二重ルシファーゼレポーターシステムによるCRISPRプラスミドの構築と哺乳動物細胞におけるノックアウト効率の検出
December 5th, 2020
ここでは、CRISPR酵素と関連する単一ガイドRNA(sgRNA)の両方を発現するプラスミドの効率的な生成のための合理化された方法を説明するプロトコルを提示する。このsgRNA/CRISPRベクターと二本鎖破断修復を調べる二重ルシファーゼレポーターベクターを用いた哺乳動物細胞の共トランスフェクションにより、ノックアウト効率の評価が可能です。
このプロトコルは、効率的なsgRNAベクターの生成および最適化における重要なステップを説明する。候補sgRNAの先行加速は、相対的な時間と推論をターゲットにしています。このプロトコルの主な利点は、内因性遺伝子を編集することなく、各sgRNAのDNAコードインプレッションを分析することができるということです。
この事前選択方法は、二本鎖破断を通じて他の遺伝子編集手段にも適用することができる。まず、凍結乾燥したオリゴヌクレオチドを、二重蒸留水中の10ミクロモルの最終濃度に希釈します。余分なバッファーを追加せずに、薄層 PCR チューブ内の前方オリゴヌクレオチドとリバース オリゴヌクレオチドを 1 対 1 の比率で混合します。
95°Cで5分間インキュベートし、温度を摂氏72度まで10分間下げます。PCRマシンからオリゴヌクレオチドミックスを取り出し、室温で冷却させます。pX330-xCas9ベクターを消化するには、Bbs1で、ベクター、酵素、および消化バッファーを50マイクロリットルの体積で組み合わせ、反応を摂氏37度で2時間インキュベートします。
細胞変換を行った後、LBプレートから5〜10個の細菌コロニーを選択し、それぞれを使用して1.5ミリリットルチューブに60ミリグラムのアンピシリンを含むLB培地1ミリリットルを接種します。その後、2〜3時間ロータリーシェーカーにチューブをインキュベートします。テキスト原稿に記載されているように、組み換えプラスミドをスクリーニングするPCRを実行し、10ボルト/センチメートルの下で2%アガロースゲルで製品を実行します。
陽性プラスミドを同定した後、それらを使用して、レポーターベクターと共に、適切な細胞株を共にトランスフェクトする。細胞をライゼするには、培養細胞から増殖培地を除去する。PBSで培養容器の表面を静かに洗浄し、各培養ウェルにPLBの100マイクロリットルを分配し、細胞モノ層を完全に覆う。
プレートを室温で20分間インキュベートし、その後、さらなる取り扱いまたは保管のためにチューブまたはバイアルにリゼートを移します。二重ルシファーゼアッセイを実行するには、2秒の予読遅延を提供し、その後10秒の測定期間を提供するようにルミノメーターをプログラムします。次いで、100マイクロリットルのルシファーゼアッセイ試薬を適当な数のルミノメーターチューブに分配する。
20マイクロリットルの細胞ライセートをルミノメーターチューブに慎重に加え、2~3回ピペットで混合します。チューブをルミノメーターに入れ、読み取りを開始します。サンプルチューブをルミノメーターから取り外します。
100マイクロリットルのストップ試薬と渦を短時間加え、混合します。サンプルをルミノメーターに戻し、読み取りを開始します。レニラルシファーゼ活性を記録し、ホタルルシファーゼ活性、具体的には画面に表示される比率の逆数に正規化した。
終了したら、反応管を捨てます。この方法は、ヒツジDKK2エソン1用の3つのsgRNAベクターを生成するために使用した。sgRNAおよびxCas9発現ベクターは、ベクター骨格を事前に消化し、続いてアニールオリゴペアを介して一連の短い二本鎖DNA断片を連結することによって構築された。
7つの細菌コロニーを特異的プライマーペア誘導PCRでスクリーニングし、陽性コロニーを検出した。pX330-xCas9 T1、T2、およびT3の遺伝子標的容量を、デュアルルシファーゼアッセイで同時に検出した。最後のsgRNAベクターは、最も高い検出シグナルを表示し、その後、羊の遺伝子編集研究に使用されました。
このプロトコルに従って、T7EIアッセイまたはリボヌクレアーゼアッセイを行うことができる。これらの追加措置は、内因性遺伝子編集のより正確な印象を与える。
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概要
このプロトコルは、CRISPR酵素および関連する単一ガイドRNA（sgRNA）を発現するプラスミドを生成するための合理化された方法を説明しています。二重ルシフェラーゼレポーターベクターとの共同転染を通じて、ノックアウト効率の評価を可能にします。
主要な研究構成要素
科学分野
- 遺伝子編集
- CRISPR技術
- プラスミド構築
背景
- sgRNAベクターの効率的な生成は遺伝子編集に不可欠です。
- このプロトコルは、内在遺伝子を編集せずにDNAコーディングインプレッションの分析を可能にします。
- sgRNAターゲットの事前選択は編集効率を向上させることができます。
- この方法は様々な遺伝子編集手段に適用できます。
研究目的
- 効率的なsgRNAベクターを生成するためのプロトコルを提供すること。
- 遺伝子編集におけるsgRNAの有効性の分析を容易にすること。
- ノックアウト効率の評価プロセスを合理化すること。
使用された方法
- 凍結乾燥オリゴヌクレオチドを最終濃度10マイクロモラーまで希釈すること。
- PCRチューブでフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドを混合すること。
- sgRNA/CRISPRベクターとレポーターベクターを用いて哺乳類細胞への共同転染。
- 二重鎖切断修復効率の評価。
主要な結果
- このプロトコルは、sgRNAベクターの効率的な生成を可能にします。
- ノックアウト効率を効果的に評価できます。
- sgRNAターゲットの事前選択は編集プロセスを向上させます。
- この方法は他の遺伝子編集戦略にも適用可能です。
結論
- このプロトコルは、sgRNAベクターを生成するための信頼性の高いアプローチを提供します。
- 内在遺伝子を変更せずに遺伝子編集の分析を容易にします。
- この方法は遺伝子編集における様々な応用に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient sgRNA vector construction and rapid knockout efficiency assessment are critical for accelerating CRISPR-based target validation in early discovery pipelines. The dual luciferase reporter system enables quantitative, pre-endogenous screening of candidate sgRNAs, reducing time and resource expenditure before full-scale gene editing. This workflow supports portfolio triage by prioritizing sgRNAs with the highest editing potential for downstream applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid preselection of sgRNAs with high editing efficiency before endogenous gene targeting.
- Supports functional target validation by quantifying double-strand break repair via reporter assays.
- Reduces mechanistic ambiguity by isolating sgRNA performance in a controlled system.
- Facilitates predictive confidence in CRISPR reagent selection for subsequent studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, quantitative readout for sgRNA activity using dual luciferase ratios.
- Improves assay reproducibility and comparability across candidate sgRNAs.
- Enables scalable screening of multiple sgRNA constructs in parallel.
- Prepares validated sgRNA/CRISPR vectors for downstream gene editing workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sgRNA selection with translational goals by ensuring only high-efficiency reagents advance.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by minimizing failed edits in disease-relevant models.
- De-risks preclinical studies by front-loading sgRNA efficacy assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling efficient sgRNA selection prior to endogenous gene editing and downstream functional studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway interrogation by enabling rapid sgRNA efficacy screening.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible luciferase-based outputs for sgRNA comparison.
- Analytics: Provides normalized dual luciferase ratios to objectively rank sgRNA performance.
- Translational Research: Ensures only validated, high-performing sgRNAs progress to disease-relevant or preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for sgRNA validation across multiple gene targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in CRISPR reagent selection.
- Operational Value: Standardizes sgRNA screening and accelerates vector construction timelines.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by prioritizing high-efficiency sgRNAs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and reduces late-stage failure due to ineffective gene editing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell transfection, and luciferase assay execution.
- Needs access to PCR, gel electrophoresis, and luminometer instrumentation.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data normalization.
- Adaptable to various mammalian cell lines and gene targets with appropriate optimization.
- Dependent on accurate oligonucleotide design and vector preparation for reproducible results.
