Name: シリアル イメージの肥大と膜間距離を定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 学ぶ心臓電気生理学におけるペリネクサス幅の自動計測アルゴリズム。画像拡張と経路探索技術を用いて、細胞外空間の構造と細胞間通信メカニズムを高解像度で定量化する方法です。

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著者は、処理および (TEM) 試料を染色のための獣医のバージニア-メリーランド大学でキャシー ・ ロウに感謝したいと思います。 資金。 国立衛生研究所健康 R01 HL102298 国立衛生研究所健康 F31-HL140873-01

注: ソフトウェア必要 ImageJ (または同じようなイメージを変更するソフトウェア) と Matlab R2015。ユーザーは、Matlab の他のバージョンとの互換性の問題を発生ことがあります。
1 処理前画像
<ol><li>任意のグレースケール画像を確認任意の特定のピクセルの最大強度の値が < 255。補足ファイル S1 に含まれているカスタム Matlab プログラム"ImageSub.m"のイメージから 1 の値を減算してこれは通常です。</li>
</ol>2. アウトライン、Perinexus
<ol><li>ImageJ や他の画像処理ソフトウェア perinexus を概説します。</li>
	<li>概要 1 ピクセルの厚さは、イメージ (0 から 255 のグレースケール イメージで 255) で最高強度の値に設定されてことを確認します。</li>
	<li>その pentalaminar 構造11,で12GJ を識別し、図 1のAに示すように、細胞膜脂質に反対 2 分岐、ポイントとして、perinexus の先頭を定義します。最初のセルの内側の膜と 2 番目のセルの内膜に沿って戻るをトレース、GJ のエッジから開始 ~ 200 nm。ImageJ、アウトラインを自動的に閉じるペンを離します。この人工閉鎖後でトリミングされます。 注: アウトラインの小さくても誤アプリケーション数ナノメートル最終測定における誤差の発生する、可能な限り倍率高としての細心の注意と perinexus をアウトラインすることが重要です。</li>
</ol>3. アルゴリズムと Perinexus の興味の選択の設定
注: 経路探索アルゴリズム MembraneSepDist m ファイルと同じディレクトリにするサイン、エッジ、グラフ、ノード、および経路探索用関数9が必要です。補足ファイル S1 内のすべてのファイルを見つけることが。
<ol><li>データと数字の場所を保存を選択します。M ファイルに現在ハードコーディングです。 注: プログラムの最初の行は、すべての変数を消去し、すべてのウィンドウを閉じるコマンド ウィンドウのクリア機能です。M ファイルを実行する前にすべての必要な変数または数字を保存します。 注: ソフトウェアのスクリーン ショットは、すべてハードコード値の補足ファイル S2 に含まれます。</li>
	<li>"MembraneSepDist.m"プログラムを実行します。</li>
	<li>パラメーターを設定します。 注: GUI はグラデーションのしきい値、スケール、利子および手動起動の領域の既定のパラメーターをポップアップします。M ファイルで既定値を変更できます、または各イメージのため変更することができます。<ol>
<li>空間微分勾配閾値を設定します。 注: 高い値は中心線分離の選択より多くのポイントになります。高すぎたり (約 3.0 7.9 の範囲) の外低すぎる値計算の非効率性または不正確な中心線分離 (参照してください図 2の C) を降伏中心点の不正確な選択可能性があります。</li>
		<li>ピクセル/スケール単位のスケールを設定します。</li>
		<li>関心領域の空間の下限と上限の制限を設定します。 注: 当研究室の慣例では、関心の特定の領域は GJ2,3,10の端から 30 と 105 nm の間です。</li>
		<li>自動/手動の開始を設定します。ほとんどの場合、アルゴリズムは正確にギャップ接合が終了し、perinexus を開始する開始点を検出します。ただし、不規則な形の perinexi のいくつかのケースでユーザーでは開始点を手動で識別する必要があります。この値を設定すると、自動の場合は 0、マニュアルの 1。</li>
	</ol>
</li>
	<li>目的のイメージを選択します。 注: m ファイルのフォルダー、ファイルの選択を変更できます。</li>
	<li>興味の perinexus を選択する画像をトリミングします。<ol>
<li>画像が表示されたら、カーソルに十字型に変更されます。興味 (参照してください図 3) の perinexus の周りにボックスをドラッグして画像をトリミングします。トリミング ボックスは、四隅と各辺に大きくまたは小さくする正方形を使用して調整できます。</li>
		<li>トリミングするとき、perinexus の「開いている」終わりを確保 (GJ から最も遠い図 3参照) トリミング、トリミングされた画像端に達する 2 つ膜の概要。 注: より簡単に興味の perinexus を参照してくださいして、適切にトリミングする画像全画面表示をすることをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>測定する反対のエッジの間にカーソルをダブルクリックすると、最後の作物を選択します。 注: perinexus 内部ダブルクリックを実行することが重要です。プログラムは、中心線を識別するために失敗した場合、プログラムを再起動し、perinexus 内でクリックが発生したかどうかを確認します。</li>
	<li>すべての肥大とびらん後最終的なセンターライン観察プログラムの有効性の最終的なユーザー評価のためにポップ。 注:、Matlab は、プログラムが終了するまで、追加のコマンドを処理することができなくなりますをユーザーに通知する、プログラムの実行中] ダイアログ ボックスが画面に表示されます。このプロセスの所要時間は、配列 (イメージ) のサイズとコンピューターの処理能力によって異なります。</li>
	<li>場合は手動での開始ポイントを有効にすると、中心線のイメージ ポップアップにわたって観察十字カーソルと共に元の解剖学的画像 (図 2E参照)。目的の開始点近傍の perinexus の外のポイントを選択します。 注: プログラム選択したピクセルに最も近い中心線の場所を検索し、開始点として使用します。</li>
	<li>データを記録します。 注意: プログラムが終わったら、プログラムを返しますマップされた中心線、GJ の端からの距離の関数としての perinexal 幅のプロット。さらに、プログラムは、150 まで平均 perinexal 幅に戻りますから Matlab コマンド ・ ラインで関心の特定の領域内の平均と同様、GJ の端から nm。Wp値と、GJ からの距離を変数"WpList"に格納または、ユーザーは手動で個別にそれらを記録できます。</li>
</ol>4 アルゴリズムのトラブルシューティング
<ol><li>中心線が適切でない場合識別された (図 2A) は図"Gmag"を開き、適切な勾配しきい値 (図 2C) を識別するためにインデックスを使用します。</li>
	<li>開始点を正しく識別されない場合は、手動で開始ポイントを設定 (プロトコル 3.8 を参照してください)。</li>
</ol>

<ol><li>Rhett, J. M., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perinexus%3A+a+new+feature+of+Cx43+gap+junction+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">The perinexus: a new feature of Cx43 gap junction organization.</a> Heart Rhythm. 9 (4), 619-623 (2012).</li>
<li>Veeraraghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channels+in+the+Cx43+gap+junction+perinexus+may+constitute+a+cardiac+ephapse%3A+an+experimental+and+modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium channels in the Cx43 gap junction perinexus may constitute a cardiac ephapse: an experimental and modeling study.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).</li>
<li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+sodium+dependence+of+the+conduction+velocity-calcium+relationship%3A+evidence+of+ephaptic+self-attenuation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular sodium dependence of the conduction velocity-calcium relationship: evidence of ephaptic self-attenuation.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 310 (9), 1129-1139 (2016).</li>
<li>Veeraraghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channels+in+the+Cx43+gap+junction+perinexus+modulate+ephaptic+coupling%3A+an+experimental+and+modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Potassium channels in the Cx43 gap junction perinexus modulate ephaptic coupling: an experimental and modeling study.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2016).</li>
<li>Rhett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx43+associates+with+Na%28v%291.5+in+the+cardiomyocyte+perinexus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Cx43 associates with Na(v)1.5 in the cardiomyocyte perinexus.</a> Journal of Membrane Biology. 245 (7), 411-422 (2012).</li>
<li>Raisch, T. B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29780324">Intercalated Disc Extracellular Nanodomain Expansion in Patients with Atrial Fibrillation.</a> Frontiers in Physiology. , (2018).</li>
<li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+methods+of+automated+quantification+of+gap+junction+distribution+and+interstitial+collagen+quantity+from+animal+and+human+atrial+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel methods of automated quantification of gap junction distribution and interstitial collagen quantity from animal and human atrial tissue sections.</a> PLoS One. 9 (8), 104357(2014).</li>
<li>Papari, G., Petkov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+pseudo+dilation+for+gestalt+edge+grouping+and+contour+detection%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Adaptive pseudo dilation for gestalt edge grouping and contour detection.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 17 (10), 1950-1962 (2008).</li>
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 <a target="_blank" href="www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34966-pathfinding">www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34966-pathfinding</a> (2012).</li>
<li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+sodium+and+potassium+levels+modulate+cardiac+conduction+in+mice+heterozygous+null+for+the+Connexin43+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular sodium and potassium levels modulate cardiac conduction in mice heterozygous null for the Connexin43 gene.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).</li>
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<li>Dhindwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryo-EM-based+model+of+phosphorylation-+and+FKBP12.6-mediated+allosterism+of+the+cardiac+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">A cryo-EM-based model of phosphorylation- and FKBP12.6-mediated allosterism of the cardiac ryanodine receptor.</a> Science Signaling. 10 (480), (2017).</li>
<li>Reddy, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cardiac+magnetic+resonance+imaging+with+three-dimensional+electroanatomic+mapping+to+guide+left+ventricular+catheter+manipulation%3A+feasibility+in+a+porcine+model+of+healed+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Integration of cardiac magnetic resonance imaging with three-dimensional electroanatomic mapping to guide left ventricular catheter manipulation: feasibility in a porcine model of healed myocardial infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (11), 2202-2213 (2004).</li>
<li>van Heeswijk, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Self-Navigated+T2+Mapping+for+the+Detection+of+Acute+Cellular+Rejection+After+Orthotopic+Heart+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Direct%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Self-Navigated T2 Mapping for the Detection of Acute Cellular Rejection After Orthotopic Heart Transplantation.</a> Transplant Direct. 3 (4), 149(2017).</li>
<li>Valinoti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+patient-specific+models+for+left+atrium+characterization+to+support+ablation+in+atrial+fibrillation+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">3D patient-specific models for left atrium characterization to support ablation in atrial fibrillation patients.</a> Magnetic Resonance Imaging. 45, 51-57 (2018).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

アルゴリズムは、この場合 perinexus2,3,14の間の膜分離にはバイナリ イメージの 2 つの反対 2D エッジの間のピクセル数をカウントするのにシリアル イメージの肥大を使用します。空間微分および経路探索アルゴリズムは、15の前に行われているかのように、中心線のギャップを埋めるための二次膨張と侵食並びに続いて、中心線を分離する使用されます。中心線、この場合のエッジ分離の初めから距離の関数として perinexal 幅を表す最終的な拡張数イメージ、GJ の終わりと perinexus16の最初結合です。
4 つの主要なパラメーターは、プログラムの起動時に GUI でユーザー定義です。
<ol><li>グラデーションのしきい値</li>
	<li>スケール</li>
	<li>興味範囲の地域</li>
	<li>(自動または手動) ポイント選択手法を開始します。</li>
</ol>アルゴリズムのエラーの最も一般的なメカニズムは、中心線の経路探索アルゴリズムのエンドポイントを決定する方法は、画像のエッジに到達するための障害です。このような問題を解決するために、ユーザーは手順 3.3.1, 経路探索アルゴリズムで必要な計算時間が長くなります空間の派生イメージからより多くのポイントを選択するプログラムを原因となるグラデーションのしきい値を増やすことができます。そのため、このアルゴリズムでは、計算の速度とセンターラインの整合性の間の妥協が必要です。それは、中心線のすべての点と適切な開始点での空間微分から見出される限り、空間微分のしきい値がありませんエッジ分離計測に及ぼす影響に注意してくださいすることが重要です。
エラーをする場合、関心領域の大半は拡張行列の軸に角度 45 ° 90 ° の手順でカーネルを拡張させるため、拡張値に影響を与えるイメージの方向が表示されます。したがって、拡張カウントできないがあります常にエッジ間のスペースの正確な表現。この制限は三角関数補正係数によって対処されていますが、データセット内のすべての画像が同じ方向に整列されている場合可能性があります無視される可能性が。さらに、断面平面が 2 つの膜を完全に垂直ではないことは可能であると注意を結果の解釈に使用する必要があります。図 9BGJW を使用して、私たちの perinexus 画像が平面内を示唆します。それでも、サンプル サイズの画像間のすべての断面のバリエーションのアカウントに十分に大きいことが不可欠です。さらに、私たち perinexal 幅の測定値は体内のスペースが、このアプローチはいくつかの介入や病気の状態を基準にして perinexal 幅の平均の違いを測定する使用を反映するように解釈しないでください。
現在のアルゴリズムでは、入力としてエッジを手動でトレース概要も必要です。スケールを正しく設定すると、限り、空間分解能がありませんアルゴリズムの測定に及ぼす影響図 6の画像と補足で追加の低解像度画像のさまざまな解像度で示されるようにすることが重要です。ファイル S6。アルゴリズムを向上させる次の手順概要代々 関心の領域を選択することができますツールと共に人間の介入が削除されます。これらの機能は、測定の精度を高めるし、ユーザー バイアスを減らすだろう可能性が高い。
この計算のアルゴリズムは、約 5 分の 1、工数、マニュアルでのセグメンテーションのプロセスと比較した場合の再現性に検出可能なペナルティなしで perinexus を定量化を必要とするより高速なメソッドを提供します。さらに、マニュアルでのセグメンテーションのプロセスは 1 つの測定 perinexal 幅その 15 nm の範囲内で、perinexus の膜分離が大幅に変わる可能性がサンプリングの下につながる可能性を定量化するすべての 15 ナノメートルを利用しています。一方、自動プログラムには空間分解能イメージング法、perinexal 幅のより細かく解決平均を提供するため、perinexus の長さに沿ってナノメートルあたりここで 2.9 ピクセルに等しい。
心臓の構造生物学の分野への応用が有望でエキサイティングなこのアルゴリズムの使用を TEM 像に限定されていません。このアルゴリズムの使用、フィールドを必要とする 2 つの擬似並列 2 D エッジの高精度、高分解能測定が行うことができます。アルゴリズムは、明視野観察や蛍光顕微鏡による血管の開発する衛星画像から川岸の浸食や洪水パターンから何かを追跡するために使用できます。循環器・ ポイント ・ オブ ・ ケア心エコーで心室駆出率 (EF) 計測の分野で最も有望な潜在的なアプリケーションの 1 つです。現在、標準的な技術は、新しいアルゴリズム、AutoEF は現在最先端の EF 定量化法18,19ディスク17、複葉機法です。ディスクの複葉機方法、問題の商工会議所は手動でトレースし、という全体的なボリュームを積み上げ楕円形ディスクの総和で計算自動的に変更されたシンプソンのメソッドを使用して量を示されます。このメソッドの主な制限はない解像度、関心の特定の領域を識別するために、目的の部屋の合計断面積を返すことができますのみも相当な人間の入力と専門知識を必要とすることです。新しいメソッド、AutoEF、識別し、2 D 斑点アルゴリズムを用いた心室の端の概要を説明し、心室の断面積を計算します。このプロセスは、正確かつ効率的な心室の面積を測定しながら合計断面積を計測するだけのような制限があります。この主な欠点は、臨床医の診断および治療の能力を制限します。対照的に、本稿で提示アルゴリズムで、正中線を識別することができます、解像度イメージ投射様相の関心の特定の領域を特定する解像度に。Μ m の空間分解能を持つ超音波スキャナー、市販20,21, このアルゴリズムが μ m の解像度でローカライズされた壁運動異常を検出できることを意味ために、これは重要です。代わりにセンチメートル。このアプリケーションを実験的に検証する必要がある、このアルゴリズムの最もすぐに有望なアプリケーションの 1 つです。実際に、スペックル追跡 AutoEF の機能と簡単に組み合わせることができるまたは手動トレースが従来の EF のデータと並行して高解像度情報を提供するマニュアルの面積で利用します。
汎用性の高い、現在のアルゴリズムは適用される、2次元画像のため開発されました。しかし、画像処理技術が向上するのにつれ、3 と 4 の D 定量化技術の需要の増加があります。したがって、アルゴリズムの次の反復処理は、同じアプローチは、現在画像処理プログラムの機能を超えて現在は自動的に中心線を定義する、3 次元オブジェクトへのバイナリ イメージを順次拡張を適応することです。このようなアルゴリズムだろう幅広い臨床的および実験的心臓 3 D 心エコー22,23, 3 D 電子顕微鏡24,25,を含む単独のフィールドで26, と 3 D 磁気共鳴イメージング27,28,29。

次のアルゴリズムは perinexus1と呼ばれるナノドメインのギャップ接合プラークの端に区別点で構造的に結合された心筋細胞 2 つ間膜間の距離を測定するため開発されました。ephaptic2,3,4、5の結合に関与しています。Perinexal の幅を高いサンプリング スループット メソッドの識別された必要性何百もの以前の研究6でマニュアルでのセグメンテーション法 perinexi の透過電子顕微鏡 (TEM) 像を分析する過程で空間分解能手動分割中に以前のマニュアルでのセグメンテーションのプロセスの精度を維持しながら中心線に直交約 15 nm 間隔で線を描画 perinexal の幅を測定するために。新しいアルゴリズムは、2 つの平行線の 1 ピクセルの太い、バイナリの輪郭を受け取り、シリアル イメージ拡張を使用して、2 つの膜の間のピクセル数をカウントします。イメージの肥大が無数のイメージ処理アプリケーションで広く使われて、輪郭やエッジ検出7,8, このアルゴリズムを含むと、カウントのメカニズムとして、不整に使用します。中心線は孤立した経路探索アルゴリズムの9と perinexal の幅を使用してイメージの解像度に perinexus の長さに沿って解像度でそれから測定されます。解像度の違いはこの場合は 15 あたり 1 測定マニュアルでのセグメンテーションの 1 測定につき 0.34 nm nm 新しいアルゴリズムで、空間のサンプリング周波数の 44-fold 増加。さらに、手動分割のために必要な時間にこのサンプリング頻度の増加は約 1/5thで行います。
従来の 0-150 で perinexal の幅を測定する現在の形態でこのアルゴリズムが使用されます、perinexus が 30 と 105 nm2間高原、関心の特定の領域内だけでなく、ギャップ接合プラーク5 (GJ) の端から nm,3,10. サンプリング頻度の増加は、手動分割に比べて個々 の perinexus の測定値のばらつきを低減や、大量データの効率的な処理を可能にする分析時間の大幅短縮により。ただし、このプログラムは心臓インターカ レート ディスクのナノスケール電子顕微鏡画像に限定ではありません。同じアプローチは、血管径、心室駆出率や川の浸食や洪水なども非生物学的現象を定量化するされる可能性があります。このアルゴリズムは、任意の 2 つの擬似並列エッジ間の距離を定量化に適しています。

<table><tbody><tr><td>タッチスクリーンモニター</td><td>Dell</td><td>S2240T</td><td>ソフトチップスタイラスが必要</td></tr><tr><td>デスクトップ</td><td>Dell</td><td>Precision T1650</td><td>8GB RAM</td></tr><tr><td>オペレーティングシステム</td><td>Microsoft</td><td>Windows 7 Enterprise</td><td>64ビットOS</td></tr><tr><td>プログラムプラットフォーム</td><td>Mathworks</td><td>Matlab R2015b</td><td>プログラムは、新しいバージョンまたは古いバージョンのMatlabと互換性がない場合があります</td></tr></tbody></table>

シリアル イメージの肥大と膜間距離を定量化

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

Perinexus と呼ばれる、最近説明細胞ナノドメインは心筋細胞間の電気伝導のための代替メカニズムである ephaptic、結合に関与しています。手動分割によるこの空間を定量化するための現在の方法は低速で、低空間分解能。我々 は 2 つの向かい合う 2 つの次元のエッジの間のピクセル数をカウントするバイナリの概要のシリアル画像不整を使用してアルゴリズムを開発しました。このアルゴリズムは、人の少ない時間を必要とする、手動プロセスの再現性を維持しながら手動メソッドよりも高い空間分解能をします。実際、経験し、初心者捜査官らはこの新しいアルゴリズムと以前の研究の結果を要約することができます。アルゴリズムは、perinexus を手動でアウトラインに必要な人間の入力、既存の経路探索アルゴリズムによって妨げ主に計算能力によって制限されます。ただし、アルゴリズムの高スループット機能、高分解能、再現性を越えてそれを作る用の汎用性と堅牢な測定ツール (2 D を 2 次元の間の距離の測定を必要とするアプリケーションの様々 な) エッジ。

このアルゴリズムの目的は、シリアルのイメージの肥大と経路探索機能を使用して 2 次元の 2 つのエッジ間の距離を連続的に測定することです。このアルゴリズムは、さまざまな心臓の構造生物学、血管生物学、土木工学などの分野に適用できます。

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

この方法は、心臓の電気生理学的分野における重要な質問、細胞外空間の構造および細胞通信機構に関する回答を助けることができる。この手法の主な利点は、高スループット機能と、空間サンプリング周波数の向上です。基本的に、以前よりも迅速かつ高い信頼を得ることができます。ペリネクサスは比較的新しく定義された構造であるため、Perinexusの識別とプログラムのトラブルシューティングは視覚的なデモンストレーションなしでは学習が困難であり、MATLABに慣れていない研究者にとってトラブルシューティングは直感的ではない可能性があります。グレースケール画像の場合は、数値計算ソフトウェアを使用して、ピクセルの強度が 255 を超えないようにします。次に、画像処理ソフトウェアでペア画像を開き、ペリネクサスを拡大します。ペリネクサスを正しく識別することが重要です。最初のステップは、縞模様の外観を持つギャップジャンクションプラークを識別することです。その後、2つの対向膜を平面で、約200ナノメートルまで探します。ペンチルアミン構造からギャップ接合プラークを特定します。ペリネクサスの始まりは、2つの対向する細胞膜二重層が発散する点である。スケールバーをナノメートルで表示します。ペリネクサスの輪郭の始まりと終点は、ペリネクサスの始まりから200ナノメートルになります。次に、フリーハンド選択ツールを選択します。クリックしてドラッグするか、スタイラスを使用して、1つの細胞の内膜に沿って、ペリネクサスの始まりまで、そして第2細胞の内膜に沿って慎重にトレースします。マウス ボタンを離すか、スタイラスを持ち上げて、選択した領域を閉じます。次に、線幅を 1 ピクセルに設定し、前景色をイメージ タイプの最大輝度値に設定します。白など、グレースケール画像用。選択範囲からトレースされたアウトラインを作成し、JPEG や TIFF などの解析ソフトウェアと互換性のあるファイルタイプとして、作成したイメージを保存します。必要に応じて、膜分離距離解析ソフトウェアを開き、生成するデータと図形の保存場所を変更します。ファイルを保存して閉じます。次に、プログラムを実行します。中心線の識別に適した空間微分勾配しきい値を設定します。単位の長さあたりのスケールとピクセルを設定します。ギャップジャンクションのエッジに対して、対象領域の空間下限と上限を設定します。自動または手動の始点検出を選択します。不規則な形状のペリネキシには手動で開始点検出が必要な場合があります。次に、輪郭を描いたペリネクサスで画像を開きます。クリックしてドラッグすると、閉じた端を除いてペリネクサスの周りにボックスを描画します。トレースされたペリネクサスのアウトライン内をダブルクリックして、画像をトリミングし、中心線を識別します。始点を手動で選択する場合は、クロスヘアカーソルと中心線が元のイメージの上に表示されます。プロセスを続行するには、目的の開始点に近いペリネクサスの外側の点を選択します。プロセスが完了したら、中心線がペリネクサス内に留まり、始点と正しく交差していることを確認します。生成されたデータを確認し、過性幅をプロットします。中心線が正しく識別されず、分離されていない場合は、g-mag イメージ配列を開いて適切な勾配しきい値を決定します。インデックスツールを使用して中心線の周りをクリックし、g-mag配列を使用して、中心線検索アルゴリズムで選択したいピクセルを確認します。グラデーションのしきい値は、これらのピクセルの強度値のすぐ上に設定する必要があります。インデックス ツールを選択し、中心線とその周辺をクリックして、選択するピクセルのインデックス値を表示します。空間的な微分勾配のしきい値をインデックス値のすぐ上に設定し、プロセスを再実行します。自動プロセスで開始点が正しく検出されなかった場合は、手動で開始点を検出してプログラムを再実行してください。このプロセスでは、手動アウトラインは、2 つのエッジ間のピクセル数をカウントするために 1 ピクセルずつ拡張されます。各増分は、空間微分を生成するために作業イメージに追加されます。元のアウトラインと中心線は、その大きさの不連続です。中心線を分離した後、拡張、侵食、およびパスファインディングアルゴリズムによって精製されます。ペリネキス幅は、ペリネクサスの開始から、または対象領域内の距離の関数として、およびそれらの関数の両方の平均として提示されます。ペリネクサスの向きが変化するにつれて、拡張パターンに応じて、ペリネクサス幅の過大評価または過少推定が観察された。三角法による補正は、ペリネクサスを水平方向に向けるために回転した画像と強く相関する結果を生み出した。このアルゴリズムは、さまざまな空間解像度、参照単位、画像サイズについて検証されました。経験豊富なユーザーと経験の浅いユーザーの両方が、手動で画像をセグメント化するよりも速くアウトラインをトレースしました。そして、自動化されたプロセスは、空間分解能が大幅に大きくなりました。経験豊富で経験の浅い観察者は、既存の心房細動の有無にかかわらず、患者間の会前体幅の有意な違いを正確に同定した。これらの観測者はまた、同じ母集団における絶対ギャップ接合部幅の間に有意差がないことを正確に特定した。接合部幅とギャップジャンクション幅は、以前のレポートと一致していました。この手順を試みている間、膜からのわずかな偏差でさえ、このスケールでかなりの誤差を生じさせる可能性がありますので、アウトラインであなたの時間を取ることを忘れないでください。一般的に、この方法に慣れていない人は、測定している構造に慣れていないか、ポイント識別や中心線の偏差を開始するために問題をトラブルシューティングする方法がわからないため、苦労します。この画像処理方法を見ることは非常に重要です。ペリネクサスの識別とアルゴリズムのトラブルシューティングはそれなしで学ぶのが難しいので。そして、私たちが測定していると言うことを定量化したいと考えています。この技術は、心臓の健康の分野の研究者のための道を開きます, 心臓機能の多くのレベルのより高い解像度定量を探求します.ナノスケールから、細胞外空間から心室効率または機能低下の臨床的決定まで。この方法は、電気顕微鏡画像で実証されたが、心臓心エコー検査のような他の画像技術にも適用して、心臓の機械的機能をより正確に定量することができる。この方法では、スケールが適切に設定され、エッジがほぼ平行である場合、プログラムは2つの定義されたエッジ間のスペースを測定できるため、任意のイメージングフィールドでアプリケーションを見つけることができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活​​性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。...

細菌分裂機械の超解像イメージング

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。...

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

このプロトコルは細胞分裂の同期を統合することで効率的に 3 D コラーゲン マトリックス中の哺乳類の細胞分裂を研究生細胞イメージング、共焦点反射の時間分解顕微鏡を使用して 3 D...

哺乳類の細胞分裂量的共焦点反射顕微鏡を介して 3 D 行列

このプロトコルの目標は、生理学的および病理学的条件の下で胚性ゼブラフィッシュにおけるセグメント性心機能の評価のための新しい方法を詳述することです。...

心筋機械変形(DIAMOND)の変位解析は、胚性ゼブラフィッシュにおける心機能のセグメント的不均一性を明らかにする

適切なサルコメアネットワークの形成は、iPSC由来心筋細胞の成熟にとって重要である。我々は、心臓の発達を促進する培養条件を改善するために、幹細胞由来心筋細胞の構造成熟の定量的評価を可能にする超解像ベースのアプローチを提示する。...

一分子局在顕微鏡を用いたヒトiPSC由来心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの解析

本プロトコールは、培養ラット海馬ニューロンおよび3D構造化照明顕微鏡(3D−SIM)を用いて軸索初期セグメントの膜周期骨格のアクチン環および他の成分を視覚化および測定する方法を記載する。...

3D構造化照明顕微鏡(3D-SIM)を用いた軸索初期セグメントの膜周期骨格の特性の測定

肝臓または他の組織の細胞から肝細胞細胞小器官間の膜接触部位の三次元的詳細を取得するための簡単で包括的なプロトコル。...

連続部電子顕微鏡を用いた肝細胞細胞内細胞小器官間接触部位の3次元特性評価

我々は、動的微小管および蛍光標識微小管関連タンパク質の同時イメージングのための干渉反射顕微鏡および全内部反射蛍光顕微鏡を実施するためのプロトコルを提示する。...

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

このプロトコルでは、蛍光顕微鏡を使用して再構成された膜テザー細胞骨格ネットワークのダイナミクスを研究するための、支持された脂質二重層の形成、および細胞骨格フィラメントとモータータンパク質の添加について説明します。...

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

現在のプロトコルはイメージの定量化のための方法の眼球レンズの末梢構造の視覚化のための新しい全台紙のイメージ投射を記述する。これらのプロトコルは、レンズのマイクロスケール構造とレンズの発達/機能との関係をよりよく理解するための研究に使用できます。...

末梢レンズの構造、細胞形態、組織を可視化・定量化するためのホールマウントイメージング

ここでは、空気圧で作動し、高解像度顕微鏡法と互換性のある汎用性の高い等二軸ストレッチデバイスを紹介します。...

高倍率生細胞共焦点蛍光顕微鏡用等二軸延伸装置

学ぶ心臓電気生理学におけるペリネクサス幅の自動計測アルゴリズム。画像拡張と経路探索技術を用いて、細胞外空間の構造と細胞間通信メカニズムを高解像度で定量化する方法です。

シリアルイメージの肥大と膜間距離を定量化

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