Name: カルボキシフルオレスチンスクシニミジルエステルを用いたヒト抗原特異的CD4+T細胞の増殖の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学ぶカルボキシフルオレスセインを用いたヒト抗原特異的CD4+T細胞増殖の定量法。希な抗原特異的T細胞を検出・分離し、自己免疫疾患の研究に有用なツールを提供する。

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この研究は、若年性糖尿病研究財団[JDRF 5-CDA-2014-210-A-N](S.M.)によって支援されました。国家保健医療研究評議会(NHMRC GNT123586)、糖尿病オーストラリア研究信託ミレニアム賞(Y17M1-MANS)(S.M.)、ビクトリア州政府の運用インフラ支援プログラム(S.M.、A.D.、E.T.、M.S.)、およびNHMRC大学院奨学金APP1094337とJDRF博士トップアップ奨学金(M.S.)。

すべての被験者は、末梢血の採取前にインフォームド・コンセントを与えた。PBMCを用いた実験の倫理的承認は、セントビンセントのホスプティアル(HREC-A 135/08、HREC-A 161/15)によって与えられた。
1. 試薬の調製
<ol><li>
ヒトT細胞培養
	<ol>
<li>RPMI 1640、1x非必須アミノ酸、L-アラニル-L-グルタミンジペプチド(2mM)、ペニシリン(100U/mL)/ストレプトマイシン(0.1mg/mL)、および5%プールヒト血清(PHS)から成るPBMCを培養するためのRP-5培地を調製する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CFSEストックソリューション
	<ol>
<li>DMSOの約9mLで25mgのCFSEを溶解してマスターストックを準備し、5mMの濃度で最終ストック溶液を達成します。</li>
		<li>PBSのマスターストックを希釈して作業ストックを準備し、10 μMの作業濃度を達成します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 全血からのヒトPBMCの調製
<ol><li>ヒト末梢血の0.5〜1.5 x 106 PBMC/mLの間に一般的です。したがって、必要な血液量は、PBMCの所望の数に依存し、PBSを用いてヒト末梢血を少なくとも1:2で希釈する。50 mLチューブに密度勾配媒体の15 mLを追加してPBMCを分離し、希釈された全血の35 mLをオーバーレイします。</li>
	<li>室温(RT)で減速することなく15分間850 x gで遠心分離機。これは、赤血球ペレットを含む底層、その上部インターフェースを裏打ちする白血球を有する密度勾配媒体の中間層、およびトップ血漿層14の3つの明確な層をもたらす。</li>
	<li>最上のプラズマ層の約20mLを取り除きます。赤血球ペレットを避けるために注意して、白血球層を収集します。PBSで3倍を洗浄し、血球計でトリパンブルーの除外を使用して生存細胞を数えます。PBS で 1 x 106 PBMC/mL に希釈します。</li>
	<li>
非CFSE染色細胞
	<ol>
<li>これらの細胞は、無染色およびCD4+単一染色細胞を含むフローサイトメトリーの補償制御として使用される。各制御サンプルPBMCサスペンションの300 μLを10 mLチューブに追加し、PBSを搭載したトップ、およびRTで5分間550 x gの遠心分離機を追加します。</li>
		<li>RP-5メディアで1 x 106セル/mLを再中断します。これらの標識されていない細胞をCFSE標識細胞で37°C/5%CO2インキュベーターで7日間インキュベートします(ステップ2.6.1)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CFSE染色細胞
	<ol>
<li>ステップ 2.3 から 50 mL チューブにセルを移します。チューブの側面に1mLのセル懸濁液あたり1.0 μLのCFSEワーキングストックソリューション(10 μM)を追加します。チューブを数回反転して素早く混ぜます。CFSEの最終濃度は10nMです。</li>
		<li>37 °C/5% CO2インキュベーターで 5 分間インキュベートします。染色を停止するには、RP-5培体の5 mLを追加し、550 x gで5分間遠心分離することにより細胞をペレットする。RP-5 メディアの 1 x 106/mL で PBMC を再中断します。</li>
		<li>10 mLチューブに1.0 mLのセルサスペンションを追加します。テストする各抗原に 1 つのチューブを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ヒトPBMCおよび細胞培養の抗原刺激
	<ol>
<li>37°C/5%CO2インキュベーターで7日間RP-5培中の抗原を用いたヒトCFSE標識PBMCを培養した。希釈抗原を含むRP-5培地の100μL/ウェルを有する96ウェルプレート中の培養1x 105細胞/ウェル(100μL)。 注:作業濃度を含む使用される抗原は、表1に要約されています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. FACS分析用アンチCD4染色
<ol><li>培養細胞のピペット200μLをFACSチューブに、0.1%FCSを含むPBSの1.0mLで細胞を1x洗浄し、550xgで5分間遠心分離機を洗浄する。</li>
	<li>PBS/0.1%FCSの100 μLで抗ヒトCD4アレクサフルー647(0.25 mg/mL)で汚れ。他の蛍色素に染色されていないCFSE標識細胞のサンプルは脇に置き、FACS CFSE補正の設定に使用してください。光から保護された4°Cで細胞を20分間インキュベートします。</li>
	<li>PBS/0.1%FCSの1 mLを加え、RTで5分間550xgの遠心分離機を加え、100 μLのPBS/0.1%FCSで再懸濁して細胞を洗浄する。FACS分析の直前に、すべてのチューブにヨウ化プロピジウム(PI、0.1 mg/mL)の1 μLを加え、死んだ細胞をフローサイトメトリーで排除できるようにします。</li>
</ol>4. フローサイトメトリック構成とゲーティング戦略
注:図 1は、報酬制御とゲーティング戦略を含む FACS 構成を示しています。
<ol><li>前方散乱(FSC)対側散乱(SSC)(図1A)集団をゲートして、すべてのリンパ球を含む。</li>
	<li>Pi陰性細胞のFSCとPI(図1B)の集団をゲートして、アポトーシス細胞を除外する。</li>
	<li>無染色細胞を使用して、非蛍光細胞の電圧ベースラインを設定します。CD4-A647およびCFSEの電圧を設定して、蛍光信号がそれぞれ1,000以下に設定します(図1C)。単一色制御CFSE(図1D)とCD4-A647(図1E)を使用して、染色されていないセルで設定された電圧を使用して、各色の正の蛍光信号(約10,000)を確認します。</li>
	<li>CFSE と PI にはスペクトルの重なりがあります。CFSEのみのサンプルがPIチャネルで信号を得なくなるまで、CFSE蛍風からPI蛍を減算する補正を調整します。 注:これらのゲートは、ここで分析されたすべてのサンプルに適用した。</li>
</ol>5. 抗原特異的CD4+T細胞増殖を列挙するための細胞分裂指数の計算
注:細胞分裂指数(CDI)は、5,000個の未分割細胞当たりの分割細胞数(CD4+/CFSE明るい)を指す。分割されていないCD4+細胞の数が正確に5,000ではない場合、分割された細胞の数は、5,000個の未分割細胞あたりの分割細胞数を表すために補正される。例えば、破傷風トキソイド特異的増殖(図2D)を用いて、4,930個の未分割細胞(CFSE明るい)と3,268個の分割細胞(CFSE dim)があった。したがって、分割されたセルの補正数は (5,000/4,930) x 3,268 = 3,304.3 です。
<ol><li>抗原を含まない細胞から分断された細胞の数/5,000の未分割細胞の数を、抗原を含まない細胞から分断された細胞の平均数(5,000非分割細胞当たり)で割って計算する(表2)。</li>
</ol>

<ol><li>Duque, A., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+effects+of+BrdU+and+3H-Thymidine+incorporation+into+DNA+on+cell+proliferation%2C+position+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).</li>
<li>Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation%2C+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106, 87-95 (2002).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).</li>
<li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+%28CFSE%29+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).</li>
<li>Ten Brinke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+T-cell+responses+in+translational+studies%3A+Optimization+of+dye-based+proliferation+assay+for+evaluation+of+antigen-specific+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).</li>
<li>Gillespie, G. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+TCR+Conservation+and+Altered+T+Cell+Cross-Reactivity+Characterize+a+B%2A57-Restricted+Immune+Response+in+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolgy%22%5BJournal%5D)">Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection.</a> Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).</li>
<li>Tynan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Structures+of+Highly+Bulged+Viral+Epitopes+Bound+to+Major+Histocompatibility+Complex+Class+I%3A+Implications+for+t-cell+receptor+engagement+and+t-cell+immunodominance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance.</a> Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).</li>
<li>Blanchard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+aminopeptidase+associated+with+antigen+processing+defines+the+composition+and+structure+of+MHC+class+I+peptide+repertoire+in+normal+and+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells.</a> Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).</li>
<li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specificity+groups+in+the+T+cell+receptor+repertoire+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire.</a> Nature. 547, 94-98 (2017).</li>
<li>Wooldridge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricks+with+tetramers%3A+how+to+get+the+most+from+multimeric+peptide+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC.</a> Immunology. 126, 147-164 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+cloning+human+autoantigen-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).</li>
<li>So, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinsulin+C-peptide+is+an+autoantigen+in+people+with+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).</li>
<li>Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Epstein-Barr+Virus+Growth-transformed+Lymphoblastoid+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).</li>
<li>Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expansion+of+high+or+low+avidity+cytotoxic+T+lymphocytes+and+efficacy+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しない。

CFSEベースの増殖は、抗原特異的ヒトCD4+T細胞を検出および列挙するためのシンプルで堅牢な方法です。CFSEの最適な濃度を使用することは、最適な結果4のために不可欠であることを以前に実証されています。あまりにも多くのCFSEは増殖をアブローしますが、あまりにも少なすぎると、分割された細胞と分割されていない細胞を区別することはできません。対照的に、CFSEの比較的高濃度(5.0 μM)は、精製されたマウスT細胞3を標識するために使用される。バッチ間の変動性のため、最適な濃度を決定するために各バッチを計算することをお勧めします。現在のバッチは、元のパブリケーション (200 nM)4よりもはるかに低い濃度 (10 nM) で使用します。
この方法のもう一つの重要な側面は、抗原用量の最適化である。より少ない抗原で培養されたT細胞は、より敏感であり、増強された機能を示すことができることが十分に確立されている。これはもともと...

抗原特異的T細胞を検出し、研究する能力は、細胞媒介性免疫の研究において重要である。しかし、これを行うことは、非常に弱く、検出が困難な自己抗原特異的CD4+T細胞応答のために特に困難です。抗原特異的リンパ球増殖の検出に使用される一般的な方法は[3H]-チミジンであり、これは増殖細胞のDNAに組み込まれた放射性標識ヌクレオチドである。[3H]-チミジンアッセイはDNA合成を検出できますが、この方法は細胞分裂の間接的な尺度であり、DNA合成は、遺伝子の複製およびアポトーシス1の間に独立して開始することができるので、細胞分裂の間接的な尺度である。この問題は、細胞の抗原特異的増殖がかなりのアポトーシス2をもたらす可能性があるという事実によって悪化し、抗原特異的増殖の潜在的な過大評価につながる。さらに、[3H]-チミジン法は、抗原ペプチドで刺激されたPBMCにおけるCD4+またはCD8+系統増殖などの増殖リンパ球に対する表現型情報を提供しない。
2003年には、CFSEを用いて初めての染料希釈アッセイを発表し、CFSEベースの増殖アッセイ3、4と呼ばれる。CFSEは、細胞内リジン残渣に対する共生結合を形成することにより、細胞内タンパク質に安定的に結合する蛍光色素です。CFSE標識タンパク質は娘細胞3の間で均等に分かれているので、分裂した細胞はフローサイトメトリーによって未分裂細胞と区別することができ、これはリンパ球集団の定量的表現型を可能にする。確かに、細胞がCFSE染色の時から受けた分裂の数は、ある程度5まで測定することができる。最近では、CellTraceバイオレット増殖色素(VPD)やCytoTrack色素などの多くの同様の染料が開発されており、同様の方法で動作します6。このプロトコルはCFSEに焦点を当てていますが、原理は他の関連染料にも同様に適用されます。
ペプチド-MHCテトラマー染色は、抗原特異的CD8+T細胞を検出およびクローニングするための広く使用されている方法である。これは、確立された方法7、8、9、10です。しかし、テトラマーベースのクローニングは、エピトープ/MHC制限の既存の知識を必要とし、各エピトープは、新規エピトープ特異的T細胞の発見およびクローニングの範囲を制限する独自のテトラマー11を必要とします。CFSEベースの増殖は、ペプチド、タンパク質、または細胞のライサットと使用することができます。ここに記載されるプロトコルは、シンプルかつ堅牢であり、応答CD4+T細胞は、下流の機能性および生化学的特徴付けアッセイ12、13で使用するためにソートすることができる。

<table><tbody><tr><td>抗ヒト CD4-AlexaFluor647</td><td>Biolegend</td><td>317422</td><td>RRID:AB_2716180</td></tr><tr><td>カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル (CFSE)</td><td>ThermoFisher</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (1x)</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1</td><td>Sino Biological</td><td>40010-V07E</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (1x)</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (1x)</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>プールされたヒト血清</td><td>オーストラリア赤十字</td><td>社 N/A</td><td></td></tr><tr><td>プロインスリン C-ペプチド PI33-63</td><td>Purar Chemicals</td><td>N/A</td><td>カスタム合成ペプチド</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr>破<tr><td>傷風トキソイドタンパク質</td><td>Statens血清研究所N</td><td>/ A</td><td></td></tr>を作った</tbody></table>

カルボキシフルオレスチンスクシニミジルエステルを用いたヒト抗原特異的cd4+t細胞の増殖の定量化

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

記載されているのは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)における抗原特異的CD4+T細胞増殖を測定するための簡便な、インビトロ、色素希釈ベースの方法である。カルボキシフルオレセイン・スクハニミジルエステル(CFSE)のような安定した、非毒性の蛍光色素の開発は、フローサイトメトリーによって検出されるような蛍光染色における減少によって、まれな抗原特異的T細胞を傍観者と区別することを可能にする。この方法は、代替アプローチに対して次の利点があります:(i)低周波T細胞に対して非常に敏感であり、(ii)抗原またはエピトープの知識が必要とされない、(iii)応答細胞の表現型を分析することができ、(iv)生存可能な応答セルを並べ替え、T セルのクローニングなどのさらなる分析に使用できます。

破傷風トキソイドタンパク質を用いたヒトPBMCのインビトロ刺激:PBMCをCFSEで染色し、破傷風トキソイドの存在下で7日間刺激した。ほとんどすべてのドナーは、彼らがワクチン接種されたので、破傷風トキソイドに強いT細胞応答を示した, 破傷風トキソイドは有用な陽性対照抗原になります.図2は、非刺激PBMCからのCD4+T細胞のCFSE増殖が最小限であったことを三文で示す(~12 CFSE薄暗い細胞;図 2A,B,C)破傷風トキソイド(&gt;3,000 CFSE薄暗い細胞)に応答してCD4+T細胞の顕著な増殖があった。図 2D,E,F)
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa...

ここで提示される、色素希釈を用いた抗原タンパク質またはペプチドに応答して増殖CD4+T細胞を測定するためのプロトコルである。このアッセイは、特に希少な抗原特異的T細胞に対して感受性があり、抗原特異的細胞のクローニングを容易にするために改変することができる。

カルボキシフルオレスチンスクシニミジルエステルを用いたヒト抗原特異的CD4+T細胞の増殖の定量化

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

このプロトコルは、しばしば弱く、検出が困難なCD4T細胞応答を研究するためのプラットフォームを提供する。この技術は、抗原の提示に関する事前知識なしにCD4T細胞の検出、列挙、および単離を可能にする。主な利点は、1型糖尿病などの自己免疫状態に関連する非常に頻繁にまれな集団であるCD4T細胞の分析である。健康なドナーから末梢血サンプルを得ると、50ミリリットルチューブ中の密度勾配培地の15ミリリットル以上の血液を35ミリリットルに重ねる前に、PBSの血液を少なくとも1〜2の比率で希釈する。密度勾配遠心分離によって細胞を分離し、得られた上の血漿層の約20ミリリットルを除去する。次に、赤血球ペレットを避けるように注意して白血球層を収集し、新鮮なPBSで細胞を3回洗浄します。カウント後、細胞をPBS濃度の1ミリリットル当たり6番目の末梢血単核細胞またはPBMCに10倍に希釈する。個々の10ミリリットルのチューブに各コントロールのための細胞の300マイクロリットルを追加します。PBSで各チューブをトッピングした後、遠心分離によって細胞を沈下し、RP5培地濃度のミリリットル当たり6番目の細胞に10回で細胞を再懸濁する。その後、1ウェルあたりRP5培地の100マイクロリットルを含む96ウェルプレートの3つの井戸のそれぞれに制御ごとに細胞の100マイクロリットルをプレート。7日間培養インキュベーターにプレートを置きます。次に、残りのPBMCを新しい50ミリリットルチューブに移し、1ミリリットルの細胞懸濁液につき1マイクロリットルのCFSE作業ストック溶液をチューブの側面に加えます。チューブを数回素早く反転させ、細胞を5分間培養インキュベーターに混ぜ合わせます。インキュベーションの終了時に、5ミリリットルのRP5培地で反応を阻止し、遠心分離により細胞を採取する。ペレットを新鮮なRP5培地のミリリットル当たり10〜6 PBMCに1回再懸濁し、試験される抗原あたり10ミリリットルのチューブに1ミリリットルの細胞を加えます。その後、1つの抗原につき100マイクロリットルの細胞を、1ウェルあたり対象の希釈された抗原を添加したRP5培地の100マイクロリットルを含む96ウェルプレートウェルの各ウェルに加えます。7日間培養インキュベーターにプレートを置きます。フローサイトメトリック解析のためにCD4+T細胞集団を染色するために、培養終了時に各ウェルから個々の蛍光活性化細胞選別またはFACSチューブに細胞の全容を移す。0.1%の胎児の子牛血清またはFCSで補われたPBSの1ミリリットルで各サンプルを洗う。適切な抗ヒトCD4抗体のペレットを、チューブあたりPBSとFCSの100マイクロリットルで再懸濁します。光から保護された20分間、摂氏4度で細胞をインキュベートします。インキュベーションの最後に、新鮮なPBSとFCSの1ミリリットルの新鮮なPBSと1チューブあたりのFCSでサンプルを洗浄し、新鮮なPBSとFCSの100マイクロリットルでペレットを再中断します。分析の直前に、各チューブにヨウ化プロピジウム1マイクロリットルを加える。前方および側面の散乱領域に応じてリンパ球をゲートします。アポトーシス細胞を除外するには、ヨー化陰性プロピジウムとの間に前方散乱領域をゲートし、非蛍光細胞の電圧ベースラインを設定するために未染色セルを使用します。蛍光シグナルがそれぞれ1000以下になるように、CD4抗体フルオロフォアとCFSE信号の電圧を設定します。単色制御CFSEおよびCD4サンプルを使用して、染色されていないセルで設定された電圧を使用して、各色の正の蛍光シグナルを確認します。CFSEとヨウ化プロピジウムは、ある程度のスペクトル重複を有するので、CFSEのみのサンプルがヨウ化プロピジウムチャネルにシグナルを生じなくなるまで、蛍光CFSEからヨウ化プロピジウム蛍光を差し引くように補正を調整する。全てのサンプルが分析されたら、抗原を刺激したグループから分割細胞数を5000個の未分割細胞で除いて細胞分裂指数を算出し、抗原を含まない細胞から5000個の未分割細胞当たりの分割細胞の平均数を求める。ほとんどすべてのドナーは、破傷風トキソールを有用な陽性対照抗原にするワクチン接種を受けているため、インビトロ刺激後の破傷風トキソールに対する強いT細胞応答を示す。しかし、非刺激性PBMCからのCD4+T細胞の増殖は最小限である。ヒトプロインスリンC-ペプチドによる7日間の刺激の後、プロインスリンCペプチド特異的CD4+T細胞は、1型糖尿病の個人の末梢血で検出することができる。インフルエンザAウイルスマトリックスタンパク質で刺激されたPBMCも増殖を示す。これらのデータをまとめて、これらのデータは、アッセイが短い合成ペプチドと同様に全長タンパク質を使用して行われることを実証する。この方法のFACS成分は、細胞分類フローサイトメーターを用いて行うことができる。細胞ソーターを使用して、抗原特異的T細胞を、下流分析のために単一細胞レベルで単離することができる。この方法により、早期発症1型糖尿病の個体におけるCD4T細胞応答の発見が可能になった。他の方法を用いたこれらの稀なT細胞集団を分析することは、様々な技術的課題を提示する。

quantification-proliferating-human-antigen-specific-cd4-t-cells-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

この手順では、精製および抗原特異的CD4 + MHCクラスIIテトラマーを用いて全末梢血とその可視化から、T細胞のin...

抗原特異的CD4 + T細胞はMHCクラスIIテトラマーを用いての可視化

CFSEは共有結合蛍光色素、カルボキシで長寿命の細胞内分子にラベルを付けます。このように、CFSE標識細胞が分裂するときに、その子孫は、それによって細胞分裂を評価するために使用できる蛍光の半分の量を、持っている。この資料では、通常CFSEでマウスのリンパ球を標識するために使用される手続きを説明します。...

リンパ球増殖を監視するためのカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）の使用

Tregsのは、免疫系の強力な抑制因子である。それ故に、それらを定義するためにユニークな表面マーカーの欠如が存在する、Tregsのの定義は、主に機能的です。ここでは、最適化を説明...

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

免疫細胞機能や増殖を監視するための細胞追跡用染料の使用の成功は、いくつかの重要な手順が含まれます。我々は、するための方法を説明します：1）膜染料と明るく、均一で、再現可能なラベルり得るステップと、2）蛍光色素とデータ収集条件を選択すると、3）色素希釈に基づいて、細胞増殖を定量化するためのモデルを選択する。...

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

このビデオでは、さまざまな細胞周期の段階で抗原特異的なCD8+...

抗原特異的CD8+ T細胞の細胞周期解析のためのアッセイ

このビデオは、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞をex...

キメラ抗原受容体T細胞を作製するex vivo技術

このプロトコルは、高感度の細胞ベースの細胞毒性アッセイについて説明しています。このアッセイは、エフェクターCD8+ T細胞の数が増加している場合の生標的CD4+ T細胞の頻度の減少を列挙することにより、抗原特異的CD8+...

細胞毒性活性を測定するための細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ

標準的な免疫学的技術のアプリケーションをご紹介 (CFSE 染色 OT-私増殖) 急速に補助を介した細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) の生成をモニターするつもり体内。CTL...

急速なIn Vivo評価補助の細胞傷害性 T リンパ球生成機能のワクチン開発のため

ここでは、迅速かつ再現性をもって生物学的に促された、生分解性のバスユニットなど抗原提示し、可変サイズ、形状、および T 細胞の拡大前のヴィヴォまたは体内表面蛋白質プレゼンテーションと細胞 (aAPC) を生成するためのプロトコルを提案します。.

異方性高分子人工抗原提示細胞 cd 8 + T 細胞活性化のための加工

ここでは、がん免疫サイクルを構成するステップをモニターし、特性評価するための、シンプルで高速、かつ信頼性の高いマルチパラメトリックフローサイトメトリーおよびTumor-on-a-chip支援プロトコルについて詳しく説明します。実際、がんと免疫細胞の相互作用を完全に理解することで、腫瘍を出し抜き、臨床ケアを導くための重要な洞察が得られます。...

がん免疫サイクルを再現するためのin vitro共培養システム

学ぶカルボキシフルオレスセインを用いたヒト抗原特異的CD4+T細胞増殖の定量法。希な抗原特異的T細胞を検出・分離し、自己免疫疾患の研究に有用なツールを提供する。

カルボキシフルオレスチンスクシニミジルエステルを用いたヒト抗原特異的CD4+T細胞の増殖の定量化

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