Name: 末梢レンズの構造、細胞形態、組織を可視化・定量化するためのホールマウントイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 学ぶホールマウントイメージング法によるマウス眼レンズの構造・細胞形態・組織の可視化と定量化。高解像度共焦点顕微鏡を用いて3D構造を保持し、レンズ透明性と形態変化の分子メカニズムを解明する革新的アプローチです。

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この研究は、CCにEY032056された国立眼科研究所の助成金R01とVMFにEY017724されたR01、および助成金番号P20GM139760の国立総合医学研究所の支援を受けました。S.T.Iは、化学-生物学インターフェース博士課程前研修プログラムの一環として、NIH-NIGMS T32-GM133395、およびデラウェア大学大学院奨学生賞の支援を受けました。

マウス眼レンズホールマウントの調製とイメージング

<ol><li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry%2C+transparency%2C+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734(2012).</li>
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<li>Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+strain+on+mouse+eye+lens+capsule+and+cellular+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure.</a> Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).</li>
<li>Sindhu Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Aquaporin+0+in+lens+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics.</a> Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).</li>
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<li>Danysh, B. P., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The lens capsule.</a> Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).</li>
<li>Mekonnen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+capsule+significantly+affects+the+viscoelastic+properties+of+the+lens+as+quantified+by+optical+coherence+elastography%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086(2023).</li>
<li>Fincham, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+lens+capsule+in+the+accommodation+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Optical+Society%22%5BJournal%5D)">The function of the lens capsule in the accommodation of the eye.</a> Trans Optical Society. 30 (3), 101(1929).</li>
<li>Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+actin+filament+cytoskeleton%3A+Diverse+structures+for+complex+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions.</a> Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).</li>
<li>Bassnett, S., Sikic, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+growth+process%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The lens growth process.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).</li>
<li>Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+full+lifespan+model+of+vertebrate+lens+growth%5BTitle%5D)+AND+%22R+Soc+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">A full lifespan model of vertebrate lens growth.</a> R Soc Open Sci. 4 (1), 160695(2017).</li>
<li>Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA2+and+Src+regulate+equatorial+cell+morphogenesis+during+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development.</a> Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).</li>
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<li>Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibre+cell+organization+in+crystalline+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Fibre cell organization in crystalline lenses.</a> Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).</li>
<li>Cvekl, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+mechanisms+of+vertebrate+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development.</a> Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).</li>
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<li>Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+myosin+IIA+regulates+the+precise+alignment+of+hexagonal+eye+lens+epithelial+cells+during+fiber+cell+formation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20(2023).</li>
<li>Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+staining+of+lenses+for+visualization+of+lens+epithelial+cell+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins.</a> MethodsX. 8, 101376(2021).</li>
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<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
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<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Lukinavicius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+probes+for+live-cell+imaging+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton.</a> Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

記載されているプロトコルは、水晶体の前方および赤道領域における周辺レンズ構造および細胞の高空間分解能の視覚化を可能にします。本研究では、3次元レンズ全体の構造が保たれたインタクトレンズ(ライブレンズまたは固定レンズ)を用いて、レンズ周辺構造を可視化する手法を示した。さらに、一般に公開されているFIJI ImageJソフトウェアを使用した形態測定定量分析の簡単な方法も提供されました。マウント全体の可視化と定量化の方法は、以前の研究で使用されてきました。これらの方法により、水晶体の形状変化や老化に対する前嚢と細胞の応答を理解することができました2,4。これらの方法は、レンズ形状の変化や経年変化による赤道線維細胞の膨張を調べたり2,4したり、正確な六角形の形状や末梢線維細胞の組織化の確立におけるNMIIAの役割を決定するためにも用いられている20。
ホールマウントイメージングにより、レンズ構造の 顔面イメージング を高い空間分解能で行うことができます。前レンズ領域では、ホールマウントイメージングは、カプセル構造の完全性および/または上皮細胞形態を変化させる可能性のある損傷を防ぐことにより、フラットマウントイメージングよりも有利です。さらに、上皮細胞と線維細胞の間の界面が保持されます。この方法は、 表面 イメージングにより空間分解能が高く、上皮細胞領域と核領域の分析が可能になるため、レンズ切片の視覚化よりも利点があり、選択した領域(つまり、ここに示すように、中外側)または細胞の他の領域を形作ることができます。さらに、イメージング法により、レンズの赤道領域に沿った特定のポイントでの形態学的特徴を定量化できるため、空間分解能の不足や切片作成時に発生する可能性のある組織の歪みにより、イメージング染色レンズ切片では容易に達成できない六角形形状、子午線列細胞パッキング、支点、およびファイバーセル幅の視覚化が可能になります。 
概説されたプロトコルでは、ライブレンズのイメージングにより、特定のレンズ構造と細胞を経時的に追跡することもできます。ライブレンズイメージングプロトコルは、以前の研究で役立ちました、 レンズの平坦化を誘発するために、レンズ圧縮前後の同じレンズからの細胞の亜集団からのカプセルの厚さと上皮細胞面積の繰り返し測定分析が行われました4。水晶体の圧迫は、カプセルの厚さの減少と上皮細胞面積の増加を誘発することが判明しました。個々のレンズ間でカプセルの厚さと上皮細胞面積に大きなばらつきがあり、レンズの圧縮によって引き起こされるこれらのパラメータへの影響の大きさのため、独立した測定デザインを使用した場合(つまり、個々の非圧縮レンズと個々の圧縮レンズを比較する)を使用すると、違いを検出することは困難です。ライブイメージング法を用いて、生きた上皮細胞におけるF-アクチン再編成の追跡を可能にする上皮細胞22のF-アクチンを可視化するために、LifeACT-GFP26を内在的に発現する生きたマウスレンズのホールマウントイメージングを実施しました。
概説されたプロトコルはマウスレンズのイメージング用に開発され、他の種の水晶体構造を視覚化するために適応される可能性がありますが、他のげっ歯類レンズ(ラット、モルモット)および他の哺乳類レンズ(ウシ、マカク、およびヒト)のレンズの前部および赤道末梢構造の両方を視覚化するための染色プロトコルは、データは示されていません。より大きなレンズで構造を可視化するには、より長い固定(4%PFA、氷上、4時間)、ブロッキング(1時間)、染色(一晩、4°C)が必要です。注目すべきは、異なる種でのイメージングは固定レンズでのみ行われたことです。ライブイメージングプロトコルでは、蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスのレンズを使用するため、他の種由来のレンズのライブイメージングは困難な場合があります。したがって、このイメージングは、遺伝子組み換えが一般的ではない他の種のイメージングレンズを排除する可能性があります。しかし、マウス水晶体を親油性プローブFM4-64またはF-アクチン結合プローブSiR-ジャスプラキノリド(SiR-アクチン)でそれぞれプレ染色することにより、水晶体上皮細胞膜またはF-アクチンのライブ可視化を行うことができました(図示せず)。このようなプローブを使用して、他の種のライブレンズを画像化できる可能性があります。ただし、このようなプローブを使用する場合は、オフターゲット効果を回避するために注意が必要です。例えば、SiR-ジャスプラキノリドは、F-アクチンダイナミクスの変化をもたらす可能性がある27。ライブレンズであろうと固定レンズであろうと、染色法のもう一つの限界は、そのようなプローブの浸透が限られていることです。そのため、撮像は周辺領域に限定される。tdTomatoトランスジェニックマウス4のレンズを用いて、内部領域(すなわち、深部線維細胞)をイメージングすることが可能であり、これもまた蛍光タンパク質のトランスジェニック発現に依存している。また、この発現は、深部ファイバー細胞の明るいシグナルに対して十分な高さでなければなりません。 
それにもかかわらず、概説されたプロトコルにより、周辺レンズの特徴の効果的な形態学的定量が可能になりました2,4,20。定量化の方法論は効果的で、オープンソースで公開されているFIJI ImageJソフトウェアを使用しています。関心領域の識別には手動トレース ツールが使用されていましたが、関心領域の識別を自動化できる場合があります。自動化は、特定の構造(核境界など)をFIJI ImageJベースで同定するためのコントラストを高めるために蛍光閾値を適用するのと同じくらい簡単な場合もあれば、細胞形状の違い(不規則な上皮細胞や繊維細胞の形状など)を検出するためのより複雑な機械学習アルゴリズムを適用するのと同じくらい簡単な場合もあります。より複雑な分析には、専用のプラグインまたはイメージングソフトウェアが必要になる場合があります。専用のプラグインまたはソフトウェアを使用すると、取得したzスタックから3D体積形態測定値を取得することもできます。全体として、説明されている定量化法は簡単にアクセスでき、費用対効果が高く、多くの有用なアウトカム指標に適していますが2,4,20、イメージングプロトコルプラットフォームは、高度なソフトウェア分析と組み合わせることで、将来の研究のための豊富な追加の形態学的測定を提供する可能性があります。
水晶体は、細胞の位置と深さに依存する形状とそれに関連する構造に依存する特殊な機能を持つ複雑な生体組織です。ここで紹介したイメージングプロトコルと定量法を用いることで、レンズ構造やレンズの複雑な構成がどのように確立されているかをより深く理解することができます。さらに、イメージングプロトコルと定量化方法は、レンズの構造と機能の関係を描写するのに役立ちます。

眼水晶体は、眼の前部に位置する柔軟で透明な組織で、網膜に光を細かく合わせる役割を果たします。レンズが機能する能力は、部分的には、その複雑なアーキテクチャと構成に起因する可能性があります1,2,3,4,5,6。水晶体組織を取り囲むのは、水晶体構造と生体力学的特性を維持するために不可欠な基底膜であるカプセルです7,8,9。水晶体自体は完全に細胞状で、上皮細胞と繊維細胞の2種類の細胞で構成されています。上皮層は、レンズ10の前半球を覆う直方体細胞の単層からなる。生涯を通じて、上皮細胞は増殖し、水晶体嚢に沿って水晶体赤道に向かって移動します。前上皮細胞は断面が静止し、丸石であり、水晶体赤道付近では上皮細胞が増殖し、新しい線維細胞への分化過程を経始める11,12。赤道上皮細胞は、ランダムに詰められた細胞から、六角形の細胞を持つ組織化された子午線列に変化します。これらの分化細胞の基底側では六角形の細胞形状が維持され、頂端側は水晶体の支点またはモディオラスで収縮して固定されます4,13,14,15。赤道上皮細胞が新たに形成された線維細胞に伸長し始めると、細胞の頂端先端は前上皮細胞の頂端表面に沿って前極に向かって移動し、基底の先端は水晶体嚢に沿って後極に向かって移動します。新世代の繊維細胞は、前世代の細胞に重なり、繊維の球状の殻を形成します。細胞の伸長および成熟過程において、繊維細胞はそれらの形態を実質的に変化させる11,12,16。これらの繊維セルは、レンズ質量11、12、16、17、18の大部分を形成する。
複雑な水晶体の微細構造、細胞形態、およびユニークな細胞組織の確立に寄与する分子メカニズムは、完全にはわかっていません。さらに、水晶体嚢と細胞構造が水晶体全体の機能(透明度、水晶体形状の変化)に寄与するかどうかは不明です。しかし、これらの関係は、新しいイメージング方法論と、水晶体の構造的および細胞的特徴の定量的評価を使用して解明されています2,4,19,20,21,22。水晶体嚢、上皮細胞、末梢線維細胞の高空間分解能可視化を可能にするレンズ全体を画像化するための新しいプロトコルが開発されました。これには、カプセルの厚さ、細胞サイズ、細胞核のサイズと真円度、子午線の行順序、繊維細胞の充填、および繊維細胞の幅を定量化する方法論が含まれます。これらの可視化および画像定量化法は、詳細な形態測定検査を可能にし、全体的な3D組織構造を保持することにより、他の可視化法(フラットマウントまたは組織切片のイメージング)よりも優れています。これらの方法により、新しい仮説の検証が可能になり、水晶体細胞パターンの発達と機能の理解が継続的に進むことが期待されます。
以下の実験では、野生型およびRosa26-tdTomatoマウスのタンデム二量体-トマト(B6.129(Cg)-Gt(ROSA)(tdTomato)23 (Jackson Laboratories))を、雌雄6週齢から10週齢までのC57BL/6Jバックグラウンドで使用しました。tdTomatoマウスは、N末端ミリスチル化および内部システイン-パルミトイル化部位を介して原形質膜を標的とする変異MARCKSタンパク質のN末端8アミノ酸に融合したtdTomatoタンパク質の発現により、ライブレンズ内の細胞原形質膜の可視化を可能にする23。また、Robert Adelstein博士(National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD)から入手したNMIIAE1841K/E1841K マウス24 も用いる。前述したように、20に示すように、CP49ビーズ状中間フィラメントタンパク質の欠損(成熟した線維細胞の形態および全水晶体バイオメカニクスを維持する)を有するFvBN/129SvEv/C57Bl6バックグラウンドのNMIIAE1841K/E1841Kマウスを、C57BL6/J野生型マウスと戻し交配した。野生型CP49対立遺伝子の存在について子孫をスクリーニングしました。 
共焦点イメージングは、20倍(NA=0.8、作動距離=0.55mm、1倍ズーム)、40倍(NA=1.3オイル対物レンズ、作動距離=0.2mm、1倍ズーム)、または63倍(NA=1.4オイル対物レンズ、作動距離=0.19mm、1倍ズーム)のレーザー走査型共焦点蛍光顕微鏡で行った。すべての画像は、光学断面の厚さの決定要因であるピンホールサイズを使用して、1エアリーユニットで取得されました(結果の光学厚さは図の凡例に記載されています)。画像はZen Softwareで処理しました。画像は.tif形式にエクスポートされ、FIJI ImageJ Software (imageJ.net) にインポートされました。

<table><tbody><tr><td>3 mm 生検パンチ</td><td>Acuderm Inc</td><td>NC9084780</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-102GP</td><td></td></tr><tr><td>抗真菌薬/抗生物質</td><td>Cytiva</td><td>SV30079.01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (フラクション V)</td><td>プロメテウス</td><td>25-529</td><td></td></tr><tr><td>デリケート タスク ワイプ</td><td>キムワイプ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス底皿 (フルオロディッシュ)</td><td>ワールドプレシジョンインターナショナル</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡880</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MatTekイメージングディッシュ</td><td>MatTekライフサイエンス</td><td>P35G-1.5-14</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>100503-917</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GenClone</td><td>25-507B</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red-free medium 199</td><td>Gibco</td><td>11043023</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>00027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>WGA-640</td><td>Biotium</td><td>CF 640R</td><td></td></tr></tbody></table>

末梢レンズの構造、細胞形態、組織を可視化・定量化するためのホールマウントイメージング

Whole Mount Imaging to Visualize and Quantify Peripheral Lens Structure, Cell Morphology, and Organization

眼球レンズは透明で柔軟な組織で、その形状を変化させてさまざまな距離からの光を網膜に集束させます。水晶体は、被膜と呼ばれる器官を取り囲む基底膜を除けば、前半球の上皮細胞の単層と水晶体線維細胞の塊からなる完全な細胞である。上皮細胞は生涯を通じて水晶体赤道の発芽帯で増殖し、赤道上皮細胞は遊走、伸長、分化して新たに形成された線維細胞になります。赤道上皮細胞は、ランダムに詰め込まれた丸石型の細胞から、子午線列を形成する整列した六角形の細胞に形態を実質的に変化させます。新たに形成されたレンズ線維細胞は、六角形の細胞形状を保持し、前極および後極に向かって伸び、前世代の線維に重ねられた細胞の新しいシェルを形成します。水晶体上皮細胞から線維細胞への顕著な形態形成を促進するメカニズムについてはほとんど知られていません。レンズの構造、発達、機能をよりよく理解するために、接眼レンズのマウント全体を使用して末梢構造を画像化する新しいイメージングプロトコルが開発されました。ここでは、カプセルの厚さ、上皮細胞面積、細胞核面積と形状、子午線列細胞の順序と充填、および繊維細胞幅を定量する方法を示します。これらの測定は、生涯にわたる水晶体の成長中に発生する細胞の変化を解明し、加齢や病態によって発生する変化を理解するために不可欠です。

前水晶体嚢、上皮細胞領域、および核領域 水晶体カプセルの厚さを分析するために、ライブレンズまたは固定レンズのいずれかで水晶体カプセルをWGAで染色しました。水晶体上皮細胞は、ライブレンズでtdTomatoで膜を標識するか(図2A)、または固定レンズの細胞膜でF-アクチンをローダミン-ファロイジン染色(図2B)することで同定しました。直交(XZ)投影法では、WGAおよびtdTomato/rhodamine-phalloidinの染色により、蛍光強度のピークtoピークラインスキャン分析を行うことができます。WGAチャネルのメジャーピークは被膜表面を示し、tdTomato/rhodamine-phalloidinチャネルのメジャーピークは上皮細胞の基底領域を示します。これらのピーク間の距離を計算することで、被膜の厚さを得ることができます。ラインスキャン解析の結果、生眼レンズ9週齢マウスのカプセルの厚さは11.2μm、9週齢の固定レンズマウスのカプセルの厚さは12.5μmであった。これらの観察されたカプセルの厚さは、以前の調査結果2,4を代表しています。
tdTomato標識トランスジェニックマウスレンズ(またはローダミン-ファロイジン染色レンズ;図示せず)のホールマウントイメージングにより、上皮細胞の形態をライブで可視化できます。直交(XZ)投影は水晶体上皮細胞の側面図を提供し、側面領域の平面(XY)図は上皮多角形形状の視覚化を可能にします。健康な水晶体では、細胞間に隙間は見られません。画像内の細胞の集団をトレースし、その面積をROI内の細胞数で割ることで、平均細胞面積を計算できます。細胞数は、所与のROIにおけるヘキスト染色核の数をカウントすることによって決定される。この分析では、平均細胞面積が260μm2であることが示され、これは以前の研究と一致しています2,4。
核のヘキスト染色は、上皮細胞における水晶体上皮細胞核形態測定の検査も可能にします。直交(XZ)投影により、原子核の側面図が可能になります。平面(XY)ビューは、原子核の円形/楕円体形状を示しています。核を追跡することで、個々の細胞の核面積や、真円度などの形状パラメータを計算できます。この分析では、平均核面積が64μm2、平均真円度が0.8であることが実証されています。真円度の値が 1 に近い場合は完全な円を示し、0 に近い値はより細長い形状を示します。
赤道上皮細胞パッキング、ファイバーセル六角パッキング、およびファイバーセル幅 水晶体赤道領域の平面(XY)図は、支点に収束する六角形の規則的に充填された水晶体上皮細胞を示しています。支点は、赤道4,13,14,15での最初の線維細胞の分化と伸長の間に、伸長する上皮細胞の頂端先端が収縮してアンカーポイントを形成する場所です(図6B、赤い破線で示)。支点は、赤道上皮細胞と線維細胞を隔てる連続線を形成するF-アクチン染色の増加に基づいて局在化できます(図6B、赤い破線)。また、細胞膜でのF-アクチン染色では、支点の下の細胞が正確に整列し、平行に並んでいる細胞形状の変化も見られます(図6)。細胞核も支点の下に整列しています。
水晶体子午線上皮細胞および線維細胞を可視化するために、子午線列細胞の基底領域が視野に入るXY平面上の支点(水晶体嚢に向かって)の周辺4.5〜5μmの画像を、前述のように選択する20。子午線列の乱れを測定するために、関心領域(ROI)の輪郭を描きます(図7A、黄色のボックス)。野生型レンズ像におけるROIの面積は15,833μm2である。観察可能な障害がないため、障害の面積の割合は 0 です。NMIIA-E1841K変異を有するマウスを用いた細胞六角形パッキングにおいて、非筋肉ミオシンIIA(NMIIA)が果たす重要な役割は、以前にも報告されている20。図7Aは、南北行細胞障害を示す代表的なNMIIAE1841K/E1841Kレンズ赤道画像を示す。子午線列のROIは20,757μm2でした。次に、無秩序なパッチの総面積を追跡しました。障害の総面積は3,185μm2であった。計算された障害の割合は15.3%(障害領域 x 100/総ROI;図7B)。この無秩序な領域の割合は、以前の研究20の範囲内にあります。
次に、野生型子午線列細胞における六角形パッキングの検討が実証された20。F-アクチンは、子午線列細胞の全周および野生型(NMIIA+/+)レンズの細胞膜基底領域の6つの頂点すべてに濃縮されているため、F-アクチン染色を使用して細胞の形状と充填組織を評価しました。代表画像1では、細胞を標識し、各細胞の周囲に隣接する細胞の数をカウントしました。画像1では、10個のセルすべてに6つの隣接するセルがあり、これらのセルがハニカム充填組織に配置されていることを示唆しています(図8)。対照的に、10個の細胞のうち8個(細胞の80%)には、細胞が不規則に詰まっていることを示す6つの隣接する細胞があります(図8)。
最後に、線維細胞の幅を測定するために、ローダミン-ファロイジンで標識した固定野生型レンズの支点から~10 μm内側に位置する末梢線維細胞を調べました(図9A)2,4。なお、生きたtdTomatoマウスを用いてファイバー細胞の幅を測定することも可能ですが、tdTomatoではヘテロ接合体であるレンズからの信号は赤道域では弱い傾向にあります。したがって、tdTomatoのホモ接合体マウスは、より強い蛍光を示すことがわかっているので、使用することをお勧めします(図示せず)。ラインスキャン分析を用いてF-アクチン染色細胞境界間の距離を前述のように測定し、ファイバー細胞幅2,4を示しました(図9B)。この解析により、野生型レンズの平均ピーク間距離は11.45 μm±2.11 μmであることが明らかになりました(4つの異なるマウスレンズ画像からのN = 117ファイバー細胞、図9B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig01.jpg"> 図1:イメージング中にレンズを固定するためのアガロースディボットを作成する手順。 (A)ガラス底のディッシュを使用して、2%アガロースを液化ピペットで採取した。(B)フレキシブルカバースリップで平らにし、(C)冷めたら、細い先端鉗子を使用して取り外します。(D)くぼみには、3mmの生検パンチを使用して穴を開けます。(E)残留アガロスを吸引し、PBSですすぎ、糸くずの出ないティッシュで表面をきれいに拭き取ります。(F)レンズ全体をディボット内に慎重に取り付けます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig02.jpg"> 図2:レンズ赤道上皮細胞および線維細胞をイメージングするためのアガロースディボットを作成する手順。 (A)2%溶融アガロースを組織培養皿に流し込む。(B)アガロースが完全に固まるまで室温で冷却する。(C)鋭利な刃で、三角形のディボットを作成します。(D)1 mLの1x PBSを組織培養皿に入れます。(E)解剖したレンズをくさびに置き、 (F) レンズをアガロース壁の間に挟んだ赤道上に立てかけます(赤い矢印)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig03.jpg"> 図3:レンズカプセルの厚さの決定。 (A)ライブレンズカプセルと(B)固定レンズカプセルの共焦点zスタックの再構成からの矢状(X、Z平面図)光学セクション。(C)ライブレンズおよび(D)固定レンズのラインスキャンの蛍光強度は、カプセルの上面とカプセルに隣接する上皮細胞の基底領域(赤)に対応する単一のWGA(緑)ピークを示しています。2つのピーク間の距離を測定して、カプセルの厚さを定量化します。40倍のオイル対物レンズと1つのエアリーユニットピンホールを使用して取得した画像は、tdTomato/Rhodamine-PhalloidinチャンネルとWGAチャンネルにそれぞれ1.0 μmと1.2 μmの光学切片をもたらしました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig04.jpg"> 図4:上皮細胞面積の定量化。 (A)水晶体上皮細胞のX、Z平面図で、細胞膜には(B)tdTomato、核には(C)Hoechst。(d)水晶体上皮細胞の中央領域のX、Y平面図。(E)tdTomatoシグナルは、焦点が合わされている細胞のグループに対応する関心領域を定義するためのガイドとして使用されます。(F)定義された領域の面積が決定されます。(G)核のヘキスト染色は、定義された領域内の細胞数を決定するために使用されます。(H)原子核の数は、(I)FIJI ImageJのマルチポイントツールを使用してカウントされます。平均セル面積を計算するには、定義された関心領域の総面積をセルの総数で割ります。63倍のオイル対物レンズと1つのエアリーユニットピンホールを使用して取得した画像は、HoechstチャンネルとtdTomatoチャンネルにそれぞれ0.7 μmと1.0 μmの光学切片をもたらしました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig05.jpg"> 図5:核の面積と形状の決定。 (A)原子核中央領域のXY平面図。(B)核に焦点が合っている関心領域が定義されました。ROI内の核が概説されます。(C)個々の細胞の核の面積と真円度を表にし、面積と真円度の平均を算出した。63倍のオイル対物レンズを使用し、1つのエアリーユニットのピンホールを使用して取得した画像は、ヘキストチャンネルの光学断面が0.7 μmになりました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig06.jpg"> 図6:レンズ支点の同定。 F-アクチンと核は、支点と子午線の列を識別するために使用できます。(A)XZビューは、支点に対応するF-アクチンのファロイジン染色を濃縮した図です。(B)レンズの支点に焦点を合わせた単一の光学XY平面図セクション。核のヘキスト染色では、支点の上の核は不規則に詰まっているのに対し、支点の下の核は正確に整列していることがわかります(右上)。F-アクチンのファロイジン染色では、支点の上の細胞は不規則な形をしているのに対し、支点の下の細胞は平行に並んでいることが分かります(左下)。赤い破線は支点の位置を示しています。20倍の対物レンズと1つのエアリーユニットピンホールを使用して取得した画像は、Hoechst、Rhodamine-Phalloidin、WGA-640チャンネルでそれぞれ1.5 μm、2.0 μm、2.2 μmの光学切片をもたらしました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig07.jpg"> 図7:子午線乱れの判定 (A)野生型とNMIIAE1841K/E1841K 子午線列細胞の単XY平面図光学切片は、支点から~5μm離れています(水晶体嚢に向かって)。子午線の列セル全体が、核のアライメントに基づいて青色の輪郭で囲まれています。野生型水晶体におけるF-アクチン(赤)染色は、子午線列細胞が正確に整列しており、障害の徴候がないことを示しています(0%)。野生型の代表的な順序付き領域が概説されています(オレンジ色)。細胞が乱れているレンズでは、無秩序な領域(黄色)の輪郭を描きます。(B)野生型から秩序化された領域の高倍率(Aのオレンジ色のボックス)。(C)列の分岐、(II)不規則な細胞形状とハニカムパッキンの喪失、(III)列のずれなど、さまざまなタイプの障害を示す無秩序領域の高倍率。NMIIAE1841K/E1841K レンズの画像は、15.3%の経絡行細胞障害を示しています。20倍対物レンズと1つのエアリーユニットピンホールを使用して取得した画像は、ヘキストチャネルとローダミン-ファロイジンチャネルでそれぞれ1.5 μmと2.0 μmの光学切片をもたらしました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig08.jpg"> 図8:レンズ子午線細胞ハニカムパッキングの分析。 (A)F-アクチンのローダミン-ファロイジンで染色した子午線行細胞の単一光学XY切片。低倍率の画像(上パネル)は、評価中のセルを示しています(ピンク色の番号)。黄色で囲まれた領域が拡大されています(下図)。黄色のローマ数字は、隣接するセルの数です。画像 1 は、すべて六角形のセルで、それぞれに 6 つの隣接するセルがあるセルを示しています。画像 2 には、セル番号 1 と 5 にそれぞれ 5 個と 7 個の隣接するセルがある不規則性があります。(B)データを記録し、計算した六角形のセルの割合を集計します。40倍対物レンズと1つのエアリーユニットピンホールを使用して取得した画像は、ローダミン-ファロイジンチャネルの光学切片が1.0 μmになりました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66017/66017fig09.jpg"> 図9:ファイバーセル幅の分析。 (A)支点から~10μm以内のレンズファイバーセルの単一の光学XYビューセクション。細胞をローダミン-ファロイジンで染色し、細胞膜でのF-アクチンの可視化を行いました。線(ピンク、ダッシュ)が多数のファイバーセルの上に引かれます。(B)距離の関数としてのF-アクチン強度の代表的なラインスキャン。ピーク間距離は、ファイバーセルの幅を表します。40倍対物レンズと1つのエアリーユニットピンホールを使用して取得した画像は、ローダミン-ファロイジンチャネルの光学切片が1.0 μmになりました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66017/66017fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

現在のプロトコルはイメージの定量化のための方法の眼球レンズの末梢構造の視覚化のための新しい全台紙のイメージ投射を記述する。これらのプロトコルは、レンズのマイクロスケール構造とレンズの発達/機能との関係をよりよく理解するための研究に使用できます。

The ocular lens is a transparent flexible tissue that alters its shape to focus light from different distances onto the retina. Aside from a basement ...

私たちは、複雑なレンズ構造を確立する分子メカニズムと、この確立された構造が透明度やレンズ形状変化におけるレンズ機能をどのように制御しているかを明らかにすることを目指しています。本分野では、水晶体の特徴を高い空間分解能で可視化できる新しいイメージング手法を用いて、水晶体の構造や細胞の特徴を定量的に画像解析しています。ホールマウントイメージングは、組織切片の可視化やフラットマウント手順よりも、組織全体の3D構造を保存できるため、有利です。これにより、天然レンズ構造の詳細なモルフォメトリック検査と定量化を行うことができます。このレンズは、細胞とそれに関連する構造の局在化と深さに依存する形状に依存する特殊な機能を持つ統合された生体組織です。実証されたイメージングプロトコルと定量法を使用することで、レンズ構造とレンズの複雑な構成がどのように確立されるかをより深く理解することができます。

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