Name: (CARIC) 戦略をキャプチャするキャプチャとクリック化学支援 RNA インタラクトームを用いた RNA 結合タンパク質の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学ぶCARIC法によるRNA結合タンパク質の同定プロトコル。HeLa細胞を用いたクリック化学支援RNAインタラクトームキャプチャで、転写後制御メカニズムの包括的理解を実現します。

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この作品は、国立自然科学基礎の中国の助成金 91753206、21425204 と 21521003 とキーの研究と開発プロジェクト 2016YFA0501500 によってサポートされます。

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li>
<li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration%3A+Seq+and+you+shall+receive%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li>
<li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li>
<li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome%3A+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li>
<li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nsmb/journal/v20/n1/abs/nsmb.2468.html">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li>
<li>Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li>
<li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li>
<li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li>
<li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128(2016).</li>
<li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li>
<li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li>
<li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei%3A+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li>
<li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068(2017).</li>
<li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li>
<li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).</li>
<li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly%28A%29+tail+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li>
<li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly%28A%29+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li>
<li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li>
<li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li>
<li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , Published online (2018).</li>
</ol>

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公正な RNA の整合性の維持は、CARIC 実験の成功へのキーの 1 つです。Cu(I) と慎重な作戦の適切な配位子、RNA の劣化が大幅に削減、部分的な低下が観察されたが。EU の実験サンプルに 4SU 置換率は、それぞれ 1.18% と 0.46% (データは示されていない)。2,000 の長さでそのまま Rna の nt、Rna の ~ 90% 含まれている少なくとも 1 つの EU と 1 つの 4SU。1,000 の長さに部分的に劣化した Rna の nt、Rna の ~ 70% 含まれている少なくとも 1 つの EU と 1 つの 4SU。したがって、Rna の部分的な分解が大幅に減らない CARIC、効率劣化は受け入れられません。
もう一つの重要なステップは、ステップ 1.4、クリック反応のための準備です。銅 (I)-Rna の触媒クリック反応は LDS 濃度に敏感。LDS の高濃度 (> 0.1%)、EU を含む Rna 上の信号および蛋白質 (データは示されていない) でのバック グラウンド信号の増加のラベリングの減少に します。
<p class="j...

様々 なタイプのコーディングおよび非翻訳 Rna (ncRNAs) Mrna、Rrna、Trna など、小さな核 Rna (目的)、核小体低分子 Rna (snoRNAs)、および長い非コード Rna (lncRNAs)1人間のゲノムを転写します。これらの Rna のほとんどは、Rbp の服を所有している、リボ核タンパク質粒子 (結合)2として機能します。したがって、Rbp の網羅的同定は、様々 な人間の病気3,4,5に関与する Rna と Rbp、間規制のネットワークを理解するための前提条件です。
過去数年間は、様々 な真核生物システム2,6、人間7,8,9,10,11, を含む発見 Rbp の大きな後押しを目撃しています。マウス12,13,14, 酵母9,15,16, ゼブラフィッシュ17,キイロショウジョウバエ18,19、線虫16、シロイヌナズナ20,21,22、および人間の寄生虫23,24,25.これらの進歩は、カステッロらによって開発された RBP 捕獲作戦によって促進されています。7 Baltzら2012生体内でUV 架橋 RNA と相互作用するタンパク質、Rna、ポリ a のランダムプライマー キャプチャおよび質量分析法 (MS) を組み合わせた8 -プロテオームのプロファイリングに基づきます。しかし、その多は大抵のみ ~ 3% % を占める - 5 真核生物のトランスクリプトーム26の成熟した mrna 発現に存在している事実を考えるとこの広く使用されている戦略はありません Rbp non-poly(A) Rna が、ほとんど ncRNAs を含むとの相互作用をキャプチャできます。Mrna。
ポリ a と non-poly(A) の両方の Rbp27のトランスクリプトーム捕獲のための最近開発された戦略の手順の詳細を報告する.CARIC と呼ばれる、この戦略は生体内でUV 架橋と (クリック反応に参加することができます bioorthogonal 機能グループを含んだ) 活性型と「クリック」のヌクレオシド アナログ、rna 代謝ラベリングを組み合わせた 4-thiouridine (4SU)、および 5-ethynyluridine (EU)。CARIC 戦略と理想的な結果を得るための鍵となる手順は、効率的な代謝ラベリング、UV 架橋・ クリック反応と RNA の整合性の維持です。Cu(I) クリック反応の触媒として使用される Rna の断片化が発生することができます、ため RNA 断片化を減らすことができる Cu(I) リガンドは不可欠です。我々 は RNA の劣化を引き起こすことがなくセル lysates の効率的なクリック反応を実行する方法について説明します。
RBP をキャプチャ、HeLa 細胞の同定のみこのプロトコルに記載されては、様々 な細胞タイプにして生物 CARIC 戦略を適用できます。RBP キャプチャ以外にもこのプロトコルはまた MS 試料調製とタンパク質の同定及び定量プロテオミクス実験に慣れていない人のために役立つことができる合理化されたステップバイ ステップの手順を提供します。

<table><tbody><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM(ダルベッコ改変イーグルミディアム)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS(ウシ胎児血清)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン&ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>EU (5-エチニルウリジン)</td><td>Wuhu Huaren Co.</td><td>CAS:69075-42-9</td><td></td></tr><tr><td>4SU(4-チウリジン)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T4509</td><td></td></tr><tr><td>10回;PBS(リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UV架橋剤</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td>365nmUVランプ搭載</td></tr><tr><td>DEPC(ジエチルピロカーボネート)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D5758</td><td>水を処理します。毒性が強い!</td></tr><tr><td>トリス&middot;HCl、pH 7.5</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Biodee</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88265</td><td>50mL溶解バッファー1錠。</td></tr><tr><td>LDS(ドデシル硫酸リチウム)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 限外ろ過チューブ(10 kDaカットオフ)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 限外ろ過チューブ(10 kDaカットオフ)</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin磁気ビーズ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>DMSO(ジメチルスルホキシド)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>41639</td><td></td></tr><tr><td>アジド-ビオチン</td><td>クリック化学ツール</td><td>AZ104</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅(II) シ</td><td>グマ アルドリッチ</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>THPTA [トリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン]</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>762342</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>アジド-Cy5</td><td>クリック化学ツール</td><td>AZ118</td><td></td></tr><tr><td>LDSサンプルバッファー(4回;)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>10% bis-Tris gel</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NP0301BOX</td><td></td></tr><tr><td>EDTA サー</td><td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイ15525017</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Brij-97 [ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル]</td><td>J&K</td><td>315442</td><td></td></tr><tr><td>トリエタノールアミン</td><td>Σ Aldrich</td><td>V900257</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン アガロース</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Σ Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>サルコシル (N-ラウロイルサルコシン ナトリウム塩)</td><td>Σ</td><td>Aldrich 61743</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>Σ Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td></td><td></td><td>バージョン:1.5.5.1</td></tr></tbody></table>

(caric) 戦略をキャプチャするキャプチャとクリック化学支援 rna インタラクトームを用いた rna 結合タンパク質の同定

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

RNA 結合タンパク質 (Rbp) の包括的な同定は、細胞の転写制御ネットワークを理解する鍵です。RBP キャプチャのため広く使用されている戦略を悪用、起こる [多] ターゲット Rna の正体不明 non-poly(A) Rna のほとんどの結合蛋白質を残して、真核生物の成熟 Mrna に大抵起こる。ここでクリックして化学支援 RNA インタラクトーム キャプチャ (CARIC) の代謝ラベリングを組み合わせることによりポリ a と non-poly(A) の両方の Rbp のトランスクリプトーム キャプチャを有効にすると呼ばれる最近報告された方法の詳細な手順を説明します。Rna は生体内でUV 架橋、bioorthogonal のタグ付け。

品質管理手順の代表の結果が掲載されています。結果には、2.3.2 (図 1) の手順で説明されているゲルの蛍光分析、4.1.3 (図 2 a) の手順に従って西部のしみの分析と手順 4.2.2 (図 2 b) で説明した銀染色分析の数字が含まれます。品質管理の手順は、CARIC プロトコルの最適化のために重要です。品質管理は、大規模の RBP 同定実験の準備常にあります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58580/58580fig1.jpg"> 図 1: ゲル 2.3.2 の手順に記載されているラベルをクリックしますサンプルの蛍光分析します。(<st...

両方符号化へと非コードを結合する蛋白質を識別するためにクリックして化学支援 RNA インタラクトーム キャプチャ (CARIC) 戦略を適用するための詳細なプロトコル、Rna が表示されます。

(CARIC) 戦略をキャプチャするキャプチャとクリック化学支援 RNA インタラクトームを用いた RNA 結合タンパク質の同定

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

この方法であるCARICは、RNA結合タンパク質の包括的な国勢調査を提供することにより、遺伝子レクリエーションの転写後の分野における重要な質問に答えることができます。CARICの主な利点は、mRNAや非コードRNAなどの様々な種類のRNAに結合したタンパク質を捕捉できることです。この方法は、様々なタイプおよび生物に使用して、働くRNAタンパク質相互作用を研究することができる。まず、5%のCO2雰囲気で摂氏37度でDMEMを補充したHeLa細胞を培養する。細胞が約80%の合流に達すると、各皿の培養培地を15ミリリットルの前温め、新鮮な培地に置き換えます。1ミリモルの最終濃度に各皿に100ミリモルEUの15マイクロリットルを追加します。実験的でUV制御サンプルがない場合、各皿に100ミリモル4 SUの7.5マイクロリットルを加えます。ホイルで皿を覆い、前の条件を使用して16時間細胞を培養します。この後、EUおよび/または4つのSUの以前の量の半分を適切なプレートに加え、さらに2時間培養を続けます。生体内で架橋を開始するには、培養培地を取り出し、1回5ミリリットルのPBSを使用してPBSで各皿を3回洗浄する。残留PBSを可能な限り取り除く。実験用で4つのSU制御サンプルがない場合は、蓋を取り除いた氷の上に皿を置きます。UVクロスリンカーを使用して、365ナノメートルで、2ジュール/センチメートル平方メートルでUV光で細胞を照射します。UVコントロールなしのサンプルの場合は、皿を氷の上に置き、光から保護します。次に、各皿にプレプレシスバッファーを1ミリリットル加えます。ゴム製セルリフターを使用して細胞を削り、15ミリリットルチューブにプレプレシス懸濁液を回収します。2皿の懸濁液を含むチューブにプレシスバッファーを加え、総容量を6ミリリットルに調整します。次に、R lysis バッファーの等しいボリュームを追加します。細胞のライセートを細い針で数回通して、リセートが透明で均質になるまで渡します。1時間穏やかな回転で摂氏4度でリゼートをインキュベートします。この後、20体積の希釈バッファーで溶解液を希釈し、15ミリリットルの未Tra濾過チューブで15ミリリットルの分画に分割し、10キロダルトンの分子カットオフ。スイングバケットローテーターを使用して、各分画が1ミリリットル未満の体積に濃縮されるまで、約15分間、Gの4000倍と摂氏4度でチューブを回転させます。各濃縮溶解液分数に希釈バッファーの14ミリリットルを追加し、濃度プロセスを繰り返します。次に、画分を組み合わせ、前述の濃縮プロセスを使用して6ミリリットルの体積に濃縮します。まず、テキストプロトコルで概説されているように反応ミックスを準備します。この反応ミックスを6ミリリットルの予めクリアしたライセートに加え、よく混ぜます。162.5マイクロリットルの還元試薬を加え、よく混ぜます。800 rpm の軌道シェーカーの室温で2時間インキュベートします。この後、5ミリモルEDTAを加え、室温で軌道シェーカーに5分間インキュベートすることによって反応を焼き付ける。次に、反応混合物を2本の50ミリリットルチューブに分割し、それぞれに4量の予冷メタノールを含み、30分間摂氏30度の負の30度でインキュベートする。4000倍Gで遠心分離機、摂氏4度で15分間。上清を捨て、前冷やしたメタノールを1~2ミリリットルの間でペレットに加えます。ペレットを上下にピペットして、ペレットが目に見える塊なしで完全に中断することを確認します。遠心分離と再懸濁プロセスを2回繰り返します。この後、ペレットを乱さないように、できるだけ残存メタノールを慎重に引き出します。10ミリリットルの再構成バッファーを加え、ペレットを溶解するために上下にピペットします。4000倍Gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。その後、上清を新しいチューブに移し、20マイクロリットルのサンプルを確実に採取して品質管理を行います。クリーンアップし、再構成したサンプルを、調製されたストレプトアビジンアガロースビーズに移します。一晩穏やかな回転で摂氏4度でインキュベート。ビーズをGの4000倍で5分間回転させます。上清を新しいチューブに移し、20マイクロリットルのサンプルを確実に採取して品質管理を行います。12rpmで穏やかな回転で10ミリリットルの洗浄バッファーA.Incubateでビーズを洗浄し、室温で10分間洗浄します。その後、ビーズを4000倍Gで5分間回転させます。上清を取り除き、洗濯と遠心分離プロセスをもう一度繰り返します。テキストプロトコルで概説されているように、洗浄バッファBおよび洗浄バッファCに対してこの洗浄プロセスを繰り返します。この後、50ミリモルトリス塩酸塩の10ミリリットルでビーズを洗います。ビーズをGの4000倍に5分間回転させます。上清を取り除き、2つの1.5マイクロ遠心チューブの間でビーズを均等に分割します。捕獲されたRPSを排除するために、洗浄された、落ち着いたビーズの400マイクロリットルに調製されたビオチン溶出バッファーの400マイクロリットルを加える。室温で1500 rpmで軌道シェーカー上で20分間インキュベートする。その後、1500 rpmのヒートブロックと摂氏65度の軌道シェーカーで10分間インキュベートします。7800倍Gでビーズを1分間遠心し、排除されたRNPを収集する。400マイクロリットルの新鮮なビオチン溶出バッファーをビーズに加えます。インキュベーションと遠心分離プロセスを繰り返して第2のエルテを採取し、2つのエルテを1本の15ミリリットルチューブに結合します。次に、結合RNPエルトに3体積の希釈バッファーを加えるし、SDSの濃度を減少させる。0.5ミリリットルの超濾過チューブを使用して、テキストプロトコルで概説されているように、サンプルを約40マイクロリットルに濃縮します。マイクロリットルRNase Aあたり0.5マイクログラムを加え、摂氏37度で2時間インキュベートし、架橋されたRNaseからRRPを放出します。品質管理のためにRPSの2マイクロリットルを集める。CARIC プロトコルを最適化する場合、品質管理の手順は重要です。クリック標識サンプルの代表的な品質管理は、インゲル蛍光分析を介して行われます。二重標識されたサンプルのみが、架橋されたRnPsのシグナルを表す高分子量で強いスミアバンドを示す。RNPシグナルは、4つのSUまたはEUのいずれかを省略することによって廃止される。また、RNaseによる消化によっても廃止A.In、4つのSU対照試料で強いスミアドバンドが観察される場合もある。このバンドは、ほとんどの場合、熱の加入の間に劣化するラベルの非架橋RNaseを表します。アフィニティー投票データの品質管理は、プルダウン前とプルダウン後の両方のサンプル内のビオチン信号を示すウェスタンブロット分析を通じて評価されます。捕獲されたRPSの銀染色分析は、HeLa細胞の場合、一般的な全捕捉効率がインプットタンパク質の0.05~0.1%であることを明らかにしている。この手順を試みる間、RNaseはリボヌクレアーゼに敏感であることを覚えておくことが重要です。RNaseの脱脂を減らすために、実験環境をできるだけ清潔に保ちます。この手順に従って、質量分析を用いたタンパク質アルメイク同定を、鉄の境界タンパク質を明らかにするために前形化することができる。その開発後、CARIC技術は、職場での郵便転写OT規制のより包括的な理解への道を開くでしょう。

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Research

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Biochemistry

生物化学

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RNA-タンパク質相互作用を同定するためのSELEXベースのIn Vitro結合アッセイ

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RNA-タンパク質相互作用は、多くの細胞プロセスの中心にあります。ここでは、特定のRNAを単離し、それに関連する新規タンパク質を同定するin...

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

RNA 結合蛋白質を識別し、紫外線による光架橋と質量分析法を用いた生細胞におけるその RNA...

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

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ランデムにおけるRNA免疫沈殿によるRNAタンパク質複合体の足跡の同定、シーケンシング(RIPiT-Seq)

ここでは、哺乳類細胞におけるRNA結合タンパク質(RRB)のRNA標的を決定するために、フラグビオチンタンデム精製を用いて...

FLAG-ビオチンタンデム精製による架橋と免疫沈降によるタンパク質RNA相互作用のトランスクリプトーム全体プロファイリング

cDNAの速度論的架橋と解析は、生細胞におけるタンパク質-RNA相互作用のダイナミクスを高い時間分解能で調べることができる方法です。ここでは、酵母細胞の増殖、UV架橋、収穫、タンパク質精製、次世代シーケンシングライブラリ調製ステップなど、プロトコルについて詳しく説明します。...

χCRACを用いたin vivoでのタンパク質-RNA相互作用ダイナミクスの高時間分解能モニタリング

ここでは、ヒト細胞からの総タンパク質抽出物、ビオチン化RNAでコーティングされたストレプトアビジンビーズ、および質量分析を使用して、特定のRNA配列のタンパク質相互作用因子を発見、定量、および検証するための最適化された in vitro メソッドを紹介します。...

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

学ぶCARIC法によるRNA結合タンパク質の同定プロトコル。HeLa細胞を用いたクリック化学支援RNAインタラクトームキャプチャで、転写後制御メカニズムの包括的理解を実現します。

(CARIC) 戦略をキャプチャするキャプチャとクリック化学支援 RNA インタラクトームを用いた RNA 結合タンパク質の同定

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