レーザー捕捉マイクロ解離によるマウス脊髄運動ニューロン細胞体からの転写解析のためのRNAの生成

本手順の全体的な目的は、隣接する細胞からのRNA混入を避けつつ、脊髄運動ニューロンから高品質なRNAを回収することです。まず、脊髄を回収して分割し、凍結包埋剤で包埋して-160°Cで凍結させることでこれを達成します。次のステップでは、-20°Cで脊髄をペン膜スライドに凍結切片として作成します。

次に、スライドを70% ethanolで洗浄し、70% ethanol中のAzure Bで染色します。最終ステップは、特定した運動ニューロンの細胞体を、グアニジンチオシアネート溶解緩衝液中へレーザーキャプチャーマイクロダイセクションで回収することです。最終的に、回収した溶解液を合わせて全RNAを調製し、野生型動物と変異型動物のニューロンにおける全般的または特異的なRNA転写の違いを解析します。

レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いることで、より数の多いグリア細胞やその他の細胞種による混入を避けながら、脊髄切片から運動ニューロンの細胞体を回収することが可能です。これにより、疾患動物と正常動物のニューロンからRNAを調製し、転写を比較することが可能になります。本手法の開発において最も困難であった点は、レーザーキャプチャーの前および最中の両方において、高いレベルのRNA完全性と抽出能を維持しつつ、脊髄切片内で運動ニューロンを検出できる染色法を見出すことでした。

Azure Bおよび70% ethanolで切片を染色し、解剖した細胞体を直接グアニジンチオシアネート溶解バッファーに回収することで、これらの基準を満たすことがわかりました。この手順は、当研究室のポストドクであるVan Padiaによって最適化されました。最良の結果を得るために、安楽死および経心腔灌流後のすべての器具をRNA除染溶液で洗浄し、続いてRNAフリーの70% ethanolで洗浄してください。脊髄を慎重に分離します。脊髄をRNAフリーの溶液で10秒間すすぎます。

残った血液を洗い流すために十分な量の水を用いて洗浄し、RNaseフリーのガラススライド上に、非常に慎重かつ迅速に配置します。次に、清潔なカミソリを用いて、脊髄を横方向に9〜10等分に切断します。これらの断片をOCTを満たしたクライオモールドに入れ、清潔な針を用いて垂直に整列させます。

型を、液体窒素で予冷した2-メチルブタンを入れた浅いトレイに置きます。RNAの分解を防ぐため、トレイを液体窒素バスに入れます。これにより、脊髄片を急速冷凍します。

OCT包埋ブロックは、切片作成まで-80°Cで最大6ヶ月間保存します。切片を作成する際は、OCT包埋ブロックを冷却したクライオスタットに設置してください。1枚につき9〜10個の脊髄横断面を含む20 µmの切片を作成します。

RNA分画用フリーペン膜の上に切片を配置します。切片を確実に密着させるため、2ミクロンのスライドを最初は室温で保持します。その後、クライオスタット内部の-20 °Cの冷却面に切片を直ちに再凍結させます。

スライドは、クリーンなラックに並べ、使用時まで-80°Cで保存してください。RNA-freeの70% ethanolを満たした50 mLコニカルチューブを6本用意します。液深は、スライドを浸した際にすべての切片が完全に浸かる十分な深さにする必要があります。

次に、同じラックに1% Azure B溶液を配置します。洗浄または染色の際の溶液交換時間を最小限に抑えるため、ラックの前にラボワイプを3〜4枚置いておき、余分な溶液を素早く吸収できるようにします。準備ができたら、スライドを-80 °Cのフリーザーから取り出し、ドライアイスの上に置きます。手袋をした手のひらにスライドを乗せて、1枚ずつ解凍します。

ラボワイプで拭き取り、切片に触れないように注意しながら、スライド上の水分と結露の大部分を取り除きます。スライドをペトリ皿に入れた新しいシリカゲル乾燥剤の上に30〜40秒間置き、完全に乾燥させます。乾燥後、スライドをRNaseフリー70%エタノールの最初のチューブに浸します。

スライドを30秒間浸し、その後、45秒から1分間、上下に浸漬させてOCTを洗い流します。次に、スライドを溶液から取り出し、ラボワイプで余分な液体を拭き取ります。この工程を、2本目の70% ethanolが入ったチューブにスライドを浸して繰り返します。

脊髄切片の周囲にOCTが残っている場合は、3本目のチューブで洗浄を繰り返します。余分な液体を切り出した後、スライドを70%エタノール（RNA分解酵素フリー）で希釈した1% Azure B溶液に30〜45秒間浸します。Azure Bの余分な液をラボワイプで拭き取ります。

この時点で、スライド全体が青色になります。スライドを次の70% ethanolのチューブに浸し、3〜4回素早く上下に動かして過剰な染料を除去し、特定の運動ニューロンの染色を可視化させます。切片の染色が非常に濃い場合は、新しい70% ethanolのチューブで脱染色ステップを繰り返してください。

染色が薄すぎる場合は、スライドを再びAzure B溶液に戻してさらに32秒間浸し、DES染色を繰り返します。染色が十分であれば、スライドを短時間自然乾燥させ、次のステップに進みます。DES染色と乾燥後、灰白質は淡い青色になり、濃い青色に染色された運動ニューロンが容易に観察できるようになります。

顕微鏡の電源を入れた後、すぐに解剖を開始します。チューブホルダーから取り外し、0.6 mm マイクロ遠心チューブのキャップを取り付けます。サンプル回収のため、キャップに 30 µL のグアニジンチオシアネート溶解バッファーを入れ、溶液を広げて表面を覆います。

ピペットチップを用いて、キャップを穴および対物レンズと合わせます。顕微鏡ソフトウェアを使用して、レーザーキャプチャを開始するまでキャップをカバー位置に保持します。空気乾燥させたスライドを、メンブレン側を下に向けて顕微鏡のステージ上に置き、切片が穴と一致するように配置します。

スライドをセットし、5倍対物レンズで脊髄切片に焦点を合わせた後、切り出しのために20倍対物レンズに切り替えます。まず、ライトペンでダミー領域をマークし、回収せずにレーザーで切り出します。これにより膜が弛緩し、複数の領域を連続的にマークして切り出すことが可能になります。

次に、再フォーカスして腹角領域の運動ニューロンを特定します。これらのニューロンは、その位置、形態、大きなサイズ、およびAzure Bによる濃い青色の染色によって識別可能です。ライトペンを使用して描画ツールを選択し、運動ニューロンの縁に沿って完全なアウトラインをマークします。他の細胞による混入を避けるため、アウトラインは運動ニューロンにできるだけ近づけて描画してください。

ソフトウェアが切断準備完了時に位置を記憶するため、切断前に複数の細胞をマークすることができます。キャップを切断位置の下に移動させ、スタートボタンをクリックして、レーザーによる運動ニューロンの解離を開始します。すべての切片から回収したすべての運動ニューロンを、1本のマイクロ遠心チューブのキャップに集めます。回収が完了したら、トレイをアンロードしてホルダーからマイクロ遠心チューブを取り出し、溶液をピペッティングして運動ニューロンとバッファーを完全に溶解させます。

遠心分離によって溶液をチューブの底に集め、Azure Bで染色後、サンプルを直ちにドライアイスで凍結し、-80°Cで保存します。運動ニューロンは、大きく濃く染色された細胞体として現れます。これらはanti-CHAT抗体染色によって確認され、周囲のより小さな細胞と容易に区別できます。この例では、運動ニューロンの細胞体がライトペンで囲まれ、ソフトウェアによって番号が付けられています。

ここでは、レーザーを用いて細胞体が切り出され、アウトライン表示をオフにした状態で回収チューブに落とされています。隣接領域へのレーザー損傷の程度が明らかです。LMDによって回収された約4,000個のマウス運動ニューロン細胞体サンプルのRNA完全性を電気泳動分析した際のごく一般的な結果がここに示されています。

顕著なリボソームRNAのピークに注目してください。RNAの分解を最小限に抑えるため、スライド染色から運動ニューロンの切り出しまでのこのプロセスは、1枚のスライド上のすべての切片に対して30分以内に完了させる必要があります。この手順を行う際は、最初の脊髄の切り出しと包埋、および最終段階の染色と運動ニューロンのレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにおいて、可能な限り迅速に作業することが重要です。