光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（

本手順の目的は、フローサイトメトリーと分子プローブを用いて、シアノバクテリアの生理学的状態を効果的に分析できるプロトコルの作成方法を提示することです。このプロトコルは、微生物コミュニティの細胞生理に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手順の主な利点は、最適化された蛍光プローブプロトコルを用いることで、個々の細胞レベルでのシアノバクテリアの生理学的状態をリアルタイムで区別できることです。

この手順の実演は、ボーンマス大学のサイトメトリー研究室で研究を行っている博士課程の学生、David Hartnellが行います。実験を開始する前に、空の溶血チューブをサンプル注入プローブにセットしてください。「unclog（詰まり解消）」をクリックします。

その後、バックフラッシュを行い、フローサイトメトリーの洗浄プロセスを開始します。バックフラッシュの終了後、2 mLの超純水フィルター水を満たした新しい溶血管をサンプル注入プローブ（SIP）にセットし、制限時間を10〜15分に、流速を「速い（fast）」に設定します。次に、新しいデータセルを選択し、背景ノイズを低減させるために、適切な蛍光および光散乱の閾値を設定します。

次に、「run」をクリックします。1秒あたりの総イベント数がメーカーの推奨値より少ない場合は、除染溶液2 mLを「fast」設定で2分間流します。その後、バックフラッシュと超純水によるフラッシングの手順を繰り返します。

M.aeruginosaの一次単一培養物を調製するため、250 mLビーカーに超純水ろ過水98 mLと藻類培地2 mLを混ぜ合わせ、120 °Cで20分間オートクレーブ滅菌します。培養物が高密度の定常状態に達したら、2 mLの細胞をボルテックスで分散させます。その後、細胞をサンプル注入プローブの下に移動させます。

光学顕微鏡を用いて、細胞が均一に分散していることを確認します。次に、フローサイトメーターのソフトウェアでヒストグラムプロットを選択し、前方散乱光（FSC）データを記録します。そして、「log」をクリックして、x軸を対数スケールで表示します。

別の出力ウィンドウで、M.aeruginosa細胞の自然蛍光を記録するために、もう一つの対数軸ヒストグラムを設定します。次に、フィコシアニンを励起できる光源と、それによって生じる蛍光の放出光をフィルタリングできる検出器を選択します。最高解像度で記録するには、標的生物のコアサイズに最も近い設定を選択してください。

そして、比較的低速の流速に設定します。データを取得する前に、電子的なバックグラウンドノイズや細胞サンプルのデブリによって生じる光散乱および蛍光信号を除外するためのしきい値を設定してください。その後、新しいデータセルを選択します。

前方散乱光と側方散乱光のパラメータを対数スケールで密度プロットとして作成し、「run」をクリックします。次に、前方散乱光および自然蛍光ゲートを前方散乱光対側方散乱光のデータに適用し、低レベルの散乱信号を除外して、相対的に高い蛍光フィコシアニン信号のみを抽出します。その後、サンプルの測定が終了するまでイベントを収集し、そのデータを用いて初期細胞数を決定します。

分子プローブの細胞取り込みを最適化するため、あらかじめ調製した単層培養の半分を、死細胞コントロールを作成するための適切な条件にさらします。サンプルの微小環境における変化を確認し、培養細胞の死滅を確認してください。その後、先ほど実演した通りにコロニー形成を分散させます。

次に、488 nmのレーザーと、緑色および橙色の核酸プローブからの蛍光を記録できる検出器を選択します。また、640 nmのレーザーを選択し、それぞれの検出器を通じてフィコシアニンの信号を記録します。新しいデータシートで、前方散乱光（FSC）と側方散乱光（SSC）のパラメータを用いた密度プロットを設定します。

次に、それぞれの分子プローブ光検出器チャネルを用いてヒストグラムを作成します。フィコシアニンの放出を検出するためのヒストグラムと、前方散乱イベントのためのヒストグラムを、すべて対数スケールで作成してください。濃度の異なるシアノバクテリア試料を用いて、異なるインキュベーション時間で解析を行います。

前方散乱光（Forward Scatter）のヒストグラムにおいて、標的生物の細胞サイズのみを含むようにゲートを作成します。そして、それを対応する蛍光プローブチャネルに適用します。次に、その蛍光プローブチャネルにおいて、ヒストグラムの最高ピークを囲むように、もう一つの包括的なソフトウェアゲートを作成します。

続いて、対応する陽性プローブの蛍光を密度プロット上でゲートします。蛍光シグナルの数を死細胞コントロールの数と比較し、非特異的な染まりが生じない範囲で、細胞の核酸プローブ取り込み率が最大となる条件を決定します。内在性または非特異的な細胞染色の蛍光干渉（オーバーラップ）をテストする場合は、生細胞50％と死細胞50％を混合した培養データのサンプルを選択してください。

そして、蛍光ゲートを解除します。フィコシアニンチャンネルのヒストグラムにおいて、標的生物の細胞サイズに該当する前方散乱（forward scatter）ヒストグラムのみを含むようにゲートを設定します。フィコシアニンの最高ピークと最低ピークにゲートを設定し、それぞれ「生（live）」および「死（dead）」としてラベル付けします。

次に、生細胞と死細胞のフィコシアニン信号に個別にゲートを適用し、両方の平均波長を記録します。プロトコルの感度を決定するために、死細胞の陽性分子プローブ蛍光の平均波長と、非特異的な生細胞の固有信号の比を算出します。

最後に、非特異的な染色の発生を抑えつつ、死細胞が最大限に染色されている最適化されたプロトコルを選択します。これらのグラフには、対数増殖期のM.aeruginosaバッチ培養における、細胞サイズと内部複雑性を示す代表的な前方散乱光および側方散乱光の出力が表示されています。前方散乱光出力の特定点の間でデータを精査することにより、ゲーティングを行うことができます。

フィコシアニンは赤色光源で照射された際に強力な信号を発するため、これを目的の細胞集団をさらにゲートするために利用できます。前方散乱光と蛍光信号に基づき、元の出力データからM.aeruginosaサンプルに関する特定のデータをゲートすることで、最終的な細胞数を算出できます。色素沈着の高い生存コントロールと、色素沈着の低い死細胞コントロールを混合すると、自己蛍光の減少シフトが明確になります。

膜が損傷した細胞では、核酸プローブによって追加のシグナルが生成され、これはフローサイトメトリーで観察し、さらにエピ蛍光顕微鏡で確認することができます。生細胞と死細胞の蛍光識別能は、0.05 µMから0.5 µMの濃度範囲では時間経過とともに向上しますが、1 µMから100 µMの濃度範囲では両プローブとも低下します。実際、緑色核酸プローブの最適濃度は0.5 µMであり、インキュベーション時間は30分であると考えられます。

オレンジ色の核酸プローブについて、最適な濃度は1 µMであり、10分間インキュベートします。習熟すれば、適切に実施することで、各分子プローブの最適化を1日で完了させることができます。この手順を行う際は、プローブを適切な温度、pH、および遮光条件下という安定した環境で保持することが重要です。

この手法の開発により、微生物学分野の研究者が植物プランクトンのコミュニティの不均一性を探索する道が開かれました。ビデオを視聴したことで、フローサイトメトリーと分子プローブを用いて細胞生理学を評価するための最適なプロトコルを開発する方法について、十分な理解が得られたはずです。分子プローブや毒性を持つ生物を取り扱うことは非常に危険を伴うため、本手順を実施する際は、適切な個人用保護具（P.P.E.）の着用や、COSHH（有害物質制御規則）資料を完全に理解することなどの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。