Name: ステンレス高品質レーザーからの RNA の隔離のプロトコルをキャプチャ人間死後小脳 Microdissected プルキンエ細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶレーザー捕捉顕微鏡を用いた染色なし可視化法による人死後小脳プルキンエ細胞の分離と高品質RNA抽出プロトコル。RNAシーケンス解析に適したサンプル調製法を確立し、神経生物学研究に貢献します。

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著者は切削しこれらの実験用冷凍人間の脳組織サンプルの博士ジャン ・ ポール Vonsattel と博士エッティ コルテス、ニューヨーク脳バンクを認めると思います。著者は、本態性振戦に継続的な研究のための彼らの脳を気前よく寄付した個人を認めたいと思います。ファウスト博士と博士 Martuscello の継続的な支援とコア研究領域コロンビア大学病理・細胞生物学を認識したいと思います。著者は NIH R01 NS088257 ルイ/ファウストを認識したい) 研究は、このプロジェクトの資金調達のため。LCM 画像を共焦点で行ったし、コロンビア大学、NIH 支えのハーバート ・ アーヴィング総合がんセンターの専門顕微鏡共有リソースを付与 #P30 CA013696 (国立癌研究所)。著者らは、特殊な顕微鏡を用いた彼らの継続的な支援のテレサ Swayne とローラ Munteanu を認めるみたいと思います。

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで提示されたプロトコルは特に UV LCM の形態的に異なる組織の可視化にステンレスのアプローチに変更されます。このメソッドは、組織の可視化の強化されたレベルを維持しながら、その後直接 RNA 配列の RNA の整合性を最大化するために設計されています。ヒト組織の15の異なる分子プロファイルを理解するためのキャプチャ、可能であれば、セルの純粋な人口を作成する異なったセルタイプを区別する能力が欠かせません。このプロトコルのコンテキスト内で組織の選択が最優先、抗原の使用としてまたは染料特定試薬は使用されません、したがってこのような分化を必要とする研究に適したはありません。これは、このプロトコルの制限は、結果組織の可視化と RNA 整合性はかなり優れているし、他の実験的デザインの関連性を維持します。また利用する代替染色法具体的の UV ・ IR-LCM 維持する RNA を意図して他の多くのプロトコルが存在します。しかし、他のほとんどのメソッドの少なくとも 1 つ汚すか、または抗原特定試薬6,<sup class="xre...

レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) は、その後分子駆動評価の病理組織学的に関連する細胞の分離を可能にする貴重な研究ツールです。これら異種組織標本の病理組織学的および臨床的データとの相関分子生物学的解析の使用は、生物学的研究1の並進運動の意義を評価する際に必要なステップです。RNA による遺伝子発現データを解析するとき凍結するティッシュ セクションの使用それは RNA の優れた品質のことができますようお勧めと同様数量2を最大化します。それが RNA シーケンス3から意味のあるデータに不可欠な高品質・ RNA 量も確立されています。ただし、最小公倍数の新鮮な冷凍事後組織からの RNA を使用している場合 RNA の劣化は大きな課題が、それが死亡時にすぐに発生してその程度は組織コレクション メソッド4,5 に関連するさまざまな要因によって仲介されます。.さらに、RNA の劣化が悪化する染色技術組織の詳細や細胞の識別を認識する必要がある場合。染色技術、ヘマトキシリン ・ エオシン、ニッスル染色などで専門的な蛍光抗体法および免疫組織化学周囲の間質から細胞の鑑別に有用が RNA を低下し、転写産物発現の変更が示されています。プロファイル6。したがって、当研究室では、死後人間の小脳のプルキンエ細胞の LCM 分離後の RNA シーケンスのため RNA を維持するために特別に設計されたステンレス プロトコルを作成しています。
LCM の新鮮凍結するティッシュを処理固定方法は必ず RNA と組織の両方の整合性を影響することができます。ホルマリン固定は形態学的保全のための標準が、架橋する原因かもしれない RNA のフラグメントし RNA 増幅7を妨げます。架橋1を誘発しない凝固定着剤として、エタノールの固定は RNA の隔離のためのより良い代替手段です。組織形態の可視化を高めるためには、キシレンは、最良の選択では、それは組織からの脂質を削除します。しかし、組織が乾燥し、レーザー キャプチャ7脆性の原因となる組織断片化になる、lcm、キシレンを利用する場合、制限知られています。キシレンはまた、揮発性の毒素と発煙のフードで正しく処理する必要があります。それにもかかわらず、キシレンは8RNA の整合性を維持しながら組織の可視化を高めるために示されています。したがって、我々 のプロトコルは 70% のエタノールの固定のエタノール脱水、キシレン潜伏形態の明快さのために続いて使用中心します。
彼らは、速度、精度、および RNA の品質が異なるに示されている異なったタイプのレーザー ベース レーザーマイクロダイ セクション システムに注意してくださいすることが重要です。赤外線 (IR) レーザーはレーザーマイクロダイ セクションと紫外線 (UV) レーザー マイクロビーム レーザーマイクロダイ セクション システムをキャプチャし、ほぼ同時に登場した8小説 LCM プラットフォームは両方でした。IR LCM システムは組織切片上に直接配置透明熱可塑性フィルムを使用して「コンタクト システム」を採用しています、興味のセル選択してフィルムに付着、集光によって IR レーザーから。また、UV LCM システムは「非接触システム」という集光レーザビームを切り取った細胞や組織興味の地域倒立か正立顕微鏡デザインのいずれかを使用して、2 つの現在利用可能な商用プラットフォームの構成に応じて組織が重力に逆らってカタパルト レーザー誘起圧力波による回収装置に取得または組織がそれぞれ、重力によって収集されます。UV LCM システムの重要な利点には、高速細胞捕捉、非接触アプローチと多く小さいレーザー ビーム直径9によるより正確な解剖汚染無料コレクションが含まれます。このプロトコルは、UV LCM システム用に設計されました、IR LCM システムでテストされていません。いずれかの UV LCM システム設計におけるコレクション キャップに蓄積細胞、観察の使用を高めるとき顕微鏡で細胞の明快さは適していません、セルはコレクション キャップに入ることになります。したがって、組織の可視化を高めるためには、我々 は液体充填コレクション キャップに対して UV LCM システムで可視の観察として設計されている不透明なコレクション キャップの使用をテストしました。液体蒸発され、顕微鏡で働いている間頻繁に交換する必要があります、液体充填コレクション キャップに挑戦することができます。時間には、キャプチャされた組織はすぐに7を溶解する RNA の安定性の重要な要因がようになります。
当研究室は、(ET) 本態性振戦患者の小脳・小脳の関連神経変性疾患の死後神経病理学的変化を研究します。我々 は仮定する私たちをリード ET ケースとプルキンエ細胞の数の減少などのコントロールを区別プルキンエ細胞を中心とした形態学的変化増加樹状回帰とさまざまな軸索の変化を示しているそのプルキンエ細胞の変性は、ET 病態10、11,12,13コアの生物学的機能です。転写プロファイルは細胞退行性変化の基になる分子基盤を探索する多くの神経疾患で使用されています。ただし、脳組織などの異種のサンプルから転写プロファイル効果的低豊富な転写産物の発現をマスクしたり、分子の変更の影響を受ける小集団でのみ発生するの検出を減少させる小脳皮質のプルキンエ細胞などの細胞。例えば、プルキンエ細胞が大幅に劣勢小脳皮質で豊富な顆粒細胞で約 1:3000;したがって、効果的にターゲットへのトランスクリプトームこれらのニューロンの特定の分離が必要です。小脳皮質は、細胞密度とセルのサイズが異なる別個の層で区切られます。この細胞アーキテクチャは、染色試薬の色素添加せず新鮮凍結組織サンプルの可視化に最適です。このプロトコルは、理論的には、同様の特徴的な組織を持つ他の組織型にも適用できる組織。
このプロトコルは、仕事人間死後の小脳プルキンエ細胞の可視化のために特別に設計されました。固定は、赤外線と紫外線の両方 - LCM の目的のための可視化と組織の多くの種類の RNA 保全を染色のため多数のプロトコルが存在します。UV LCM の実験的デザインを考えて、個人はニーズと開始と終了の材料の要件に合わせてプロトコルを調整すべき。ここでは、我々 はトランスクリプトームの高品質 RNA を準備する染色試薬を含む色素を必要とせず死後人間の小脳プルキンエ細胞を可視化するための拡張メソッドを提供するために別の LCM のプロトコルの多くの側面を組み合わせるシーケンス。

<table><tbody><tr><td>MembraneSlide NF 1.0 PEN</td><td>Zeiss</td><td>415190-9081-000</td><td>組織用メンブレンスライド。スライドガラスの使用はお勧めしません。&nbsp;</td></tr><tr><td>AdhesiveCap 500 Opaque</td><td>Zeiss</td><td>415190-9201-000</td><td>不透明なキャップは、倒立スコープの視覚化を強化するために使用されます</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td>他のRNase除染製品も適しています。作業前にすべての表面を清掃するために使用します。&nbsp;</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>代替エタノールを使用する場合は、高品質を確保してください。組織固定に必須です。&nbsp;</td></tr><tr><td>キシレン(認定ACS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>X5P-1GAL</td><td>代替キシレンを使用する場合は、高品質を確保してください。組織の可視化に必須です。&nbsp;</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>その他のRNA/DNA/ヌクレアーゼフリーウォーターも適しています。エタノール希釈でのみ使用されます。&nbsp;</td></tr><tr><td>スライドフィックススライドジャー</td><td>エバーグリーン</td><td>240-5440-G8K</td><td>どんなスライドホルダー/ジャーも適しています。使用前に清掃する必要があります。セクショニング後の固定に使用されます。&nbsp;</td></tr><tr><td>アンチロールプレート、Assy. 70 mm 100 &mu;m</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>14041933980</td><td>アンチロールプレートの種類は、クライオスタットの種類とステージ上の取り付け位置によって決まります。すべてのクライオスタットには異なる要件があります。&nbsp;</td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート (DEPC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758-50mL</td><td>DEPC は、どのベンダーからでもかまいません。水処理の指示に従ってください。&nbsp;</td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-666A</td><td>キムワイプは、どのベンダーからでも注文でき、どのサイズでも使用できます。キムワイプは、顕微鏡やクライオスタットの洗浄に使用します。&nbsp;</td></tr><tr><td>ティッシュプラス O.C.T. コンパウンド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-730-571</td><td>OCTのどのブランドでも構いません。OCTには組織が埋め込まれません。「チャック」に組織を取り付ける</td></tr>のは簡単だ。<tr><td>Edge-Rite Low-Profile Microtome Blade Thermo</td><td>Scientific</td><td>4280L</td><td>ブレードの種類は、クライオスタットの種類によって決定されます。すべてのクライオスタットには異なる要件があります。&nbsp;</td></tr><tr><td>ライカマイクロシステムズ 3P&nbsp;25 + 30MM クライオスタットチャック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC0558768</td><td>チャックのタイプは、クライオスタットのタイプによって決まります。すべてのクライオスタットには異なる要件があります。どちらのサイズも適切です。&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy マイクロキット (50)</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>LCM後のRNA抽出に必要です。不透明なキャップから捕捉された細胞を収集するために不可欠なRLT溶解バッファー。</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74104</td> 切<td>片調製のRNA抽出に必要で、LCMの前に開始組織のRNA完全性を試験するために実施されます。&nbsp;</td></tr><tr><td>RNaseフリーDNaseセット</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>DNaseは、純粋なRNA集団を可能にするために任意のDNAを除去します。Dnaseが新鮮であることを確認してください。&nbsp;</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td>購入量はユーザーの判断で。細胞溶解のためのRLTバッファーへの添加に必要です。RNase活性を防ぎます。&nbsp;</td></tr><tr><td>グローブ・サイエンティフィック&nbsp;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-010-092</td><td>RNaseフリー、DNaseフリー、ヒトDNAフリー、パイロジェンフリーの2 mLチューブなら何でもOK&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ステンレス高品質レーザーからの rna の隔離のプロトコルをキャプチャ人間死後小脳 microdissected プルキンエ細胞

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) は、細胞診および/または表現型に関連する細胞または異種組織からの領域のコレクションでは、有利なツールです。さまざまな蛋白質のための分子方法でキャプチャされた製品を使用できます DNA または RNA の分離。しかし、死後の人間の脳組織からの RNA の保全は特に挑戦的です。LCM の標準的な可視化技術、組織学的またはさらに免疫組織化学的染色手順 RNA を低下します。したがって、LCM の死後ひと脳組織の RNA の整合性を維持する目的で可視化のためステンレスのプロトコルを設計しました。小脳のプルキンエ細胞は、ステンレスの可視化, その大きさと特徴的な場所のための良い候補です。小脳皮質には、細胞密度、高倍率顕微鏡を識別する良い原型を作るそれらの異なる個別の層があります。プルキンエ細胞は大型ニューロンの小型ニューロンの特性の密度の高い携帯電話ネットワークは、顆粒細胞の層と細胞体の中に疎である分子の層の間に位置しています。このアーキテクチャのためステンレスの可視化の使用は可能です。この表現型を模倣する他の臓器や細胞システムは、適当でしょう。ステンレスのプロトコルはエタノールで新鮮凍結組織を固定し、高倍率光学顕微鏡形態学的可視化改善のためキシレンと脂質を除去する設計されています。このプロトコルは、他の固定方法については考慮しませんし、uv (紫外線) を使用してキャプチャした新鮮凍結組織サンプルは専用-LCM システム。ここでは、断面および後続の RNA 配列の RNA の品質を維持しながら UV LCM のプルキンエ細胞から新鮮な冷凍死後ひと小脳組織との RNA の浄化を修正する完全なプロトコルを提案する.私たちの手でこのプロトコルは染色試薬を必要とせず細胞可視化の例外的なレベルを生成し、転写プロファイリング実験に必要な高い RNA 整合性数字 (≥8) で RNA が得られます。

このプロトコルは、UV LCM の新鮮な冷凍死後人間の脳組織を準備するための手順を説明します。徹底した仕様と注釈は、精度の高い、新鮮な冷凍脳組織をカットすることは困難することができますクライオスタット切断するため与えられています。考慮すべき最も重要な点は新鮮凍結するティッシュが非常に寒いし、かなりのクライオスタットの暖かい温度に順応するまで時間が必要です。この手順を急がせることができない、どのようにセントラルこの手順は、このプロトコルの成否で誇張できません。組織は、クリオスタットでは適切に準備されませんが、細胞または関心領域を識別するのすべてのそれに続く試みは不可能ではない場合、非常に困難になります。
クライオスタット切片と割り当てられた乾燥時間、組織が LCM の準備ができて。顕微鏡下で組織を視覚化するとき小脳の細胞の層は 5 倍と 10 倍の対物レンズで簡単に表示されます。キシレン (図 1</strong...

このプロトコルは、視覚化し、キャプチャ レーザーマイクロダイ死後人間小脳から新鮮凍結組織におけるプルキンエ細胞を分離する染色無料のアプローチを使用します。このプロトコルの目的は、RNA 配列のため質の高い RNA の十分な量を生成することです。

ステンレス高品質レーザーからの RNA の隔離のプロトコルをキャプチャ人間死後小脳 Microdissected プルキンエ細胞

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

このプロトコルは、RNAの完全性を維持するのに役立つ死後の人間の脳組織に対する色素ベースの視覚化の代わりに染色を含まない視覚化方法を利用するため、重要です。RNAの保存は、このプロトコルでは、死後の人間の脳組織だけでなく、RNase活性が高い他の組織タイプにも有用であるため、大きな利点です。まず、冷凍庫から組織を取り出し、ドライアイスの上に置いてクライオスタットに運びます。清潔なブラシ、チャック、組織をクライオスタットに少なくとも20分間入れ、最適な温度に達するようにします。二重チャンバーと標本保持温度を持つクライオスタットの場合は、物体温度をマイナス16°C、チャンバー温度をマイナス18°Cに設定します。クライオスタットの断面の厚さを14マイクロメートル、トリム厚さを30マイクロメートルに設定します。次に、RNase除染剤と70%エタノールの1対1の混合物でステージを洗浄し、凍結を防ぎます。新しい使い捨て可能なクライオスタットブレードを入手し、RNase除染機で清掃してください。クリーニングしたブレードをステージ上のブレードホルダーに置きます。次に、RNase除染器でアンチロールプレートを洗浄します。洗浄したプレートをステージに取り付け、ブレードとアンチロールプレートがクライオスタットの温度になるまで少なくとも20分待ちます。まず、切片のために小さな組織を切断し、セクションが約95%小脳皮質であることを確認します。残りの組織をドライアイスに戻すか、氷を氷上にマイナス80度で戻します。次に、ゆっくりと円の動きでチャックの上にOCTをゆっくりと追加し始めます。チャックを覆う高さ約3ミリメートルのマウントがあるまでOTCの層を構築します。OCT が部分的に凍結しているのに、中央に液体が残っている場合は、ティッシュをマウントの上に置きます。組織が完全に凍結するまで1〜2分間OCTの上に座らせます。その後、凍結したOCTと組織を用いてチャックをクライオスタット切断アームに移します。切断ブレードでフラッシュされるように組織を調整し、組織を切断アームに20分間座らせて新しい温度に調整します。最も重要なステップは、必要な限り、組織がクライオスタット切断アームに順応できるようにすることです。組織が細断された場合、プルキンエ細胞の可視化は非常に困難になります。私は、組織がより速く順応できるように、より小さく、より薄い組織片を使用することをお勧めします。この後、ゆっくりと組織をブレードに近づけます。組織がブレードに到達したら、トリミングプロセスを開始します。皮質層が見えるまで、組織を2〜3回トリミングします。次に、反ロールプレートをクライオスタットブレードのすぐ上に配置し、位置合わせします。厚さ14マイクロメートルの4~6個のセクションをカットし、適切に切断されたセクションがアンチロールプレートの下で平らになることに注意してください。カットセクションをクライオスタットステージを横に水平に配置します。スライドを角度にして、すべての組織片を同時に拾います。組織を切り離した直後に、スライドをスライドホルダーに70%エタノールを氷の上に2分間置きます。氷上に95%エタノールを入れ、スライドを45秒間スライドホルダーに移します。次に、スライドをスライドホルダに100%エタノールを室温で2分間置きます。スライドを室温でキシレンナンバーワンを含むスライドホルダーに3回浸します。次に、スライドをスライドホルダに、室温で2本のキシレンを室温に5分間置きます。滑り台をきれいな煙のフードに置き、少なくとも30分間空気乾燥させます。スライドを保管する場合は、それぞれを別の50ミリリットルチューブに入れ、チューブをマイナス80°Cの冷凍庫に最大7日間置きます。まず、RNase除染器を使用して、顕微鏡ステージとキャップコレクションアームを清掃します。手袋をはめた手で、スライドを顕微鏡の上に置き、コレクションアームに500マイクロリットルの不透明なキャップを置きます。低倍率で、不透明なキャップを小脳組織の上に揃え、キャップがアイピースに視覚化された領域全体を覆うようにします。小脳層を視覚化するために5倍から10倍の目標を使用してください。分子層と顆粒細胞層が交差する部分の上にカーソルを置きます。40倍の倍率に移動し、purkinje細胞を視覚化します。次に、キャプチャを開始します。マイクロディセクショの後にRNA採取を開始するには、キャップを上に向けて不透明キャップに50マイクロリットルの細胞ライシスバッファーを追加します。慎重にキャップの上にチューブを閉じ、テキストプロトコルで概説されているように、コレクションに進みます。このプロトコルでは、新鮮な、凍結された、事後分析、ヒトの脳組織は、UVレーザー捕捉マイクロ解剖のために調製される。割り当てられた描画時間におけるクライオスタットの断面化に続いて、小脳の細胞層は5回、10倍の対物レンズで容易に見える。ここで見られるように、適切なキシレンインキュベーションは、組織が暗くなり、エタノール単独よりも細胞層をより良く線引く原因となります。レーザー捕獲顕微鏡で切断するとき、40回の対物レンズは、周囲の組織ではなく、プルキンエ細胞のみを捕捉するために必要とされる。ここで見られるように、キシレンの適切なインキュベーションは、エタノール固定単独と比較して、高品質の形態学的に無傷の画像を生成する。不透明なキャップのカバースリップ能力は、他のプロトコルが液体充填キャップを利用している間にテストされ、これらのキャップは組織の視覚化を減少させ、得られた画像を顕微鏡下で粒状および虹色にすることができる。しかし、不透明なキャップを通して視覚化すると、滑らかな組織の外観が柔らかく、よりシャープになります。低電力で高出力での切除されたプルキンエ細胞の代表的な画像は、プルキンエ細胞体のみの正確な除去を示す。この後、その後のRNAシーケンシングのために高品質のRnaseが得られます。6つの代表的なサンプルがRNA抽出を受け、14マイクロリットルのRnaseフリー水で再懸濁され、6つのサンプルすべてが8以上のRNA完全性番号を持つ高品質のRNAを製造しました。覚えておくべきことは、組織の品質がすべてであるということです。切断とスライドの配置でさえ、このプロトコルを作るか、または壊すでしょう。この手順に従って、RNAまたはDNAを調査する方法を実行することができ、具体的にはRNAの遺伝子発現の調査を行いますが、遺伝子調節に関する他の質問も調査できます。この方法は、目的の細胞の同定のために抗原または色素特異的試薬を使用する必要がない特異的な線引き形態を有する任意の組織タイプに適用することができる。この技術が、エッセンシャル振戦の遺伝学や振戦表現型の他の疾患を理解するのに役立つことを願っています。このプロトコルで使用される最も危険な化学物質はキシレンです。それは、煙のフードで適切に処理され、適切に処分され、スライドは、オープンスペースで使用されるまで十分に乾燥させておくべきである。また、ヒトのサンプルを扱う際には、生物危険廃棄物の管理、安全性を活用する必要があります。

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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ステンレス高品質レーザーからの RNA の隔離のプロトコルをキャプチャ人間死後小脳 Microdissected プルキンエ細胞

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