レーザー捕捉マイクロ解離によるマウス脊髄運動ニューロン細胞体からの転写解析のためのRNAの生成

高品質の総RNAは、70%エタノールでAzure Bで脊髄部を染色した後、レーザー捕捉マイクロ解剖によってマウス脊髄運動ニューロンの細胞体から調製された。3,000~4,000個の運動ニューロンから十分なRNA(約40~60 ng)を回収し、RNA-seqおよびqRT-PCRによるダウンストリームRNA解析を可能にします。

この手順の全体的な目標は、隣接する細胞からのRNAによる汚染なしに、脊髄運動ニューロンから高品質のRNAを回収することです。これは、最初にコードを回収し、分割して凍結埋設培地に埋め込み、摂氏マイナス160度で凍結することによって達成されます。2番目のステップは、コードをマイナス20°Cのペンメンブレンスライドに凍結切片で切片

次に、スライドを70%エタノールで洗浄し、70%エタノールでAzure Bで染色します。最後のステップは、同定された運動ニューロン細胞体をギネチオシアン酸溶解バッファーにレーザーキャプチャマイクロ解剖することです。最終的に、組み合わせたライセートから全RNAを調製し、変異型動物と野生型動物のニューロンにおける一般的または特定のRNA転写の違いを明らかにするために試験を行います。

レーザーキャプチャマイクロダイセクションは、より多数のスカリアや他の細胞タイプによる汚染なしに、脊髄切片から運動ニューロン細胞体を回収することを可能にします。RNAを調製し、病気の動物と正常な動物のニューロン間の転写を比較する機会を提供します。この手順を開発する上で最も困難だったのは、レーザー捕獲前とレーザー捕捉中の両方で、高レベルのRNA完全性と抽出能力を維持しながら、脊髄切片の運動ニューロンを検出できる染色方法を見つけることでした。

Azure Bおよび70%エタノールの染色切片は、解剖された細胞体を直接ギネチオシアン酸溶解バッファーに収集することと組み合わせると、これらの基準を満たしていることがわかりました。すべての機器がRNA除染液で洗浄され、続いてRNAフリーの70%エタノールで安楽死および経心電灌流後に洗浄されていることを確認してください脊髄を慎重に分離します。RNAで10秒間コードをすすぎます。

残留血液を洗い流すための無料の水で、RNAフリーのスライドガラスに非常に優しく、しかし迅速に置きます。次に、清潔なカミソリの刃を使って脊髄を横方向に9〜10個に分割します。OCTを充填したクライオ型にピースを配置し、清潔な針を使用して垂直に位置合わせします。

液体窒素で予冷した2つのメチルブタンが入った浅いトレイに型を置きます。RNAの分解を避けるために、トレイを液体窒素浴に入れます。脊髄片を急速凍結します。

OCT埋め込みブロックは、セクショニングの前に最大6か月間、摂氏マイナス80度で保管してください。セクショニング位置の準備ができたら、OCTはブロックを冷却されたクライオスタットに埋め込みます。それぞれ9〜10個の脊髄断面を含む20ミクロンのスライスを作成します。

切片をRNAフリーペン膜上に置きます。2ミクロンのスライドは、切片が接着することを確認するために、最初は室温に保たれました。クライオスタット内のマイナス20°Cの表面で切片をすぐに再凍結します。

スライドは、清潔なラック範囲で使用するまで、摂氏マイナス80度に保ちます。RNAフリー70%エタノールで満たされた6本の50ミリリットルの円錐管。深さは、スライドが浸漬されているときにスライド上のすべてのセクションをカバーするのに十分である必要があります。

次に、1%Azure B ソリューションを同じラックに配置します。洗浄中または染色中に溶液を交換する時間を最小限に抑えるには、ラックの前に3つまたは4つのラボ用ワイプを置いて、余分な溶液をすばやく排出します。準備ができたら、マイナス80°Cの冷凍庫からスライドを取り出し、ドライアイスの上に置き、手袋をはめた手のひらにスライドを置いて解凍します。

スライドの水分と結露の大部分は、セクションに触れないように注意しながら、ラボワイプで拭き取ります。スライドを新鮮なシリカゲル乾燥剤に載せて、シャーレに30〜40秒間置き、完全に乾かします。乾いたら、スライドをRNAの最初のチューブ(遊離70%エタノール)に浸します。

スライドを30秒間浸した後、OCTを上下に45秒から1分間浸して洗い流します。次に、スライドを溶液から取り出し、ラボ用ワイプで余分な液体を排出します。スライドを70%エタノールの2番目のチューブに浸して、このプロセスを繰り返します。

OCTが脊髄部分の周囲に残っている場合は、3本目のチューブで洗浄を繰り返します。余分な液体を排出した後、スライドを70%RNAの1%Azure B溶液に浸し、エタノールを30〜45秒間遊離します。ラボのワイプで余分な Azure B を排出します。

この時点で、スライド全体が青色になります。スライドを70%エタノールの次のチューブに浸し、余分な色素を取り除き、特定の運動ニューロンの染色を見えるようにするために、3〜4回すばやく上下に沈めます。切片が非常に暗く染色されているように見える場合は、70%エタノールの新しいチューブで脱染色ステップを繰り返します。

染色が軽すぎると思われる場合は、スライドをAzure B溶液に戻し、さらに32回目を行い、デス染色を繰り返します。染色に問題がなければ、スライドを短時間風乾させてから、次のステップに進みます。DES染色と乾燥後、灰白質は水色になり、濃い青色に染色された運動ニューロンは見やすくなります。

顕微鏡の電源を入れた直後に解剖を開始します。チューブホルダーを降ろして、0.6mmマイクロフュージチューブのキャップを取り付けます。サンプル採取は、30マイクロリットルのギネとチオシアン酸溶解緩衝液をキャップに入れ、溶液を広げて表面を覆います。

ピペットチップを使用して、キャップを穴と対物レンズに合わせます。顕微鏡ソフトウェアが摩耗している状態で、レーザーキャプチャを開始するまでキャップを蓋付きの位置に保ってください。空気乾燥させたスライドを逆さまにして顕微鏡のステージに置き、膜側が下を向き、セクションが穴と揃うようにします。

スライドを所定の位置に配置した状態で、5 x 対物レンズで脊髄切片に焦点を合わせ、次に 20 x 対物レンズに移動して解剖します。まず、ライトペンでダミー領域に印を付け、レーザーが収集せずに切り取るようにします。これにより、メンブレンが弛緩し、複数の領域を連続してマーキングおよびカットすることが可能になります。

次に、腹側角領域の運動ニューロンに再び焦点を合わせて特定します。これらのニューロンは、その位置によって認識できます パルマルの形態、大きいサイズ、紺碧の染色 紺碧 B.ライトペンを使用して、描画ツールを選択し、運動ニューロンの端に沿って完全な輪郭をマークします。輪郭を運動ニューロンにできるだけ近づけて、他の細胞からの汚染を避けるようにしてください。

切断の準備ができたらソフトウェアが位置を記憶し、キャップを切断位置の下に持ってきて開始ボタンをクリックすると、レーザーによる運動ニューロンの解剖を開始するため、切断前に複数のセルをマークできます。1つのスライド上のすべてのセクションからすべての運動ニューロンを1つのマイクロフュージチューブのキャップに集めます。収集が完了したら、トレイをアンロードしてマイクロフージチューブをホルダーから取り出し、チューブを静かに外し、溶液をピペッティングして運動ニューロンとバッファーを完全に溶解します。

遠心分離機で溶液をチューブの本体に移動し、サンプルをすぐにドライアイスで凍結し、Azure B.The運動ニューロンで染色した後、摂氏マイナス80度で保存します。それらは抗CHATT抗体によって確認され、染色され、より小さな隣接する細胞から容易に分化します。この例では、運動ニューロン細胞体はライトペンで輪郭が描かれ、ソフトウェアによって番号が付けられています。

ここでは、細胞体をレーザーで切り取り、輪郭をオフにして収集チューブに落としています。レーザーによる損傷の程度が隣接領域に及んでいることは明らかです。LMDによって収集された約4, 000マウス運動ニューロン細胞体からのサンプルのRNA完全性の電気泳動分析の典型的な結果をここに示します。

顕著なリボソームRNAのピークに注目してください。スライド染色から運動ニューロン解剖までのこのプロセスは、RNAの分解を最小限に抑えるために、1枚のスライド上のすべての切片について30分以内に完了する必要があります。この手順を試みるときは、臍帯の最初の解剖と埋め込み、および運動ニューロンの染色とレーザーキャプチャの微小解剖の最終ステップの両方で、できるだけ早く作業することを覚えておくことが重要です。