーザーと、緑色および橙色の核酸プローブからの蛍光を記録できる検出器を選択します。また、640 nmのレーザーを選択し、それぞれの検出器を通じてフィコシアニンの信号を記録します。新しいデータシートで、前方散乱光（FSC）と側方散乱光（SSC）のパラメータを用いた密度プロットを設定します。次に、それぞれの分子プローブ光検出器チャネルを用いてヒストグラムを作成します。フィコシアニンの放出を検出するためのヒストグラムと、前方散乱イベントのためのヒストグラムを、すべて対数スケールで作成してください。濃度の異なるシアノバクテリア試料を用いて、異なるインキュベーション時間で解析を行います。前方散乱光（Forward Scatter）のヒストグラムにおいて、標的生物の細胞サイズのみを含むようにゲートを作成します。そして、それを対応する蛍光プローブチャネルに適用します。次に、その蛍光プローブチャネルにおいて、ヒストグラムの最高ピークを囲むように、もう一つの包括的なソフトウェアゲートを作成します。続いて、対応する陽性プローブの蛍光を密度プロット上でゲートします。蛍光シグナルの数を死細胞コントロールの数と比較し、非特異的な染まりが生じない範囲で、細胞の核酸プローブ取り込み率が最大となる条件を決定します。内在性または非特異的な細胞染色の蛍光干渉（オーバーラップ）をテストする場合は、生細胞50％と死細胞50％を混合した培養データのサンプルを選択してください。そして、蛍光ゲートを解除します。フィコシアニンチャンネルのヒストグラムにおいて、標的生物の細胞サイズに該当する前方散乱（forward scatter）ヒストグラムのみを含むようにゲートを設定します。フィコシアニンの最高ピークと最低ピークにゲートを設定し、それぞれ「生（live）」および「死（dead）」としてラベル付けします。次に、生細胞と死細胞のフィコシアニン信号に個別にゲートを適用し、両方の平均波長を記録します。プロトコルの感度を決定するために、死細胞の陽性分子プローブ蛍光の平均波長と、非特異的な生細胞の固有信号の比を算出します。最後に、非特異的な染色の発生を抑えつつ、死細胞が最大限に染色されている最適化されたプロトコルを選択します。これらのグラフには、対数増殖期のM.aeruginosaバッチ培養における、細胞サイズと内部複雑性を示す代表的な前方散乱光および側方散乱光の出力が表示されています。前方散乱光出力の特定点の間でデータを精査することにより、ゲーティングを行うことができます。フィコシアニンは赤色光源で照射された際に強力な信号を発するため、これを目的の細胞集団をさらにゲートするために利用できます。前方散乱光と蛍光信号に基づき、元の出力データからM.aeruginosaサンプルに関する特定のデータをゲートすることで、最終的な細胞数を算出できます。色素沈着の高い生存コントロールと、色素沈着の低い死細胞コントロールを混合すると、自己蛍光の減少シフトが明確になります。膜が損傷した細胞では、核酸プローブによって追加のシグナルが生成され、これはフローサイトメトリーで観察し、さらにエピ蛍光顕微鏡で確認することができます。生細胞と死細胞の蛍光識別能は、0.05 µMから0.5 µMの濃度範囲では時間経過とともに向上しますが、1 µMから100 µMの濃度範囲では両プローブとも低下します。実際、緑色核酸プローブの最適濃度は0.5 µMであり、インキュベーション時間は30分であると考えられます。オレンジ色の核酸プローブについて、最適な濃度は1 µMであり、10分間インキュベートします。習熟すれば、適切に実施することで、各分子プローブの最適化を1日で完了させることができます。この手順を行う際は、プローブを適切な温度、pH、および遮光条件下という安定した環境で保持することが重要です。この手法の開発により、微生物学分野の研究者が植物プランクトンのコミュニティの不均一性を探索する道が開かれました。ビデオを視聴したことで、フローサイトメトリーと分子プローブを用いて細胞生理学を評価するための最適なプロトコルを開発する方法について、十分な理解が得られたはずです。分子プローブや毒性を持つ生物を取り扱うことは非常に危険を伴うため、本手順を実施する際は、適切な個人用保護具（P.P.E.）の着用や、COSHH（有害物質制御規則）資料を完全に理解することなどの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。

molecular-probe-optimization-to-determine-cell-mortality

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

細胞周期ステージの進行と動態の追跡微妙な変化は、BrdUとヨウ化プロピジウムを経由して全ゲノムDNAを染色した核酸の代謝標識の組み合わせの使用によって達成することができます。このメソッドは、それによって順番に細胞周期の進行に影響を及ぼす非特異的DNA損傷の導入を防止し、サイクリング細胞の化学物質の同期の必要がなくなります。...

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

出典: Chapman, I. J., et al., Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a photosynthetic organism (Microcystis aeruginosa) using Flow Cytometry. J. Vis. 経験。...

フローサイトメトリーを用いた Microcystis aeruginosa の生存率解析

このビデオは、GFP発現トランスジェニックマウスから得られた3D腸オルガノイドのROSレベルを定量化するフローサイトメトリーアッセイを示しています。この方法は、ROS産生に対する試験化合物の有効性を調査するためのin...

酸化ストレスを定量化するためのフローサイトメトリーアッセイ:蛍光プローブを使用して腸管オルガノイドの活性酸素種を定量するアッセイ

生体内の生体分子の研究は、生物学的な文脈における分子機能を理解するために非常に重要です。ここでは、DNAやタンパク質などの蛍光生体分子を生きた微生物に取り込むことができる新しい方法について説明します。蛍光顕微鏡で記録されたin...

エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

光学的に制御された物質は、シグナル伝達経路を研究するための強力なツールです。実験の可能性を広げるために、フローサイトメトリーを用いて光学制御物質をリアルタイムに研究する装置「LED Thermo...

LEDサーモフロー - フローサイトメトリーで光遺伝学を組み合わせます

フローサイトメトリーによる解析は、純粋培養の調査および微生物群集の動態を監視するための貴重な証明されています。それぞれサンプリング データの分析、純粋培養と挑戦の行列のように明確な媒体同様に複雑なコミュニティからの 3...

特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

ここでは、ミュラーグリア細胞(MGC)中の2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブ(DCFH-DA)を用いて細胞活性酸素種(ROS)を検出するための、体系化され、アクセス可能で再現可能なプロトコルを提案する。この方法は、フローサイトメーターを用いて全細胞ROSレベルを定量する。このプロトコルは非常に使いやすく、適切で再現性があります。...

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

細胞培養またはマウス腫瘍モデルにおける化学療法薬によって誘導された老化癌細胞の蛍光フローサイトメトリー定量のためのプロトコルが提示されます。オプションの手順には、共免疫染色、大規模なバッチまたは時点分析を容易にするためのサンプル固定、およびフローサイトメトリーソーティングによる生細胞濃縮が含まれます。...

フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の同定と濃縮のための遠赤色蛍光老化関連β-ガラクトシダーゼプローブ

このプロトコルは、フローサイトメトリーとカウントビーズを使用して、エチジウムブロマイドで標識された細菌胞子を定量化することに焦点を当てています。この方法は、無傷の胞子の表面におけるタンパク質の共有結合を分析するのにも効率的です。...

フローサイトメトリーにおける 枯草菌 胞子の計数と標識解析の改善

ここでは、酵母サンプルにおけるストレス後の生存を定量化するためのプロトコルを提示します。このアッセイでは、原形質膜の完全性を定量するために、SYTO 9 とヨウ化プロピジウム (PI) の 2...

酵母細胞におけるストレス後生存を定量化するためのフローサイトメトリーと組み合わせた最適化されたLIVE/DEADアッセイ

学ぶフローサイトメトリーと分子プローブを用いたシアノバクテリアの細胞死判定プロトコル。Microcystis aeruginosaを用いて生理状態をリアルタイムで解析し、微生物群集の動態理解に貢献する最適化手法を習得できます。

光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（

さらに動画を探す