Name: レーザー捕捉マイクロ解離によるマウス脊髄運動ニューロン細胞体からの転写解析のためのRNAの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 学ぶレーザー捕捉マイクロ解離によるマウス脊髄運動ニューロンからの高品質RNA抽出法。Azure B染色と凍結切片を用いて近隣細胞の汚染を防ぎ、RNA-seqやqRT-PCRに適したサンプルを調製する技術です。

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著者たちは、ジョージ・ファーとホーウィッチ・ラボのメンバーに有益な議論に感謝したいと考えています。 この作品はハワード・ヒューズ医学研究所によって支えられていました。

マウスの麻酔、安楽死、および心臓灌流に関してここに記載されている手順は、イェール大学の制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルの下で行われた。
1. RNaseフリーの機器およびソリューションの準備
<ol><li>RNaseはベンチの上、マイクロピペットおよび調査者を含むすべての実験室表面の共通の汚染物である。<ol>
<li>頻繁にまたは定期的にRNAE除染溶液で手袋を拭きます。</li>
		<li>ステンレス鋼解剖ツールとガラス製品は、>200°Cで1時間以上加熱することでRNaseを自由にすることができます。注:蒸気滅菌はRNaseを破壊しません。または、RNase除染溶液で拭き取り、次にRNaseフリーの70%エタノールと空気乾燥で拭きます。</li>
		<li>ベンチトップ、RNase除染液を用いた他のラボ表面およびマイクロピペレットを拭き取り、RNaseフリー70%エタノールで拭きます。RNAの回収および分析のために特定のラボベンチまたは作業領域を指定します。注: ピペットのシャフトを拭く前にチップ エジェクタを取り外し、可能であれば、チップ エジェクタを取り外します。</li>
		<li>メーカーがRNaseフリーであると認定したチューブ、マイクロ遠心チューブ、ピペット、マイクロピペットチップを使用してください。非常に低い結合の先端およびマイクロチューブの使用は推薦される。可能であれば、開けたばかりの箱や袋を使用し、一般的なラボの供給から分離してください。</li>
		<li>市販のソースからRNaseフリー溶液(Dulbeccoのカルシウム及びマグネシウムフリーPBS(PBS)、エタノール、RNaseフリー70%エタノール)を得る。実験ごとに新しく開いたボトルを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Azure B 色素のソースは、無傷の RNA の正常な回復に不可欠です。染色と収集に貴重なサンプルをコミットする前に、色素の各バッチをテストします。非実験動物から数千個のニューロンを収集し、RNAを調製し、以下に説明するRNAの完全性を決定して、8.5を超えるRIN番号を一貫して生成するものを見つけます。<ol>
<li>アズールB染料(1%、wt/vol)をRNaseフリー70%エタノールに溶解し、通常は0.3gの30mlエタノールを50ml遠心管に溶解します。RTで一晩、またはすべての粒子が溶解するまでロッカーによく混ぜます。この溶液の1つの管は、染色強度に影響を与えることなく、複数のスライドを染色するために使用することができる。</li>
		<li>予防措置として、生物学的複製ごとに異なる染色管を使用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クリオマールとO.C T.を使用して、それ以上の治療を行わずにコードセクションを埋め込みます。</li>
	<li>クライオスタットを-20~-24 °Cに保ちます。 切り離し後、十分な数が準備されるまで、スライドを-80°Cの冷凍庫に入れる。スライドが作成された後、できるだけ早くRNAの準備を開始します。長期保管の場合は、スライドではなく、セクションを外すか部分的に切り離したOCTブロックを80°Cに保ちます。</li>
	<li>その指示に従ってRNA調製キットの製造業者によって提供される解決を使用して解剖された運動ニューロンからのRNAの準備のためのグアニジンチオシアネートの緩衝液を作る。</li>
</ol>マウスからの脊髄切片の作製(図1A)
<ol><li>RNase除染溶液で焼いたり拭いたりして、解剖ツール、ガラススライド、カミソリブレード、解剖プラットフォームをすべて洗浄し、RNaseフリーの70%エタノールを洗浄します。2分間乾燥させます。ラボワイプで覆うことで、ほこりのないすべてを保ちます。</li>
	<li>麻酔、心臓灌流、安楽死を含む動物の取り扱い手順は、脊髄解剖の時点に動物を迅速に持ち込むことを目的として、地元の制度的動物のケアおよび使用委員会(IACUC)の要件に従って行われるべきである。<ol>
<li>腹腔内(ip)ケタミン(450mg/kg)の致死量の注射によってマウスを麻酔する。</li>
		<li>深いレベルの麻酔が達成され、つま先ピンチ応答の欠如によって確認されたら、マウス腹側を解剖プラットフォーム(発泡スチロールボードなど)に上に置き、胸腔を開いて心臓を露出させ、左心室(調査官の右にある)に注入セットの27G針蝶を挿入します。鋭利な鉗子で右心房をニックし、蠕動ポンプを使用して約2分間5〜7 ml /分の速度でPBSと浸透させる。この時点で、心房から流れる液体はほとんど血液を含まないべきである。</li>
		<li>灌流針を取り外し、マウスの首を切り落とし、解剖板でひっくり返します。皮膚を開いて脊柱を露出させ、小さいはさみと鉗子を使って椎骨を取り除き、鋭い鉗子で神経根を切断しながら脊髄を持ち上げる。速度と練習は、コードの除去に灌流の開始から移動に不可欠です。これは7分以下でいてはならない。</li>
		<li>残りの血液を洗い流すために、RNaseフリーの水でコードを10秒間洗い流します。湾曲した鉗子を持つRNaseフリーのガラススライドの上に脊髄を置きますが、すぐに。きれいなカミソリの刃を使って脊髄を横に9~10個に分けます。</li>
		<li>同じ鉗子を使用してO.C.T.で満たされたクリオマールにピースを入れ、きれいな針を使用して垂直に整列します。液体窒素であらかじめ冷却した2-メチルブタンを含む浅いトレイに金型を入れ、そのトレイを液体窒素浴に入れて、RNAの分解を避けるために脊髄片を速く凍結します。</li>
		<li>OCT組み込みブロックは-80 °Cで、断離前に最大6ヶ月間保管してください。コードの取り出しから凍結までのプロセスは、RNAの完全性を維持するために5分以内に行われるべきです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>O.C T.埋め込みブロックを-20°Cでクライオスタットで作製し、それぞれ9〜10個の脊髄切片を含む9-10の脊髄断面を含む、RNase-free PEN膜2 μmスライド上で、セクションがスライドに付着していることを確認するために最初は室温で保たれています。クライオスタット内の-20°C表面のセクションを直ちに再凍結します。スライドは使用するまで-80°Cに保ちます。</li>
</ol>3. 脊髄切片の染色(図1A)
<ol><li>クリーンラックに、50 mlの円錐チューブを6個配置します。25-30 mlのRNase-フリー70%エタノールですべてを充填し、スライドが浸漬されたときにスライド上のすべてのセクションを覆うのに深さが十分になるようにします。前述のとおり、1% の Azure B ソリューションを 30 ~35 ml にし、同じラックに保管して、洗浄または染色中にソリューションを変更する間の時間を最小限に抑えます。ラックの前に 3 つか 4 つのラボ ワイプを置いて、余分なソリューションを素早く排出します。</li>
	<li>80°Cの冷凍庫からドライアイスにスライドを取り出します。手袋をした手のひらの上に置いて1枚のスライドを解凍します。スライドの水分と結露の大部分をラボワイプで拭き取り、セクションに触れないように注意してください。ペトリ皿に新鮮なシリカゲル乾燥剤の上にスライドを30〜40秒間完全に乾燥させます。実験室の湿度が高い場合、真空デシケーターでの短い処理は、より迅速にスライドを乾燥させるために使用することができます。</li>
	<li>洗濯と染色。<ol>
<li>乾燥したスライドをRNaseフリー70%エタノールの第1チューブに浸します。スライドを30秒間浸し、スライドを洗ってOCTを上下に45~60秒間浸します。スライドを溶液から取り出し、ラボワイプで余分な液体を排出します。スライドを70%エタノールの第2チューブに浸漬して同じ工程を繰り返します。脊髄部の周りのOCTが完全になくなっている場合は、3番目のチューブで洗浄を繰り返します。</li>
		<li>余分な液体を排出した後、スライドを1%のAzure B溶液に70%RNaseフリーエタノールで30〜45秒間水没させます。ラボ ワイプで超過の Azure B を排出します。この時点で、スライド全体が青色になります。</li>
		<li>70%エタノールの次のチューブにスライドを沈め、3〜4倍の速さで上下に浸して過剰な染料を除去し、特定の運動ニューロン染色を目に見えるようにします。セクションが非常に暗く染色された場合は、70%エタノールの新鮮なチューブで脱染色ステップを繰り返します。染色が軽すぎると思われる場合は、スライドを Azure B ソリューションに 30 秒間戻して、削除を繰り返します。余分なエタノールを拭き取り、すべての液体がなくなるまでスライドを〜40秒間乾燥させます。灰色の物質は水色になり、運動ニューロンは深い青色に染まるのに対し、見やすくなります。すぐに解剖を開始します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. レーザーキャプチャマイクロディスセクション(LMD)(図1B)
<ol><li>顕微鏡をオンにし、チューブホルダーをアンロードして、サンプル採取用に0.6 mlマイクロフュージチューブのキャップを取り付けます。0.6 ml マイクロフュージチューブのキャップに 30 μl グアニジンチオシアネートライシスバッファーを入れます。ピペットチップを使用して溶液を広げ、キャップの表面を液体で覆います。このようにして、収集されたすべてのニューロンは解剖される水溶性溶液に溶解される。キャップを穴に合わせ、目的を顕微鏡ソフトウェアに合わせます。レーザーキャプチャを開始するまで、キャップを覆われた位置に保ちます。</li>
	<li>空気乾燥スライドをLMD顕微鏡のステージ上に逆さまに置き、PENスライドの膜が下向きになるようにします。セクションを持つ膜は、その下にコレクションチューブである穴に面する必要があります。</li>
	<li>スライドの準備を始める前に、レーザーを10分オンにしてください。5Xの目的を持つ脊髄部に焦点を当てます。解剖のための20Xの目的に移動します。<ol>
<li>ライトペンで「ダミー」領域をマークし、レーザーがそれを収集せずにそれを切り取ることを可能にします。これによりPEN膜が弛緩し、連続して複数の領域をマークして切断することが可能になります。</li>
		<li>腹側ホーン領域の運動ニューロンを再び焦点を合わせ、識別します。これらのニューロンは、その位置、ピラミッド型、その大きなサイズ、および Azure B による濃い青色染色によって認識されます (図 2)。</li>
		<li>ライトペンを使用して描画ツールを選択し、モーターニューロンの端に沿ってマークを付け、完全なアウトラインを作成します。運動ニューロン以外の細胞からの汚染を避けるために、輪郭をできるだけ運動ニューロンに近づけるようにしてください。(レーザーカットラインの幅を確認するために事前にいくつかのセクションをテストし、必要に応じてクリアランスを調整します。切削する前に複数のセルをマークします。ソフトウェアは位置を記憶します。</li>
		<li>キャップ位置をクリックして、キャップを切断位置の下に移動します。開始ボタンをクリックして、レーザーで運動ニューロンの解剖を開始します。1つのマイクロフュージチューブのキャップに1スライド上のすべてのセクションからすべての運動ニューロンを収集します。</li>
		<li>収集が完了したら、トレイをアンロードし、チューブをそっと取り外してホルダーからマイクロフュージチューブを取り出します。溶液を上下にピペット処理して、運動ニューロンをバッファに完全に溶解します。4°Cで2分間14,000 x gで遠心してチューブの本体に溶液を移動させます。 試料を乾氷で直ちに冷凍し、-80°Cで保存してください。 このプロセスは、スライド染色から運動ニューロンの収集まで、RNAの分解を最小限に抑えるために1つのスライドで30分以内に行う必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 運動ニューロンからのRNA調製
収集したニューロンをすべて1匹の動物から解凍し、それらを一緒にプールしてRNAを抽出します。サンプルは、その中の運動ニューロン (Azure B で染色) の数によっては淡い青色に見える場合があります。LMD組織に提供されるプロトコルに従って適切なキットを使用してRNAを抽出し、可能な限り最小体積で溶出する。1 μl を取ってサンプルの量と完全性を確認します。残りのRNAをドライアイスで速凍結し、-80°Cで保存します。
6. RNAの品質と量の決定
メーカーのプロトコルに従って、キャピラリー電気泳動マイクロ流体チップ上の1μlサンプルでRNA品質を決定します。8.5以上のRNAインテグリティ・ナンバー(RIN)を有するRNA製剤の合計は、RNA-seqおよびqRT-PCRに使用することができます。データ出力には、通常、サンプルの近似濃度も含まれます。

<ol><li>Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+proteomic+profiling+of+frozen+pancreatic+CD24%2B+adenocarcinoma+tissues+by+immuno-laser+capture+microdissection+and+nano-LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS.</a> J. Proteome. Res. , (2013).</li>
<li>Bandyopadhyay, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+profiling+of+spinal+cord+motor+neurons+from+a+presymptomatic+SOD1+ALS+mouse.%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse.</a> PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).</li>
<li>Shea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+in+situ+cytophotometric+estimation+of+absolute+amount+of+ribonucleic+acid+using+azure+B1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1.</a> J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol. Biol. 7, (2006).</li>
<li>Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+RNA+in+Pick%27s+and+Alzheimer%27s+diseases.+Comparison+of+disease-susceptible+and+disease-resistant+cortical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas.</a> Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).</li>
<li>Lobsiger, C. S., Boillée, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+from+different+SOD1+mutants+dysregulates+the+complement+system+and+the+neuronal+regenerative+response+in+ALS+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).</li>
<li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+the+cellular+pathways+involved+in+the+adaptation+to+and+progression+of+motor+neuron+injury+in+the+SOD1+G93A+mouse+model+of+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS.</a> J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).</li>
<li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protocol+for+laser+microdissection+of+human+pancreatic+islets+from+surgical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens.</a> J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).</li>
<li>Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+of+immunolabeled+astrocytes+allows+quantification+of+astrocytic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression.</a> J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+aggregation+despite+chaperone+associations+of+a+mutant+SOD1-YFP+in+transgenic+mice+that+develop+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

脊髄スライスのレーザーマイクロディシスセクションによって全RNAを産生するためのこのプロトコルの成功の最も重要な尺度はRIN値5である。高い真核生物からのRNAサンプルの場合、8.5を超える値は定期的に高品質のシーケンシングおよびqRT-PCRデータを得る。収量が低いが品質が高い場合は、準備を繰り返します。ただし、整合性が低い場合 (7.5-8 であっても) は、問題の原因を見つけて再試行することをおし、何かがうまくいかない多くのステップがありますが、実際には問題の2つの原因(内因性RNase汚染または外因性RNase汚染)しかありません。最初は、マウスの犠牲からO.C T埋め込みコードの凍結までの時間を最小限に抑えるように、練習によって対処することができます。内因性RNaseが悪い結果に寄与することができるプロトコルの他のポイントは、スライスの調製中です。各スライスは、室温のPENスライドに素早く付着する必要がありますが、溶けます(O.C.Tが明確になります)。スライスの再凍結が早いほど良い。私たちが使用するクライオスタットは、-20°Cにあるチャンバー内の平らな表面を持ち、スライスを素早く再凍結するために使用します。使用クライオスタットで同様のスポットを見つけ、スライスが再び急速に不透明になることを確認します。
外因性RNaseのソースを追跡することは、非常に多くの可能性があるので、困難な場合があります。RNaseフリーでない試薬はO.C.T.とAzure Bだけです。Azure B が以前に十分に実行されている場合は、O.C T.の新鮮なボトルを試してみてください。RNaseフリー試薬は、別のサプライヤーからも交換することができます。はるかに可能性の高い情報源は、調査官です.作業領域の完全なクリーンアップに加えて、別のラボ メンバーが従って、手順のすべての手順を観察することがしばしば役立ちます。これが日常的にこの手順を実行していない人であっても、目の新鮮なセットは、そうでなければ気付かれていない汚染源を拾う可能性があります。
このプロトコルを他の脊髄細胞からRNAを回収したり、他の種から脊髄細胞から、または他の器官の特定の細胞タイプからRNAを回収するためには、内因性RNaseの影響を排除しながら、または少なくとも最小限に抑えながら、目的の細胞の明確な同定を達成することに向けられたいくつかの領域での修正が必要です。ここでのプロトコルでは、コードの迅速な除去と凍結は、70%エタノールでのAzure B染色と相まって、RNA分解の最小化と運動ニューロン細胞体の容易な同定の両方を可能にした。Azure Bは、RNA3 に結合するように見えるニューロンの確立された組織化学的染色であり、神経変性疾患6の患者からの脳組織の検死サンプルにおけるニューロンのRNA含有量を評価するために使用されてきた。特に、Azure B 染色は、精製された RNA の完全性や、リバース転写および分析の能力に影響を及ぼさなかった。他の色素は、クレシルバイオレット7 およびトルイジンブルー8 のような類似のLMDプロトコルで使用されている。細胞体を解剖時に直接グアニジンチオシアネート溶液に集めることで、無傷のRNAの定期的な回復をもたらした最終ステップが得られた。
同様のアプローチは、他の細胞や臓器に対して構想することができ、関心のある細胞を最小限に抑えながら同定するか、好ましくは、内因性RNasesによるRNA分解を防ぐことが、分析を成功させるための重要な要件であることを認識することができる。膵臓などのRNaseのレベルが高い組織では、迅速な取り扱いと低温が組み合わされ、β細胞からのRNAの回収が可能になり、可視化9のために自然自家蛍光を利用している。同定のために抗体染色を用いた手順も10と報告されているが、我々の手では完全に成功していない。最後に、多くのマウスモデルが、LMD顕微鏡の組織切片で同定できる目的の細胞で蛍光融合タンパク質(GFP、YFP、RFPなど)を発現するモデルが数多く用意されています。実際、このプロトコルで分析したマウス株は、SOD1とYFP11の融合タンパク質を発現しており、脊髄運動ニューロンは蛍光性が高い。しかし、O.C T.を同時に除去し、RNase活性を阻害し、LMDによる運動ニューロンの視覚化とその回復を可能にする十分なYFP蛍光を一貫して維持するエタノールの一連の燃焼および/または脱水状態を見つけることができませんでした。おそらく、新しい蛍光タンパク質、または有機溶媒中の蛍光を維持する利用可能なものの変異体は、この限界を克服することを発見することができる。

複数の異なる細胞タイプで構成される哺乳類組織では、レーザー捕捉マイクロディション(LMD)計測器の出現により、RNAまたはタンパク質レベルで分析するために特定の細胞タイプを選択する可能性が生じています。現在、増幅および次世代シーケンシング技術は、数千個の細胞から総RNAのプールを使用して、RNAの相対的レベルの評価および様々なスプライシング形態の同定を含む、トランスクリプトームの比較的徹底的なインベントリを得ることを可能にする。現在までに、数千個の細胞のプロテオミクス分析は、より豊富な種を通してのみ到達します。例えば、我々は、3,000-4,000の運動ニューロン細胞体(図示せず)から最も豊富なタンパク質の<1,000を同定し、Zhuと同僚は最近、〜15,000個の腫瘍細胞から2,665個のタンパク質を同定したと報告している。しかし、質量分析のさらなる発展に伴い、このような分析ははるかに深さに及ぶ可能性が高い。
ここでは、マウスの脊髄から運動ニューロン細胞体のLMDに用いられる特定のプロトコルを提示し、続いてRNAを調製する。このプロトコルは、RNA-seqおよびqRT-PCR検証2の両方によって野生型SOD1トランスジェニック株から調製されたRNAを有する抗肥萎縮性側索硬化症(ALS)マウスを有する、前無症性トランスジェニック変異型ジスムターゼ(SOD)1マウスの運動ニューロンからのRNAを比較する文脈で使用された。特に、運動ニューロンは、脊髄の灰色物質の前角において、全細胞集団の<10%を含み、アストロサイトの海に囲まれており、したがって、それらの転写プロファイルはコード全体の研究から容易に減少することができない。レーザーキャプチャアプローチは、これらの細胞のRNA発現を分析するのに理想的であり、短い心臓内生理食糸灌流に続いてコードを迅速に切除して凍結することによって生理学が保存されます。運動ニューロンソマトンは大きく、したがって容易に検出可能であるが、ここではニューロン3に対して強い親和性を有する色素を用いる。加えて、このような大きさを有して、これらの細胞は、捕捉された細胞当たりの比較的大量のRNAを提供する。使用される手順は、以下に詳述するように、他の神経細胞タイプ、ならびに潜在的に他の細胞タイプを得るために容易に調整することができ、特に色素染色技術または抗体染色によって同定される。

<table><tbody><tr><td>ケタミン</td><td>ウェブスター獣医</td><td>26637041101</td><td>機関の獣医サービスによって承認された任意のソース</td></tr><tr><td>解剖ツール(はさみ、鉗子、&nbsp;etc.)</td><td></td><td></td><td>高品質の解剖器具の便利なソース</td></tr><tr><td>Cryostat&nbsp;</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>CM3050S</td><td>その他のクライオスタットはLMD6000に適している必要があります</td></tr><tr><td>B</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td><td>他のLMDシステムはテストされていません</td></tr><tr><td>RNaseフリーPEN膜 2 &mu;スライド&nbsp;</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>11505189</td><td>他のスライドタイプがテストされており、うまく機能しません</td></tr><tr><td>RNeasy マイクロキット (50)</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>グアニジンチオシアン酸溶解バッファーを使用し、少量のRNAを回収するためにテストされたキットは、</td></tr><tr><td>Agilent 2100 BioAnalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr><tr><td>Azure B Certified&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>190520</td>クリティカル<td>!任意のソースからの製品は、RNAの完全性PBS</td></tr><tr><td></td><td>シグマライフサイエンス</td><td>D8537</td><td>RNaseフリーPBS</td></tr><tr><td>RNAエタノール70%(DEPC処理水で作られる)</td><td>の</td><td>AB04010</td>任意の信頼性の高いソースは<td>、任意の信頼性の高いソース、実験室で作られることができます</td></tr><tr><td>水、RNaseフリー、エンドトキシンテスト(RNaseを排除するためにDEPCで処理</td>)<td>アメリカのバイオアナリティカル</td><td>AB02128-00500</td><td>任意の信頼できるソース、ラボで作ることができます</td></tr><tr><td>RNase AWAY</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10328-011</td><td>RNaseZAP(これもInvitrogen製)などの他の同様のRNase除去試薬は、</td></tr><tr><td>2-メチルブタン&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>78-78-4</td><td>任意のソース</td></tr><tr><td>Maxymum Recovery マイクロフュージチューブ (0.6 および 1.5 ml) とピペットチップ&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>311-03-051 & 311-09-051</td><td>超低保持、RNase フリーのチューブとチップ;</td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold Intermediate Size</td><td>Tissue-Tek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Lab wipes (Kimwipes)</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr></tbody></table>

レーザー捕捉マイクロ解離によるマウス脊髄運動ニューロン細胞体からの転写解析のためのrnaの生成

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

目的の細胞から高品質のRNAを調製することは、細胞タイプ間の転写の違い、または健康と疾患の同じ細胞タイプ間の正確かつ有意義な分析、または薬理学的治療に続く重要です。脊髄において、運動ニューロンからのこのような調製は、多くの神経学的および神経変性疾患における関心の対象であり、運動ニューロンが全細胞集団の<10%を表すという事実によって複雑である。この問題に対処するために、レーザーキャプチャマイクロディション(LMD)が開発されました。ここでは、内因性および外因性RNasesによるRNA損傷を避けるためにマウス脊髄を迅速に回復、凍結、切除するプロトコルを説明し、続いてAzure Bを70%エタノールで染色して、内因性RNaseを阻害したまま運動ニューロンを同定するプロトコルについて説明する。LMDは、染色されたニューロンをグアニジンチオシアネートライシスバッファーに直接捕捉し、RNAの完全性を維持するために使用されます。標準的な技術は、RNA全体を回収し、その完全性を測定するために使用されます。この材料は、RNA-seqおよびqRT-PCRによる転写物の下流分析に使用することができます。

上記および 図1 で概説したプロトコルは、約20枚のPENスライド上の9-10 20 μmのスライスから解剖された3,000-4,000の脊髄運動ニューロン細胞体から>8.5のRINを有する50ng以上のRNAを生成するべきである。このスライド数はマウス脊髄のO.C T.埋め込みブロックの10%未満を表すため、-80°Cで保存されているブロックに戻り、より多くのスライスをカットしてRNA製剤の別のラウンドを通過することができます。解析に大量のRNAが必要な場合は、解剖とRNA調製を通じて数日間で処理できるスライドの数(例えば20枚)のみを数日で作り、2回目のラウンドのためにより多くのスライドを作り、製品を組み合わせる方が良いでしょう。良いものと悪いものを組み合わせることを避けるために、最初に各準備のRINをチェックしてください。RNA-seq法は感度が高まり、新しいPCR技術は現在のPCR技術よりも高感度を見込んでいます。したがって、より少ないニューロン細胞体からのRNAが少なくなり、より大きなシーケンシング深さと興味深いヒットのより包括的な検証が可能になります。一方、qRT-PCR分析および検証4 のためのMIQE勧告への完全な遵守は、低存在量のRNAに必要な制御反応を可能にするために、より多くの量を必要とするかもしれません。
図 2 は、Azure B 染色と解剖後の脊髄側腹孔ホーンセクションの一部の一般的な一連の画像を示しています。パネルAでは、大きく、暗く染色された細胞体は運動ニューロンであり、抗チャット抗体染色2によって確認され、より小さい隣接細胞から容易に分化される。パネルBは、個々の細胞体がライトペンで輪郭を描き、顕微鏡ソフトウェアによって番号付けされた同じ領域を示す。輪郭は、レーザーの切断幅に対する小さな許容量で、細胞体の余白に密接に従います。この間隔は、運動ニューロンサイトゾルの損失を避けながら、余分な材料の包含を最小限に抑えるために、各レーザーパワー設定について決定する必要があります。パネルCとDは、レーザーが切断され、個々の細胞体がコレクションキャップに落ちた後のセクションを示しています。カットマージンは、パネル C のライトペンのアウトラインに正確には従わないが、その外側に大きく残っていることに注意してください。この不規則性は、各カットの周りの暗い領域と同様に、レーザーによって引き起こされる組織への熱損傷を反映するパネルDで明らかである。このため、2つの細胞体が互いに非常に近い場合は、それらを別々に切断しようとし、ほぼ接触の領域で熱損傷を得るためにいくつかのRNAを失うよりも、単一のカットのためにそれらを概説することをおいせください。
図3 は、LMDによって収集された約4,000個のマウス運動ニューロン細胞体から調製されたRNAのサンプルのRNA完全性の電気泳動分析の典型的な結果を示す。上部パネルは、全RNAの1 μlによって生成されるエレクトロフェログラムです。右側のインセットはゲルの画像です。両方とも、顕著なリボソームRNAピークに注意してください。下パネルは、RNAサイズ規格を含むレーンのエレクトロフェログラムです。この分析ソフトウェアは、このサンプルのRINを4.9 ng/μlの濃度で計算しました。このソリューションの合計 13 μl は分析後に利用可能で、転写量の下流の qRT-PCR 検証に 64 ng の RNA を提供しました。適度に豊富な転写物の典型的なqRT-PCR分析では、全RNAの0.15〜0.20 ngは正確な定量2を生成するのに十分であり、この調製から得られたRNAの量は、推奨される4の複数のプライマーセットを有する多数の転写物を検証するのに十分である。もちろん、大量の入力RNAを使用して、希少な転写物の検証を可能にすることができます。この量はまた、ライブラリー調製および次世代RNA-seqを可能にするのに十分以上である。
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1.jpg"> 図 1. 脊髄の切片の生産およびレーザー捕獲の微細解剖の概観は、脊髄運動ニューロン細胞体の。)スライス生産と染色の主要なステップ。B)脊髄部とレーザー解剖の漫画図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2.jpg"> 図 2.Azure B 染色運動ニューロン細胞体のレーザー解剖の前後画像。A)染色されたセクションの腹側角の一部。4つの大きな、暗く染色された細胞に注意してください。また、軽く染色され、やや小さい細胞もあり、運動ニューロン(抗チャット抗体染色によって確認され、示されていないが、Bandyopadhyay2を参照)であり、解剖のために選択されない。多くの小さな暗い斑点は、おそらく神経細胞プロセス(樹状突起および軸索)であるが、これは確認されていない。B)ライトペンで囲んだ4つのセルボディ。アウトラインはセルの余白に近い範囲に沿って、セル間の距離が最小であることに注意してください。この間隔は、顕微鏡とレーザーごとに経験的に確立する必要があります。ソフトウェアは、収集された数を追跡することを簡素化する個々のニューロンを番号付けします。C と D)レーザーが切断され、細胞体を含む部分がコレクションキャップに落ちた後。残された穴は、アウトラインよりもやや大きく、不規則であることに注意してください。これは、レーザービームの幅と組織の局所的な組成に応じて、そのわずかに可変的な切断効率を反映しています。また、レーザーによる局所加熱損傷による各穴を囲む暗くなった組織の縁も明らかである。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3.jpg"> 図 3.LMDサンプルから調製したRNAの完全性の電気泳動分析。A)上記のプロトコルにより〜4,000個の運動ニューロン細胞体から調製したRNAの1μlアリコートを、マイクロ流体チップ上のマイクロキャピラリー電気泳動法で解析した。エレクトロフェログラムは、顕著なリボソームRNAピークを有する示されている。右側にはゲル自体の画像があります。B)サイズ規格の電解液を示し、対応するゲルレーンを右側に表示します。計測器ソフトウェアは、このサンプルのRINを9.8、濃度4.9 ng/μlを計算<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" target="_blank">しました。</a>

高品質の総RNAは、70%エタノールでAzure Bで脊髄部を染色した後、レーザー捕捉マイクロ解剖によってマウス脊髄運動ニューロンの細胞体から調製された。3,000~4,000個の運動ニューロンから十分なRNA(約40~60 ng)を回収し、RNA-seqおよびqRT-PCRによるダウンストリームRNA解析を可能にします。

レーザー捕捉マイクロ解離によるマウス脊髄運動ニューロン細胞体からの転写解析のためのRNAの生成

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

本手順の全体的な目的は、隣接する細胞からのRNA混入を避けつつ、脊髄運動ニューロンから高品質なRNAを回収することです。まず、脊髄を回収して分割し、凍結包埋剤で包埋して-160°Cで凍結させることでこれを達成します。次のステップでは、-20°Cで脊髄をペン膜スライドに凍結切片として作成します。次に、スライドを70% ethanolで洗浄し、70% ethanol中のAzure Bで染色します。最終ステップは、特定した運動ニューロンの細胞体を、グアニジンチオシアネート溶解緩衝液中へレーザーキャプチャーマイクロダイセクションで回収することです。最終的に、回収した溶解液を合わせて全RNAを調製し、野生型動物と変異型動物のニューロンにおける全般的または特異的なRNA転写の違いを解析します。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いることで、より数の多いグリア細胞やその他の細胞種による混入を避けながら、脊髄切片から運動ニューロンの細胞体を回収することが可能です。これにより、疾患動物と正常動物のニューロンからRNAを調製し、転写を比較することが可能になります。本手法の開発において最も困難であった点は、レーザーキャプチャーの前および最中の両方において、高いレベルのRNA完全性と抽出能を維持しつつ、脊髄切片内で運動ニューロンを検出できる染色法を見出すことでした。Azure Bおよび70% ethanolで切片を染色し、解剖した細胞体を直接グアニジンチオシアネート溶解バッファーに回収することで、これらの基準を満たすことがわかりました。この手順は、当研究室のポストドクであるVan Padiaによって最適化されました。最良の結果を得るために、安楽死および経心腔灌流後のすべての器具をRNA除染溶液で洗浄し、続いてRNAフリーの70% ethanolで洗浄してください。脊髄を慎重に分離します。脊髄をRNAフリーの溶液で10秒間すすぎます。残った血液を洗い流すために十分な量の水を用いて洗浄し、RNaseフリーのガラススライド上に、非常に慎重かつ迅速に配置します。次に、清潔なカミソリを用いて、脊髄を横方向に9〜10等分に切断します。これらの断片をOCTを満たしたクライオモールドに入れ、清潔な針を用いて垂直に整列させます。型を、液体窒素で予冷した2-メチルブタンを入れた浅いトレイに置きます。RNAの分解を防ぐため、トレイを液体窒素バスに入れます。これにより、脊髄片を急速冷凍します。OCT包埋ブロックは、切片作成まで-80°Cで最大6ヶ月間保存します。切片を作成する際は、OCT包埋ブロックを冷却したクライオスタットに設置してください。1枚につき9〜10個の脊髄横断面を含む20 µmの切片を作成します。RNA分画用フリーペン膜の上に切片を配置します。切片を確実に密着させるため、2ミクロンのスライドを最初は室温で保持します。その後、クライオスタット内部の-20 °Cの冷却面に切片を直ちに再凍結させます。スライドは、クリーンなラックに並べ、使用時まで-80°Cで保存してください。RNA-freeの70% ethanolを満たした50 mLコニカルチューブを6本用意します。液深は、スライドを浸した際にすべての切片が完全に浸かる十分な深さにする必要があります。次に、同じラックに1% Azure B溶液を配置します。洗浄または染色の際の溶液交換時間を最小限に抑えるため、ラックの前にラボワイプを3〜4枚置いておき、余分な溶液を素早く吸収できるようにします。準備ができたら、スライドを-80 °Cのフリーザーから取り出し、ドライアイスの上に置きます。手袋をした手のひらにスライドを乗せて、1枚ずつ解凍します。ラボワイプで拭き取り、切片に触れないように注意しながら、スライド上の水分と結露の大部分を取り除きます。スライドをペトリ皿に入れた新しいシリカゲル乾燥剤の上に30〜40秒間置き、完全に乾燥させます。乾燥後、スライドをRNaseフリー70%エタノールの最初のチューブに浸します。スライドを30秒間浸し、その後、45秒から1分間、上下に浸漬させてOCTを洗い流します。次に、スライドを溶液から取り出し、ラボワイプで余分な液体を拭き取ります。この工程を、2本目の70% ethanolが入ったチューブにスライドを浸して繰り返します。脊髄切片の周囲にOCTが残っている場合は、3本目のチューブで洗浄を繰り返します。余分な液体を切り出した後、スライドを70%エタノール（RNA分解酵素フリー）で希釈した1% Azure B溶液に30〜45秒間浸します。Azure Bの余分な液をラボワイプで拭き取ります。この時点で、スライド全体が青色になります。スライドを次の70% ethanolのチューブに浸し、3〜4回素早く上下に動かして過剰な染料を除去し、特定の運動ニューロンの染色を可視化させます。切片の染色が非常に濃い場合は、新しい70% ethanolのチューブで脱染色ステップを繰り返してください。染色が薄すぎる場合は、スライドを再びAzure B溶液に戻してさらに32秒間浸し、DES染色を繰り返します。染色が十分であれば、スライドを短時間自然乾燥させ、次のステップに進みます。DES染色と乾燥後、灰白質は淡い青色になり、濃い青色に染色された運動ニューロンが容易に観察できるようになります。顕微鏡の電源を入れた後、すぐに解剖を開始します。チューブホルダーから取り外し、0.6 mm マイクロ遠心チューブのキャップを取り付けます。サンプル回収のため、キャップに 30 µL のグアニジンチオシアネート溶解バッファーを入れ、溶液を広げて表面を覆います。ピペットチップを用いて、キャップを穴および対物レンズと合わせます。顕微鏡ソフトウェアを使用して、レーザーキャプチャを開始するまでキャップをカバー位置に保持します。空気乾燥させたスライドを、メンブレン側を下に向けて顕微鏡のステージ上に置き、切片が穴と一致するように配置します。スライドをセットし、5倍対物レンズで脊髄切片に焦点を合わせた後、切り出しのために20倍対物レンズに切り替えます。まず、ライトペンでダミー領域をマークし、回収せずにレーザーで切り出します。これにより膜が弛緩し、複数の領域を連続的にマークして切り出すことが可能になります。次に、再フォーカスして腹角領域の運動ニューロンを特定します。これらのニューロンは、その位置、形態、大きなサイズ、およびAzure Bによる濃い青色の染色によって識別可能です。ライトペンを使用して描画ツールを選択し、運動ニューロンの縁に沿って完全なアウトラインをマークします。他の細胞による混入を避けるため、アウトラインは運動ニューロンにできるだけ近づけて描画してください。ソフトウェアが切断準備完了時に位置を記憶するため、切断前に複数の細胞をマークすることができます。キャップを切断位置の下に移動させ、スタートボタンをクリックして、レーザーによる運動ニューロンの解離を開始します。すべての切片から回収したすべての運動ニューロンを、1本のマイクロ遠心チューブのキャップに集めます。回収が完了したら、トレイをアンロードしてホルダーからマイクロ遠心チューブを取り出し、溶液をピペッティングして運動ニューロンとバッファーを完全に溶解させます。遠心分離によって溶液をチューブの底に集め、Azure Bで染色後、サンプルを直ちにドライアイスで凍結し、-80°Cで保存します。運動ニューロンは、大きく濃く染色された細胞体として現れます。これらはanti-CHAT抗体染色によって確認され、周囲のより小さな細胞と容易に区別できます。この例では、運動ニューロンの細胞体がライトペンで囲まれ、ソフトウェアによって番号が付けられています。ここでは、レーザーを用いて細胞体が切り出され、アウトライン表示をオフにした状態で回収チューブに落とされています。隣接領域へのレーザー損傷の程度が明らかです。LMDによって回収された約4,000個のマウス運動ニューロン細胞体サンプルのRNA完全性を電気泳動分析した際のごく一般的な結果がここに示されています。顕著なリボソームRNAのピークに注目してください。RNAの分解を最小限に抑えるため、スライド染色から運動ニューロンの切り出しまでのこのプロセスは、1枚のスライド上のすべての切片に対して30分以内に完了させる必要があります。この手順を行う際は、最初の脊髄の切り出しと包埋、および最終段階の染色と運動ニューロンのレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにおいて、可能な限り迅速に作業することが重要です。

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