Name: 外傷性脳損傷マウスモデルにおける鼻腔内送達後のMRIを用いた超常磁性酸化鉄標識間葉系幹細胞の追跡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶ外傷性脳損傷マウスモデルにおける間葉系幹細胞の鼻腔内送達とMRI追跡法。超常磁性酸化鉄ナノ粒子を用いた非侵襲的細胞標識により、脳内細胞分布を可視化し、再生医療への応用可能性を示す。

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この作品は科学技術省補助金の支援を受け、 台湾(MOST 104-2923-B-038-004-MY2、MOST 107-2314-B-038-063、およびMOST 107-2314-B-038-042)と台北医科大学(TMU 105-AE1-B03、TMU 106-540-000-000-000-000,T40-000,T40-000-T400-000-T400106-5310-001-400、DP2-107-21121-01-N-05、DP2-108-21121-01-N-05-01)。

このプロトコルの動物に関するすべての手続きは、台北医科大学における動物使用に関する倫理委員会の承認を得て、制度的動物管理利用委員会によって承認された(承認なし.LAC-2018-0574;15.03.2019).
1. SPIOナノ粒子によるMSCのラベリング
<ol><li>MSC に SPIO のラベルを付けるには、6 mL のラベリング メディア (ダルベッコド イーグル培地 [DMEM] で 25 μg/mL を胎児の牛血清 [FBS]) を追加し、MSC (80% の合流性) を含む T75 フラスコに追加します。</li>
	<li>
CO2インキュベーター(37°、5%CO2)で標識媒体を用いて細胞を振とうでインキュベートする。24時間後、真空に取り付けたプラスチックチップを付けた滅菌パスツールピペットを使用して、ラベリングメディアを軽く取り外します。6 mL のリン酸緩衝生理食塩線(PBS)で細胞単層2xを洗浄し、内部化されていないSPIOの痕跡を除去します。
	<ol>
<li>細胞が正常に標識されたかどうかを判断するには、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で標識された細胞を調べ、SPIOが蛍光色素でタグ付けされている場合(すなわち、ここで使用されるものと同様に;図 1B,C) を図 1 に示します。または、細胞に対してプルシアンブルー染色を行います(染色プロトコルについては、ステップ6.2~6.4を参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>トリプシンを3mLで処理して付着細胞を収穫し、37°Cでインキュベートする。インキュベーションの5分後、トリプシンを無効にするには、10%FBS(v/v)で7mLの事前温めDMEMメディアを追加します。ピペットを使用して15 mL円錐チューブに細胞懸濁液を収集します。</li>
	<li>細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離します。トリパンブルー染料と血球計を使用して生存細胞を数えます。 注:標識されたセルのセルペレットは、鉄の荷重により暗い色で表示されます(図1D)。このプロトコルは、MSC ラベリングおよび MRI イメージングに関連します。MSC ラベリング6の手順は以前に最適化されており、インビボ トラッキングが焦点であるため、インビボトラッキングを追跡するためにラベル付き MSC を準備する手順のみがここに含まれています。他の細胞型の培養および標識のためのプロトコルは、研究者によって最適化されるべきである。</li>
	<li>PBSを使用して150,000細胞(または十分なMRI信号になる数値)を18μLのPBS(または鼻腔内送達手順で使用される総体積)に調整します。 注:PBSの150,000細胞/18μLより高い細胞濃度が細胞凝集につながり、鼻腔内送達の効率に影響を及ぼす可能性があることに気付きました。鼻腔内送達に必要な細胞数が多い場合は、細胞懸濁液の総体積を増やし、鼻腔内投与の数を増やし、鼻腔内投与は非侵襲的な処置であり、複数の投与が可能である。</li>
</ol>2. コントロールされた皮質衝撃(CCI)傷害
注:このプロトコルでは、オスのC57 BL/6マウス(生後7~8週齢)を、食物と水へのアドリビタムアクセスを伴う12/12時間の光/暗いサイクルに保たれました。
<ol><li>CCI損傷に対して各マウスを調製するには、腹腔内(i.p.)注射(1 mL/kg)を介してゾラゼパム(50 mg/kg)およびキシラジン(20 mg/kg)麻酔カクテルを投与する。つま先ピンチ応答の欠如によって麻酔の深さが十分であることを確認してください。または、マウスを2%~4%のイソフルランを供給したチャンバーに60s入れ。
</li>
	<li>電子ヘアクリッパーを使用して、耳の間の頭蓋骨の後ろ面の毛皮を剃ります。ヨウ素に浸した滅菌綿棒を使用して、剃った領域を数回清掃します。70%エタノールに浸した綿棒を使用してヨウ素をきれいにします。</li>
	<li>麻酔をかけたマウスをステレオタクティックフレームに入れ、イヤーバーとノーズバーを使用してマウスを固定します。滅菌ハサミを使って頭蓋骨の表面にアクセスし、剃った皮膚の中唇切開(約2.5cm)を作ります。</li>
	<li>綿パッドを使用して骨の組織を取り除き、頭蓋骨を露出させます。3%H2O2を10s用に浸した綿棒を使用して頭蓋骨の表面を清掃し、乾いた綿パッドで洗浄します。 注:頭蓋骨の縫合糸とブレグマとラムダの両方を簡単に識別できるようになりました。</li>
	<li>CCI傷害の頭蓋骨表面上の選択した座標を識別し、鉛筆または適切なマーカーを使用して座標の周りに円(直径4mm)を描きます。 注:このプロトコルでは、前円柱(AP)-2.0mmおよびメディオラテラル(ML)+1.5mmの座標をCCI誘導に使用した。</li>
	<li>マイクロドリルと丸いバリ(直径0.5mm)を使用して、マークされた円で頭蓋骨を薄くします。骨を掘削すると脳性高粘腫に損傷を与える可能性があるため、穴あけ中に圧力をかけることは避けてください。清潔で乾燥した綿棒を使用して骨粉をきれいにします。</li>
	<li>無菌の細かい鉗子を使用して骨フラップをゆっくりと取り外し、そのまま維持したまま硬質を露出させます。怪我前の準備に使用されたステレオタクティック フレームからマウスを取り外し、CCI デバイスのステレオタクティック フレームに配置します。</li>
	<li>耳の棒と鼻の棒を使用してマウスの頭を安定させます。マウスの頭部がロストラル・コード方向のレベルであることを確認し、必要に応じてノーズバーを調整します。</li>
	<li>コントロールボックスの指示に従って、露出した皮質表面へのインモークターチップをゼロにします。インテクタの先端が、インテクタのベースにある X および Y コントロール ホイールを使用して、影響を受ける目的の皮質座標のすぐ上に位置合わせされていることを確認します。</li>
	<li>5 m/sの速度でコントロールボックスを使用して実験パラメータを設定し、250 msのドウェル時間、および1mmの傷害深度を使用して、マウスの軽度の傷害を誘発します。</li>
	<li>コントロールボックスの「インパクト」ボタンを押して怪我を誘発します。無菌綿棒を使用して発生するすべての出血を綿棒。</li>
	<li>ステレオタクティックフレームからマウスを取り出し、シルクの外科縫合糸を使用して切開部を閉じます。マウスはMRIの磁場を受けるので、金属クリップを使用して手術部位を閉じないでください。</li>
	<li>感染症を予防するために、外用抗生物質(バチトラシンネオマイシン)を手術部位に塗布する。マウスを加熱パッドの上に置き、回復段階で注意深く監視します。</li>
	<li>ケトプロフェン投与が研究目標と矛盾しない限り、手術後3日間ケトプロフェン(2.5 mg/kg、IP)を毎日投与する。</li>
</ol>3. 鼻腔内送達
<ol><li>1日後のCCI誘導で、ゾラゼパム(50mg/kg)およびキシラジン(20mg/kg)をi.p.注射による麻酔カクテルを投与する。つま先ピンチ応答の欠如によってマウスが深く麻酔されていることを確認します。</li>
	<li>
ヒアルロニダーゼ治療によるMSCの鼻腔内送達のためにマウスを準備する。
	<ol>
<li>マウスの擦り傷をつかみ、頭蓋骨を固定しながらしっかりと背中をオンにします。ヒアルロニダーゼを含むピペットの先端を無菌PBS(4 U/μL)に45°の角度でマウスの鼻孔の近くに置きます。</li>
		<li>各鼻孔にヒアルロニダーゼ懸濁液を3μL投与する。マウスを固定化し、5分間クリーンパッドの上を向いたままにします ヒアルロニダーゼ治療を4x繰り返します(合計100 Uヒアルロニダーゼ懸濁液)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ヒアルロニダーゼ治療の後、処理されたマウスを30分間上に向けた清潔なパッドの上に置いておきます。</li>
	<li>MSC を脳に送り込むには、手順 3.2.1 の説明に従ってマウスをしっかりと保持します。MSC懸濁液の3μL/鼻孔を3秒間隔で投与します。サンプルドロップが完全に消えるまで、マウスを同じ位置に30s保持し続けます。 注:投与中に気泡を形成することは避けてください。</li>
	<li>最大 3 倍の間隔で投与を繰り返します。 注:送達される細胞の総数は150,000であり、18μLの細胞懸濁液を各鼻孔に対して3μLの投与量で、それぞれ3倍で送達することができる。</li>
	<li>マウスをケージに戻し、麻酔から完全に回復するまで注意深く監視します。</li>
</ol>4. インビボ磁気共鳴イメージング
注:脳組織の組織学的染色は、以前に鼻腔内投与後の幹細胞の送達の成功を確認するために使用されてきた。ただし、この方法は、縦方向ではなく、スタディのエンドポイントとしてのみ使用できます。MRIプローブを使用して治療幹細胞に標識すると、MRIを用いた細胞の長手方向、非侵襲的な生体内追跡が可能になります。重要なことに、このプロトコルは、必要な動物の数を効率的に減らすことです。このプロトコルでは、MSC の配信後 1、7、および 14 日に MRI スキャンが実行されました。
<ol><li>MRIスキャン用にマウスを準備するには、アソフルランでマウスを麻酔する(誘導のためのO2の1L/分で5%のイソフルラン、メンテナンスのための1.5%-2%のイソフルラン)。つま先ピンチを実行して、マウスが必要な麻酔レベルに達していることを確認します。</li>
	<li>イメージングホルダーの上にマウスを置き、タップまたはその他の適切な方法を使用してその位置を固定します。ホルダーをMRIコイル(7 T/40 cmマグネット)の中央に移動し、監視接続を接続します。</li>
	<li>スピン エコー シーケンスを使用して T2*重み付けスキャンを取得するには、繰り返し時間 (TR) を 1500 ミリ秒に設定し、エコー時間 (TE) を 2.8 ミリ秒に設定します。</li>
	<li>16 mm x 16 mm の視野 (FOV)、128 x 128 集録マトリックス (MTX)、およびスライスの厚さ 0.75 x 0.8 mm2を使用し、4 つの信号平均と 90° 反転角度 (FA) を使用します。</li>
	<li>スキャンが完了したら、MRIコイルセンターからマウスホルダーを引き込みます。マウスをケージに戻し、麻酔から完全に回復するまで注意深く監視します。</li>
	<li>
T2*加重イメージ上のラベル付き MSC を追跡および定量化するには、ITK-SNAP ソフトウェア (バージョン 3.8.0)7を使用します。
	<ol>
<li>MRIスキャンの生データをMRIマシンのコンピュータからDICOM(医学におけるデジタルイメージングおよび通信)形式の分析に使用するコンピュータに転送します。</li>
		<li>ITK-SNAPソフトウェアを実行し、[ファイル]ボタンをクリックしてMRIイメージをロードします。次に、メニューの[メインイメージを開く]をクリックします。表示ウィンドウの[イメージを開く]ボタンを押し、[参照]ボタンを使用してMRIイメージを見つけて開きます。 注:MRI画像内の標識された細胞の視覚化は、低インテンス領域として表示されます。イメージのコントラストを調整する必要がある場合は、[ツール|画像のコントラスト:</li>
		<li>セグメンテーションラベルセクションで[アクティブラベル]を選択して、低インテンス領域と病変または他の脳部分のセグメンテーションを作成します。セグメントごとに異なるラベル色を使用します(複数のパーツのセグメンテーションが必要な場合)。</li>
		<li>メイン ツールバーの[ポリゴン]ツールを使用して、SPIO ラベルの付いた MSC を表す低い強い領域を描画します。セグメント化された領域は、その特定のセグメントに割り当てられたアクティブなラベルと同じ色で表示されます。すべての MRI スライスに対してこのセグメンテーション手順を繰り返します。</li>
		<li>[TheITK-SNAP] ツールボックスの下部にある [セグメンテーション ラベル]セクションにある [3D ツールバー] の下部にある[メスツール]を選択して、脳全体の MSC 分布を表すセグメント化された領域の3Dマップを作成します。次に、作成した 3D マップの下部にある[受け入れる] を押します。</li>
		<li>ラベル付きセルを表すセグメント化された低強度領域の定量分析 (体積と強度平均) を実行するには、上部パネルの[セグメンテーション]ボタンを押し、[ボリュームと統計]を選択します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. マウス脳の固定と低温切除
<ol><li>
マウスの脳を固定するには、前に説明したように、前回のMRIスキャンに続いて4%パラホルムアルデヒド(PFA)でトランス心灌流を行う。
	<ol>
<li>頭を切り落とし、脳を抽出 8 .4 °Cで少なくとも48時間のための4%PFAで脳を修正します。</li>
		<li>脳が溶液の底に沈むまで、4°Cで30%スクロース溶液に浸漬して脳を脱水します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>最適な切断温度(OCT)溶液に脳を埋め込み、-20°Cで凍結します。14μmの厚さのスライスにクライオスタットミクロトームで脳をセクションし、スライドにマウントします。さらに使用するまで、セクションスライドを-20°Cに保管してください。</li>
</ol>6. プルシアンブルー染色
注:プルシアンブルー染色は、SPIO標識細胞中の鉄含有量を検出するために一般的に使用される。ここでは、プルシアンブルー染色は、MRI画像中の低インテンス信号がSPIO標識MSCに対応し、アーティファクトに対応しないことを確認するために使用されます。プルシアンブルー染色は、組織中の鉄を検出するために使用される最も敏感な組織化学的方法の1つであり、細胞内の鉄の単一の顆粒を識別するために使用することができます。
<ol><li>5分間蒸留水で脳切片のスライドを洗浄します。</li>
	<li>均等な部分の塩酸(10%)を含む染色溶液に30分間スライドを浸漬することにより、プルシアンブルー染色を行いますフェロシアン化カリウム(10%)使用直前に準備。</li>
	<li>蒸留水で3倍を洗い、それぞれ5分間洗浄する。5分間核の速い赤でセクションを反染め.蒸留水でスライド2xをすすいでください。</li>
	<li>スライドを95%と100%のアルコールにそれぞれ2分間浸漬して、セクションを徐々に脱水します。樹脂製の取り付け媒体を使用してカバースリップを追加します。</li>
	<li>光顕微鏡を使用して、脳切片の染色細胞を検出します。 注:標識された細胞の鉄は青い色の堆積物として表示されます。</li>
</ol>

<ol><li>Pelled, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad8%2FBMP2-engineered+mesenchymal+stem+cells+induce+accelerated+recovery+of+the+biomechanical+properties+of+the+Achilles+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Research%22%5BJournal%5D)">Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon.</a> Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).</li>
<li>Shahror, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Overexpressing+Fibroblast+Growth+Factor+21+Facilitates+Cognitive+Recovery+and+Enhances+Neurogenesis+in+a+Mouse+Model+of+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury.</a> Journal of Neurotrauma. , (2019).</li>
<li>Danielyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+cells+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of cells to the brain.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (6), 315-324 (2009).</li>
<li>Karussis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunological+effects+of+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+patients+with+multiple+sclerosis+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Archives in Neurology. 67 (10), 1187-1194 (2010).</li>
<li>Danielyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%2C+macrophages%2C+and+microglia+to+the+brain+in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, macrophages, and microglia to the brain in mouse models of Alzheimer's and Parkinson's disease.</a> Cell Transplant. 23, Suppl 1 123-139 (2014).</li>
<li>Shahror, R. A., Ali, A. A. A., Wu, C. C., Chiang, Y. H., Chen, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Homing+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Overexpressing+Fibroblast+Growth+Factor+21+to+Injury+Site+in+a+Mouse+Model+of+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Enhanced Homing of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 to Injury Site in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury.</a> International Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li>
<li>Yushkevich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((User-guided+3D+active+contour+segmentation+of+anatomical+structures%3A+significantly+improved+efficiency+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability.</a> Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Li, Y., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+stromal+cell+transplantation+in+stroke+and+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury.</a> Neuroscience Letters. 456 (3), 120-123 (2009).</li>
<li>Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+CNS+repair+following+TBI%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Strategies for CNS repair following TBI.</a> Experimental Neurology. 275, Pt 3 411-426 (2016).</li>
<li>Ohtaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2Fprogenitor+cells+from+bone+marrow+decrease+neuronal+death+in+global+ischemia+by+modulation+of+inflammatory%2Fimmune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).</li>
<li>Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+marrow+stromal+cells+%28MSCs%29+increases+the+expression+of+growth+factors+in+rat+brain+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).</li>
<li>Hoehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+implanted+stem+cell+migration+in+vivo%3A+a+highly+resolved+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+investigation+of+experimental+stroke+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).</li>
<li>Reddy, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+mesenchymal+stem+cells+labeled+with+a+novel+chitosan-coated+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+using+3.0T+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI.</a> Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).</li>
<li>Roeder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+of+superparamagnetic+iron+oxide+labeling+on+mesenchymal+stem+cells+chondrogenic+differentiation%3A+a+multi-scale+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study.</a> PLoS ONE. 9 (5), e98451(2014).</li>
<li>Schafer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+human+mesenchymal+stromal+cells+with+superparamagnetic+iron+oxide+leads+to+a+decrease+in+migration+capacity+and+colony+formation+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability.</a> Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).</li>
<li>Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feridex+labeling+of+mesenchymal+stem+cells+inhibits+chondrogenesis+but+not+adipogenesis+or+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis.</a> NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

ここで説明するプロトコルは、MSC の SPIO ラベリングおよび SO ラベル付き MSC の鼻腔内配信の MRI 追跡に関する一般的な手順を表します。このプロトコルは、非侵襲的な方法を使用して、脳内の生体内でのMSCの移行および生体分布の移行および生物分布を研究する機会を可能にする。
MSCは、1)発動神経再ストレータプロセスを引き起こす栄養因子を分泌する能力によるCNS障害および傷害に対する幹細胞ベースの治療法の魅力的な候補であり、2)傷害領域9、10、11、12内の抗炎症作用に起因する神経保護を提供する。SPIO標識MSCの長期MRI追跡および検出は、細胞分裂による細胞間SPIOの希釈のために制限される可能性があるが、標識細胞は、動物モデル13の脳における移植後数週間まで検出することができる。
また、トランスフェクション剤を用いてデキストランで被覆されたSPIOナノ粒子を有するMSCの標識プロトコルについても説明する。文献14、15、16で他のプロトコルが使用されている。ただし、いずれの場合も、これらのプロトコルは、細胞タイプ、SPIO サイズ、インキュベーション時間、および SPIO 濃度に合わせて調整する必要があります。MSCは軟骨原性分化の可能性を損なったが、SPIO標識17に脂肪原性分化を損なわないことが示されている。したがって、幹細胞の分化力に対するSPIOの影響を評価するために、幹細胞送達の前に分化アッセイを行うことを強くお勧めします。以前の研究では、ここで使用される同じSPIO型および濃度を有するMSC標識がMSC6の骨原性または脂肪分化効力に影響を及ぼさなかったことが実証された。
脳障害および傷害のための治療幹細胞送達の鼻腔内経路は、幹細胞の臨床応用のための有望なアプローチである。しかし、鼻腔内の幹細胞の挙動を決定する本質的および分子的メカニズムは不明のままである。鼻腔内経路は小分子の送達のために広く探索されているが、治療ステムの大きさおよび生物分配行動は小分子とは異なる。現在のプロトコルは、MSC が鼻腔内送達後に傷害部位に移行する傾向があることを示しています。
ここでは、T2*加重画像を使用して SPIO ラベル付き MSC を追跡しました。他のレポートでは、グラデーションエコーイメージングを使用しています。しかしながら、感受性アーティファクトは、細胞間SPIOによる勾配エコーイメージングにおいてしばしば観察される。現在のプロトコルでは、T2*加重画像上のSPIO標識MSCを表す低インテンス領域の位置は、組織学的検査で検出された脳切片におけるSPIOの位置と同じであった(図3)。これは、脳内のSPIO標識MSCトラッキングのためのT2*重み付けスピンエコーイメージングの適切な感度を示す。
要約すると、記載されたプロトコルは、脳損傷および障害の生体内幹細胞追跡研究に有益である。生体内の幹細胞の縦方向の追跡は、伝統的に複数の時点で動物を犠牲にすることによって行われてきた。現在のプロトコルは、臨床現場での脳損傷および障害に対する幹細胞ベースの治療の潜在的な手順を表すMSCの送達および追跡のための非侵襲的で効率的なアプローチを提供する。

間葉系幹細胞(MSC)は、中枢神経系(CNS)障害およびヒトにおける傷害の治療における幹細胞ベースの治療法の魅力的な候補である。また、MSCは、傷害部位1、2における治療用タンパク質の送達用手段として用いられてきた。近年、CNS障害の幹細胞ベースの治療法に対して、1)新しい細胞送達経路と2)細胞追跡を確立する有望な技術革新が開発されている。脳への幹細胞の鼻腔内送達は、細胞がクリクリフォームプレートをバイパスし、部分的に分位経路3を介して嗅球を入力する能力に依存する。NASA内送達とMSCと超常磁性酸化鉄(SPIO)ナノ粒子の標識の組み合わせは、CNS障害の治療におけるMSCの臨床応用に対する有望なアプローチを表しており、SPIOナノ粒子は磁気共鳴画像(MRI)のための安全なプローブであり、MRI3、4、5によるMSCの非侵襲的感受性縦方向追跡を可能にする。さらに、鼻腔内送達は、短期間で繰り返し投与を可能にする安全で非侵襲的な経路である。
この記事では、SPIO標識細胞とMRIを用いた外傷性脳損傷(TBI)のマウスモデルにおける生体内鼻腔内送達におけるMSCを追跡するための高感度で非侵襲的な技術について説明する。SPIO標識の重要な利点の1つは、MRIによる組織におけるSPIOの感受性検出であり、細胞を効率的かつ非侵襲的に追跡することを可能にする。ここで使用されるSPIOナノ粒子は市販されており、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)フルオロフォアでタグ付けされており、免疫染色や追加処理を行わずに組織中のSPIOを検出することができます。さらに、縦方向のリアルタイム追跡を行い、配信されたMSCの生体分布を調査することができる。

<table><tbody><tr><td>細胞培養用品 (プラスチック)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Vary</td><td>あらゆるソースと交換可能</td></tr><tr><td>ディスポーザブル ミクロトームブレード</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x) with GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>凍結組織標本用埋込培地 (O. C. T.)</td><td>さくらファインテック</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>12662-029</td><td></td></tr><tr><td>蛍光野生顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>オリンパス BX43</td><td></td></tr><tr><td>フォーセプト</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11293-00</td><td>手術</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン (10 mg/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>バリカン</td><td>ペットクラブ</td><td>PC-400</td><td></td></tr><tr><td>頭部外傷挫傷装置</td><td>Precision Systems and Instrumentation</td><td>Model TBI-0310</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ from bovine testes</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>ITK-SNAP Software</td> ペンシル<td>ベニア大学のペン イメージ コンピューティング アンド サイエンス ラボラトリー (PICSL)、およびユタ大学の科学計算およびイメージング研究所 (SCI)</td><td>ITK-SNAP 3.8.0</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン (Ketavet)</td><td>Pfizer</td><td>778-551</td><td></td></tr><tr><td>マウス</td><td>国立実験動物センター、台湾</td><td>C57BL6</td><td>研究で使用された野生型マウス</td></tr><tr><td>株 Microdrill</td><td>中西</td><td>NE50</td><td>骨窓を生成するためのバリとの組み合わせ</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>マウス (C57BL/6) 間葉系幹細胞</td><td>GIBCO</td><td>S1502-100</td><td></td></tr><tr><td>MRIスキャナー</td><td>Bruker Biospec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td><td>Corning Cellgro/ThermoFisher</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-iodine 7.5%</td><td>Purdue product L.P.</td><td></td><td>外科用スクラブ</td></tr><tr><td>プルシアンブルーステイン</td><td>アブカム</td><td>ab150674</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14084-08</td><td>手術</td></tr><tr><td>定位固定装置フレーム</td><td>Kopf Instruments</td><td>モデル900</td><td></td></tr><tr><td>超常磁性酸化鉄(SPIO)ナノ粒子</td><td>BioPAL</td><td>Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51</td><td>MRIを使用した生体内追跡のための幹細胞標識</td></tr><tr><td>縫合糸モノフィラメント</td><td>Ethicon</td><td>G697</td><td>縫合</td></tr><tr><td>糸 タイマー</td><td>Wisewind</td><td></td><td>任意のソースと交換可能</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>GIBCO</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン (ロンプン)</td><td>バイエル</td><td>QN05 cm92</td><td></td></tr></tbody></table>

外傷性脳損傷マウスモデルにおける鼻腔内送達後のmriを用いた超常磁性酸化鉄標識間葉系幹細胞の追跡

Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model

外傷性脳損傷(TBI)などの脳損傷に対する幹細胞ベースの治療法は、臨床試験の有望なアプローチである。しかし、侵襲的な細胞送達や移植効率の低い追跡などの技術的なハードルは、トランスレーショナルステムベースの治療において依然として課題となっています。本稿では、超常磁性酸化鉄(SPIO)ナノ粒子による間葉系幹細胞(MSC)の標識、ならびに標識されたMSCの鼻腔内送達に基づく幹細胞の標識と追跡の新しい技術について説明する。これらのナノ粒子は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)埋め込まれ、MSCに標識しても安全であり、その後、鼻腔内経路によってTBI誘導マウスの脳に送達される。その後、リアルタイム磁気共鳴画像法(MRI)によって生体内で非侵襲的に追跡されます。細胞標識と鼻腔内送達のためのSPIOを組み合わせたこの技術の重要な利点は、(1)非侵襲的、長い追跡期間の配信後の生体内MSC追跡、(2)非侵襲的による複数のドーピング計画の可能性を含むMSC送達の経路、および(3)SPIOの安全性、MRIによる細胞追跡方法の非侵襲的性質、および投与経路に起因する、ヒトへの可能な応用。

鼻腔内送達の24時間後に、SPIO標識MSCは、T2*加重画像上の皮質損傷に対する強い低インステンス領域として検出された(図2B)。この移行は、この期間の大幅な減少なしに低インテンス信号が見えることがわかったため、配信後14日まで目に見えるままでした(図2B)。PBSで処置された傷ついた動物は、低インテンス領域を示さず、観測された低い強さの領域がMSCに標識されたSPIOに対応し、アーティファクトをシグナル化しないことを示す(図2A)3D再構成を用いて生体内で観察された標識されたMSCの生体分布を可視化した(図2C,D)。MSCの負傷した皮質への移行は、プルシアンブルー染色およびFITCタグ付きSPIOのFITCチャネル検出によって組織学的に確認された(図3A,B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig1.jpg"> 図1:プロトコルの概略フローチャートとMSCによるSPIO取り込みのインビトロ確認(A)MSCを24時間、標識用にSPIOでインキュベートした。次に、ラベル付き MSC を鼻腔内(IN)ルートを介して TBI マウス モデルに配信しました。異なるタイムポイントでMRIを行い、標識されたMSCを追跡するために行われたSPIOによるMSCの十分な標識の確認は、SPIOナノ粒子がFITCでタグ付けされたので、FITCチャネルを用いた(B)蛍光顕微鏡および(C)共焦点顕微鏡によって達成された。(D) 標識されたMSCの細胞ペレットは、鉄の積み込みにより色が濃く見えた。FITC = フルオレセインイソチオシアネート;SPIO =酸化鉄の超常磁性粒子;MSC = 間葉系幹細胞;MRI = 磁気共鳴イメージング;IN = 鼻腔内;TBI = 外傷性脳損傷.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig2.jpg"> 図2:リアルタイムMRIは、TBI誘発マウスの脳内の傷害部位に向けたSPIO標識MSC移行の検出と追跡を可能にする。(A)マウスをTBIに供し、続いてPBSまたはSPIO標識MSCによる治療を行い、損傷後24時間鼻腔内経路を介して投与した。T2*重み付け画像のコロナセクションは、1、7、および14日後の傷害部位(輪郭領域)の端にある低強烈な領域(矢印)としてラベル付けされたMSCを示した。PBS処置マウスは低激しい領域を示さない。(B)傷害部位領域(緑色)のセグメンテーションプロセスと、コロナT2*-MRI画像に基づく標識されたMSC(赤色)。(C)出産後14日後の脳におけるSPIO標識MSCの生体分布を示すT2*重み付み画像に基づくマウス脳治療の3D再構成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig3.jpg"> 図3:組織学的解析は、処置動物の脳におけるSPIO標識MSCの存在を確認する。PBS(対照)で処理したマウス(A)マウスの脳切片のプロイセンブルー染色は、SPIO標識MSCで処理されたSPIO陽性細胞(箱入り細胞、青色)で検出され、コントロールマウスは14日後の分娩後に皮質の傷害部位で陽性細胞を示さず、MRI観察を確認した。PBSおよび(D)マウスで処理した(B)コントロールマウスの皮質の蛍光顕微鏡分析を、SPIO標識MSCで処理し、14日後に行った。分析の結果、MSC処理マウスの傷ついた皮質にFITCタグ付きSPIO陽性細胞(箱入り細胞、緑色)の存在が明らかになったが、PBS処理マウスの皮質にはFITCシグナルは認められなかった。特に明記されていない限り、スケールバー = 50 μm です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここで提示されるのは、外傷性脳損傷のマウスモデルにおける非侵襲的間葉系幹細胞(MSC)の送達および追跡のためのプロトコルである。超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、リアルタイムMRIを用いた鼻腔内送達に続くMSC標識および非侵襲的なインビボ追跡のための磁気共鳴画像(MRI)プローブとして採用されています。

外傷性脳損傷マウスモデルにおける鼻腔内送達後のMRIを用いた超常磁性酸化鉄標識間葉系幹細胞の追跡

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical ...

この方法は、脳への鼻腔内送達後のLOBIT幹細胞の塩基分布を決定するのに役立つ。この技術の主な利点は、脳への間葉系幹細胞の非侵襲的な送達および追跡を容易にすることです。また、複数の投与量は、傷害後の慢性段階で移植細胞の治療効果を最大化することが可能である。この技術は、傷害部位に送達される細胞の数を最大化し、他の組織へのロベン酸細胞の進行を最小限に抑える。この技術は、外傷性脳損傷療法における間葉系幹細胞の使用に関する洞察を提供するが、非外傷性脳損傷の調査にも使用することができる。間葉系幹細胞に超常磁性鉄酸化物を標識する場合は、T 75フラスコの80%コンフルエント間葉系幹細胞培養に6ミリリットルの標識培地を加え、摂氏37度と二酸化炭素5%で24時間培養します。翌日、慎重にスーパーナタンを吸引し、洗浄ごとに6ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄する。細胞が正常に標識されたかどうかを判断するには、フローレス顕微鏡で培養を確認します。CCIの損傷を誘発するには、ペダル反射への応答の欠如を確認した後、電子バリカンを使用して頭蓋骨の後ろ面から毛皮を剃り、ヨウ素に浸した無菌綿棒で剃った領域を数回きれいにします。70%エタノールに浸した綿棒を使用して、最後の綿棒の後にヨウ素を取り除き、動物を立体性フレームに入れる。耳と鼻の棒でマウスを固定し、頭蓋骨の表面にアクセスするために剃った皮膚に2.5センチメートルの中頭座切開を行います。綿パッドを使用して頭蓋骨を覆う組織を取り除き、3%過酸化水素を浸した綿棒で頭蓋骨の表面を10秒間きれいにします。新鮮な綿パッドで頭蓋骨を乾燥させ、鉛筆を使用して、露出した骨の選択した座標の周りに4ミリメートルの円を描きます。直径0.5ミリメートルの丸いバーを装備したマイクロドリルを使用して、慎重に圧力をかけることなく、マークされた円で頭蓋骨を薄くします。清潔で乾燥した綿棒で骨粉塵を取り除き、滅菌入り鉗子を使用して得られた骨フラップを慎重に取り除きます。硬膜が露出したら、マウスをCCI装置の立体フレームに移し、頭部が回転方向にレベルになるように耳と鼻のバーで動物を固定する。コントロールボックスの指示に従って、インパクタのベースにあるXおよびY制御ホイールを使用して露出した皮質表面へのインプクタ先端をゼロにして、影響を受ける必要のあるコルテックス座標の真上にインパクタチップを配置します。コントロールボックスを使用して、実験パラメータを毎秒5メートルの速度、250ミリ秒のドウェル時間、軽度の傷害を誘発する1ミリメートルの傷害深さに設定します。次に、コントロールボックスの衝撃ボタンを押します。無菌綿棒で発生する出血を綿棒し、フレームからマウスを取り除きます。シルクの外科的縫合糸で切開を閉じ、局所抗生物質を部位に塗布してから、マウスを完全な再発まで監視して加熱パッドに置きます。傷害の翌日、間葉系幹細胞培養標識された超常磁性鉄を3ミリリットルのトリプシンで処理する。摂氏37度で5分後、10%のウシ胎児血清を補充し、15ミリリットルの円錐管に細胞懸濁液を集め、7ミリリットルのあらかじめ温めたDMEM培地で反応を開始する。遠心分離により細胞を沈め、カウントのためにPBS中のペレットを再懸濁する。次いで、PBSの18マイクロリットル当たり5個の細胞に1.5倍10に細胞濃度を調整する。細胞送達のために、つまみつまみつまみへの応答の欠如を確認した後、頭蓋骨を固定しながらマウスを擦り傷する。マウスのナレ付近にPBSのマイクロリットルあたり4単位のヒアルロニダーゼを含むピペットの先端を45度の角度で配置し、各鼻孔に3マイクロリットルのヒアルロニダーゼ懸濁液を投与する。動物の顔を清潔なパッドの上に5分間置き、治療を4回繰り返し、合計100単位のヒアルロンジダーゼ治療を行います。最後の治療の後、マウスをパッドに30分間戻してから、ちょうど実証したようにマウスを拘束します。頭部を固定化すると、溶液送達あたり3秒間にわたって間葉幹細胞懸濁液の3マイクロリットルを各鼻孔に投与し、サンプルが完全に消失するまでマウスを30秒間位置に保持する。2分後、間葉系幹細胞の全容が送達されるまで3回まで送達を繰り返す。その後、完全な再実行まで監視して、そのケージにマウスを戻します。MRIによる間葉系幹細胞の移動を追跡するには、麻酔マウスをMRイメージャーのイメージングホルダーに置きます。次に、所定の位置に動物を固定し、MRIコイルの中央にホルダーを移動します。繰り返し時間を 1500 ミリ秒に設定し、エコー時間を 2.8 ミリ秒に設定します。次に、視野を16 x 16ミリメートルに、取得行列を128 x 128に、スライス厚さを0.75 x 0.8ミリメートルに設定し、4つの信号平均と90度フリップ角度を使用してスピンエコーシーケンスを使用してT2スターの重み付けスキャンを取得します。スキャンが完了したら、MRIコイルセンターからマウスホルダーを引き込み、完全な債務が満たされるまで監視してマウスをケージに戻します。T2星の重み付け画像上のラベル付き間葉系幹細胞を追跡および定量化するには、ITケーススナップソフトウェアでデータを開き、アクティブラベルを選択します。各セグメントに異なるラベル色を使用して、低激領域と病変または関心のある他の脳部分のセグメンテーションを作成する。メインツールバーのポリゴンツールを使用して、間葉系幹細胞とラベル付けされた超常磁性鉄を表す低地を選択し、[受け入れる]をクリックします。セグメント化された領域は、そのセグメントに割り当てられたアクティブなラベルと同じ色で表示されます。すべてのスライスがセグメント化されたら、メスツールを使用して、脳全体の間葉系幹細胞分布を表すセグメント化された領域の3Dマップを開発します。ラベルを持つセルを表すセグメント化された低強度領域の体積と強度平均の定量分析を実行するには、セグメント化をクリックし、ボリュームと統計量を選択します。鼻腔内送達後24時間、間葉系幹細胞とラベル付けされた超常磁性鉄は、T2星重み画像上の皮質損傷に対する強力な低強度領域として検出され、超常磁性鉄の標的移動を示す。この移行は、信号の大幅な減少なしに、配信後14日まで表示されます。PBSで治療した負傷した動物は、いかなる時点でも不力領域を示さないので、観察された低圧領域が間葉系幹細胞と標識された超常磁性鉄に相当し、シグナルアーチファクトによるものではないことを示している。標識された間葉系幹細胞の生体分布は、3D再構成、プロイセンブルー染色による組織学的、または標識された間葉系幹細胞内のFITCタグ付き超常磁性鉄の蛍光検出を使用して可視化することができる。必ず、MRI 結果をエストロジーまたはその他の方法で検証してください。超磁性酸化鉄粒子は細胞が死んだ後も組織に残り、偽陽性シグナルを引き起こす可能性があります。この手順に従って、定量における可能な温気非侵襲的追跡は、脳内の間葉系幹細胞の能力および保持に関する質問に答えるために適用することができる。この開発の後、この技術は、再生医療の分野の研究者が脳の特定の領域に細胞の磨きを改善するための方法を探求する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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プレゼンテーションの目的は、MRイメージングで可視化することができます軟骨欠損におけるマトリックス関連する幹細胞移植を、生成するために高度に再現可能な方法を示すことです。幹細胞は、アガロースと混合のFDA承認されたFerumoxides、、軟骨欠損に移植し、7T...

軟骨欠損のヒト間葉系幹細胞を標識Ferumoxidesの注入

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診断と治療モニタリングのためのナノ材料の登録バイオイメージング

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

出典: Shahror, RA et al., 外傷性脳損傷マウスモデルにおける鼻腔内送達後の MRI を使用した超常磁性酸化鉄標識間葉系幹細胞の追跡。J. Vis. 経験。(2019年)このビデオは、マウスモデルにおける鼻腔内間葉系幹細胞(MSC)の送達を示しています。MSC...

外傷性脳損傷のマウスモデルにおける鼻腔内間葉系幹細胞送達

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細胞標識および超常磁性酸化鉄ナノ粒子とターゲティング

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マウスモデルにおける膠芽細胞腫に対する治療用幹細胞の鼻腔内送達

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学ぶ外傷性脳損傷マウスモデルにおける間葉系幹細胞の鼻腔内送達とMRI追跡法。超常磁性酸化鉄ナノ粒子を用いた非侵襲的細胞標識により、脳内細胞分布を可視化し、再生医療への応用可能性を示す。

外傷性脳損傷マウスモデルにおける鼻腔内送達後のMRIを用いた超常磁性酸化鉄標識間葉系幹細胞の追跡

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