光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（アオコ緑膿菌）フローサイトメトリーを使用して

この手順の全体的な目標は、フローサイトメトリーと分子プローブを使用して、シアノバクテリアの生理学的状態を効果的に分析できるプロトコルを作成する方法を実証することです。このプロトコールは、微生物群集の細胞生理学に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順の主な利点は、最適化された蛍光プローブプロトコルにより、個々の細胞レベルでシアノバクテリアの生理学的状態をリアルタイムで区別できることです。

この手順を実証するのは、ボーンマス大学のサイトメトリー研究室で働く博士課程の学生であるDavid Hartnellです。実験を開始する前に、空の溶血チューブをサンプル注入プローブにセットします。[unclog] をクリックします。

その後、フラッシュを戻してフローサイトメトリーのクリーニングプロセスを開始します。バックフラッシュの終わりに、2ミリリットルの超純ろ過水を含む新しい溶血チューブをサンプル注入プローブまたはSIPにロードし、制限時間を10〜15分に設定し、流体速度を高速に設定します。次に、新しいデータセルを選択し、関連する蛍光および光散乱閾値を設定して、バックグラウンドノイズを低減します。

次に、[実行] をクリックします。1秒あたりの総イベント数がメーカーの推奨値を下回らない場合は、2ミリリットルの除染液を2分間高速に実行します。そして、バックフラッシュと超純水フラッシングのステップを繰り返します。

一次緑膿菌モノカルチャーを調製するには、98ミリリットルの超高純度ろ過水を2ミリリットルの藻類培地と混合し、250ミリリットルのビーカーで摂氏120度で20分間オートクレーブします。培養物が高定常状態の密度にある場合は、ボルテックスにより2ミリリットルの細胞を分解します。次に、サンプル注入プローブの下に細胞を移します。

細胞が光学顕微鏡で均一に分散していることを確認します。次に、フローサイトメーターソフトウェアでヒストグラムプロットを選択し、前方光散乱データを記録します。また、[ログ] をクリックすると、X 軸上のログ スケールでデータが表示されます。

別の出力で、別の対数軸ヒストグラムを設定して、緑膿菌細胞の自然蛍光を記録します。次に、フィコシアニンを励起できる光源と、結果として生じる蛍光からの放出をフィルタリングできる検出器を選択します。最高解像度で記録するには、対象生物のコアサイズに最も近い設定を選択します。

そして、比較的遅い流量を設定します。データを取得する前に、電子バックグラウンドノイズや細胞サンプルの破片によって引き起こされる光散乱信号や蛍光シグナルをゲートアウトするための閾値を設定します。次に、新しいデータ セルを選択します。

対数スケール上の前方散乱と側面散乱のパラメータを持つ密度プロットを作成し、[実行]をクリックします。次に、前方散乱光散乱ゲートと天然蛍光ゲートを前方サイド散乱データに適用して、低レベルの散乱信号を除外し、相対蛍光の高いフィコシアニンシグナルのみを含めるようにします。次に、サンプルが終了するまでイベントを収集し、そのデータを使用して初期セル数を決定します。

分子プローブ細胞の取り込みを最適化するには、事前に調製したモノカルチャーの半分を、デッドコントロールを生成するための適切な条件にさらします。サンプルの微小環境の変化を確認して、培養物の死を確認します。そして、先ほど示したようにコロニー形成を分解します。

次に、488ナノメートルのレーザーと、緑色とオレンジ色の核酸プローブからの蛍光を記録できる検出器を選択します。そして、それぞれの検出器を通じてフィコシアニン信号を記録するための640ナノメートルレーザー。新しいデータシートで、前方散乱光と側面散乱光のパラメータを使用して密度プロットを設定します。

次に、それぞれの分子プローブ光学検出器チャネルを使用して1つのヒストグラムを作成します。フィコシアニンの放出を検出するための 1 つのヒストグラムと、前方散乱イベントのための 1 つのヒストグラムを、すべて対数スケールで表します。シアノバクテリアサンプルを異なる濃度とインキュベーション時間で分析します。

前方散乱ヒストグラムにゲートを作成して、対象生物の細胞サイズのみのイベントを含めます。そして、それを対応する蛍光プローブチャネルに適用します。次に、蛍光プローブチャンネルで、ヒストグラムの最高ピークに対して別の包括的なソフトウェアゲートを作成します。

次に、対応するポジティブプローブ蛍光を密度プロット上にゲートします。蛍光シグナルの数を、非特異的染色を生じさせない細胞核プローブの取り込みの割合が最も高い死細胞コントロール細胞の数と比較します。内因性細胞染色または非特異的細胞染色による蛍光干渉のオーバーラップをテストするには、50%の生細胞と50%の死細胞混合培養データを選択します。

そして、蛍光灯のゲートを取り外します。ゲートを適用して、標的生物の細胞サイズの前方散乱ヒストグラムのみをフィコシアニンチャネルヒストグラムに含めます。フィコシアニンの最高ピークと最低ピークをゲーティングし、それぞれ生きているピークと死んでいるピークにラベルを付けます。

次に、ゲートを生死のフィコシアニンシグナルに別々に適用します。そして、両方の平均波長を記録します。プロトコール感度を決定するには、陽性の死分子プローブ蛍光の平均波長と、固有の非特異的生シグナルを比します。

最後に、非特異的染色を起こさずに最も多くの死細胞が染色された最適化されたプロトコルを選択します。これらのグラフでは、指数関数的段階におけるM.aeruginosaバッチ培養の細胞サイズと内部の複雑さに対する代表的な前方および側方光散乱出力が示されています。ゲーティングは、前方光散乱出力の特定のポイント間のデータを調整することで実行できます。

フィコシアニンは、赤色光源で調べられると強いシグナルを発し、これを利用して目的の集団をさらにゲートすることができます。前方光散乱および蛍光シグナルから、元の出力から緑膿菌サンプル上の特定のデータにデータをゲートして、最終的な細胞数を得ることができます。高色素の生群と低色素沈着の死体コントロールを混在させると、自家蛍光のシフトが減少することが明らかになります。

膜が損なわれた細胞では、核酸プローブは、フローサイトメトリーで観察でき、さらに落射蛍光顕微鏡で確認できる追加のシグナルを生成します。生細胞と死細胞の間の蛍光識別は、0.05 マイクロモルから 0.5 マイクロモルの濃度の間では時間とともに増加しますが、両方のプローブの 1 マイクロモルから 100 マイクロモルの濃度の間では減少します。実際、緑色核酸プローブの最適な濃度は0.5マイクロモルで、インキュベーション時間は30分です。

オレンジ色の核酸プローブの場合、最適な濃度は10分間のインキュベーションで1マイクロモルです。一度習得すると、各分子プローブの最適化は、適切に実行されれば、1日で完了することができます。この手順を試行する際は、プローブを適切な温度、pH、および光の条件下で安定した環境に保つことを忘れないでください。

その開発後、この技術は、微生物学の分野の研究者が植物プランクトンのコミュニティの不均一性を探求する道を開きました。このビデオをご覧になった方で、フローサイトメトリーと分子プローブを使用して細胞生理学を評価するための最適なプロトコールを開発する方法について、十分に理解できたはずです。分子プローブや有毒生物の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、適切なPPEを着用し、COSHH材料を完全に理解するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。