ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

この手順の全体的な目標は、ハイスループットシーケンシングのためにマイクロRNAを偏りなく調製することです。これは、まず、マイクロRNAの3つのプライムエンドへのライゲーションに適したDNAオリゴヌクレオチドを調製または購入することで達成されます。2番目のステップは、3つの主要なDNAオリゴヌクレオチドをマイクロRNAの3つの主要な末端にライゲーションすることです。

次に、ライゲーション産物をゲル精製し、ファイブプライムRNAオリゴヌクレオチドリンカーをマイクロRNAのファイブプライム末端にライゲーションします。最後のステップは、ハイブリッド分子をCDNAに変換し、ポリメラーゼ連鎖反応によってCDNAを増幅することです。最終的には、マイクロRNAクローニングとハイスループットシーケンシングを使用して、マイクロRNAのトランスクリプトームワイドプロファイルを個々のヌクレオチド分解能で定量的に示します。

マイクロシーケンシングマイクロレイqPCRブロットなどの既存の技術に対する当社の技術の主な利点は、当社の技術が単一のヌクレオチド分解能で転写産物の広いラボスケールでのマイクロレイの実際のレベルをより反映していることです。この方法は、マイクロRNAバイオロジーに関する洞察を提供するだけでなく、HC clipやRNA-Seqなどの他のハイスループットシーケンシング技術にも適用できます。この手順のDNAオリゴヌクレオチドは、3つの主要なライゲーション反応用に設計されており、5つの主要なリン酸基、5つのプライム末端にランダムなジヌクレオチド、および3つのプライムシトシンがDNAオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼフリー水で100マイクロモルに希釈する必要があります。

これらの試薬を200ピコモルの3プライムリンカーオリゴヌクレオチド、4マイクロリットルの5プライムDNAA換気緩衝液、4マイクロリットルのTPと4マイクロリットルのM-T-H-R-N-A、リガーゼおよびヌクレアーゼフリー水を組み合わせて、最終容量40マイクロリットルに換気反応を組み立てる。反応を摂氏65度で1時間インキュベートします。摂氏85度に5分間加熱して反応を終了します。

2.5容量の100%エタノールと3分の1容量の10モル酢酸アンモニウムを添加して、TEDリンカーを沈殿させます。残留TPを除去し、将来の反応で予期しないライゲーションを防ぐために、アルコール、塩、オリゴヌクレオチド溶液を混合し、摂氏4度のマイクロ遠心分離機で20分間全速回転して均一にします。ペレットを70%エタノールで洗浄し、空気乾燥させ、適切な量のヌクレアーゼフリー水にペレットを再懸濁して、50〜100マイクロモルの換気オリゴヌクレオチドを生成します。

18%ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動することにより、オリゴヌクレオチドの換気を確認します。ゲル幅24 cmで、室温で1つのXTBEランニングバッファーを使用して、ゲルを30分間予備分析します。30分が経過したら、ランニングバッファーでウェルを洗い流します。

この手順のDNAオリゴヌクレオチドは、3つの主要なライゲーション反応用に設計されており、5つの主要なリン酸基、5つの主要な末端にランダムなジヌクレオチド、および3つの主要なオキシトシンを持つ必要があります。DNAオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼフリー水で100マイクロモルに希釈します。ブロモフェノールブルーがゲルポストの底部までの4分の3になるまで、24ボルト/センチメートルでゲルを泳がせます。

1つのXTBEに1つのx cyber gold溶液でゲルを染色し、UVトランスルミネーターボックスで視覚化します。3つの主要なライゲーション反応のためにM-T-H-R-N-Aリガーゼによる換気を受けたDNAオリゴヌクレオチドのサイズには、単一のヌクレオチドシフトがあるはずです。次のコンポーネントをこの順序で氷上で組み立てます。

1マイクロリットルの50%PEG 8, 000 0.5マイクロリットルの10 XRNAリガーゼ緩衝液。換気された3プライムリンカーの1マイクロリットル、RNA阻害剤の0.5マイクロリットル、総RNAの0.5〜8マイクログラム、T4の0.5マイクロリットル、RNAリガーゼ2、およびヌクレアーゼフリーウォーターの最終容量は5マイクロリットルです。十分に混合したら、ピペッティングで反応を混合します。

反応液を加熱した蓋付きのサーマルサイクラーに入れます。ブロックを摂氏16度に設定し、4時間インキュベートします。なお、反応はライゲーション効率を損なうことなく、最終容量20マイクロリットルまでスケールアップできます。

3つのプライムライゲーションに続いて、等量の2つのXRNAローディングバッファーの熱で摂氏70度に5分間反応を混合し、氷上で冷まします。次のジェル。15%ポリアクリルアミドゲルでサンプルを精製します。

ゲル幅24ボルトセンチメートルでゲルを少なくとも30分間事前に泳動します。電源を切り、ランニングバッファーでウェルを洗い流します。サンプルをロードし、ブロモフェノールが飛んだばかりのゲルから出るまで、プレランと同じ電圧でゲルを泳が

所望の製品は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動が完了するとキシレンシアンの近くに移動します。ゲルをランニングバッファーとサイバーゴールドの1つを入れた清潔なトレイに置き、15分間揺らします。染色皿からゲルを取り出し、清潔なラップで覆われたUVトランスルミネーターボックスで視覚化します。

ライゲーション生成物の長さは約45ヌクレオチドである必要があります。このライゲーション産物は通常目に見えないため、ライゲーション産物を含む領域であるクリーンなカミソリの刃のexciを使用して、隣接するレーンにポジティブコントロールの合成RNAサンプルを含めることが重要です。合成RNAサンプルの位置とサイズ標準によって導かれます。

物品排出ゲルフラグメントを0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。0.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機のチューブの底を30ゲージの針で突き刺し、ピアスチューブを2番目のきれいな低保持力の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブ遠心分離機に約15,000回で5分間配置します。G.ゲルスライス全体がインナーチューブの穴を通って移動したことを視覚的に確認します。

必要に応じて、清潔なピペットチップを使用して、一部のゲルフラグメントを穴に近づけます。空の0.5ミリリットルチューブを廃棄し、アクリルアミドスラリーに400マイクロリットルの高塩カラムバッファーを追加します。翌日、一晩中4°Cでチューブを揺らします。

スラリーを広口径ピペットチップ遠心分離機を使用して0.22ミクロンの酢酸セルローススピンカラムに室温で約15,000回3分間移します。Gはアクリルアミドゲルマトリックスからすべての液体を収集します。液体を、20ミリグラム/ミリリットルのグリコーゲン溶液を1マイクロリットル含む清潔で低保持の1.5ミリリットルのチューブに移します。

等量のイソプロパノールと10分の1容量の酢酸ナトリウムを加え、チューブを数回反転させて溶液を混合します。マイナス80°Cの冷凍庫で20分間沈殿させます。摂氏4度で全速力で20分間遠心分離します。

核酸をペレット化するには、スナットを取り外し、70%エタノール空気で洗浄します。ペレットを室温で10分間乾燥させ、直接ファイブプライムライゲーションステップに進みます。この手順を開始するには、前にペレット化した核酸に、2マイクロリットルのPEG 8,000 0.5マイクロリットルのRNAリガーゼ緩衝液、0.5マイクロリットルのTPの0.5マイクロリットル、リンカー、RNAオリゴヌクレオチド、および水を加えて、最終容量4マイクロリットルにします。

このサンプルを最大5分間ピペッティングで上下に繰り返して混合し、ペレットが完全に再可溶化されていることを確認します。ペレットが溶液に入ったら、ピペッティングで上下させて、RNA阻害剤とT4 RNAリガーゼを1対1で混合した1マイクロリットルのきれいなPCRチューブに内容物を移します。反応液をサーマルサイクラーで摂氏37度で4時間インキュベートします。

反応が完了したら、RNAの3つの主要末端へのリンカーライゲーションと反応のページ解析に続くプロトコルテキストに記載されているように、すぐにCD NA合成に進みます。ゲルの100〜300ヌクレオチド領域には鋭い高分子量バンドが見られ、これは使用されている全RNAサンプルが高品質であることを示しています。ゲルの25ヌクレオチド領域における非常に明るいシグナルは、過剰な非ライゲーションされた3プライムリンカー合成RNAであり、5ピコモルの合成マイクロRNAと3プライムリンカーを用いて行われたライゲーションを示し、これをゲル精製した。

ここに示されているのは、P 32 5プライムおよび標識合成マイクロRNAを用いて行われた3つのプライムライゲーション反応のオートラジオグラムです。反応が進行した時間数は上部に示されており、下部の数字は、非結紮と結紮の合計に対する割合として結紮された量を示しています。このオートラジオグラムは、P 32 5プライム末端標識合成マイクロRNA3プライムリンカーハイブリッドを用いて行われた5つのプライムライゲーション反応です。

下部の数字は、非結紮と結紮の合計の割合として結紮された量を示し、高濃度のPEG 8、000小さなR-N-A-D-N-Aを使用することの重要性を明らかにしています。ハイスループットシーケンシングに適合するライブラリは、その後PCRによって生成されます。適切なPCRサイクル数は経験的に決定されます。

この例では、予想されるDNA産物のサイズは146塩基対であり、一度習得すると、この手法はわずか2日で適切に実行できます。この手法を実行する際には、すべてのチップとチューブにRNAが含まれないように注意することが重要です。