外傷性脳損傷マウスモデルにおける鼻腔内送達後のMRIを用いた超常磁性酸化鉄標識間葉系幹細胞の追跡

ここで提示されるのは、外傷性脳損傷のマウスモデルにおける非侵襲的間葉系幹細胞(MSC)の送達および追跡のためのプロトコルである。超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、リアルタイムMRIを用いた鼻腔内送達に続くMSC標識および非侵襲的なインビボ追跡のための磁気共鳴画像(MRI)プローブとして採用されています。

この方法は、脳への鼻腔内送達後のLOBIT幹細胞の塩基分布を決定するのに役立つ。この技術の主な利点は、脳への間葉系幹細胞の非侵襲的な送達および追跡を容易にすることです。また、複数の投与量は、傷害後の慢性段階で移植細胞の治療効果を最大化することが可能である。

この技術は、傷害部位に送達される細胞の数を最大化し、他の組織へのロベン酸細胞の進行を最小限に抑える。この技術は、外傷性脳損傷療法における間葉系幹細胞の使用に関する洞察を提供するが、非外傷性脳損傷の調査にも使用することができる。間葉系幹細胞に超常磁性鉄酸化物を標識する場合は、T 75フラスコの80%コンフルエント間葉系幹細胞培養に6ミリリットルの標識培地を加え、摂氏37度と二酸化炭素5%で24時間培養します。

翌日、慎重にスーパーナタンを吸引し、洗浄ごとに6ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄する。細胞が正常に標識されたかどうかを判断するには、フローレス顕微鏡で培養を確認します。CCIの損傷を誘発するには、ペダル反射への応答の欠如を確認した後、電子バリカンを使用して頭蓋骨の後ろ面から毛皮を剃り、ヨウ素に浸した無菌綿棒で剃った領域を数回きれいにします。

70%エタノールに浸した綿棒を使用して、最後の綿棒の後にヨウ素を取り除き、動物を立体性フレームに入れる。耳と鼻の棒でマウスを固定し、頭蓋骨の表面にアクセスするために剃った皮膚に2.5センチメートルの中頭座切開を行います。綿パッドを使用して頭蓋骨を覆う組織を取り除き、3%過酸化水素を浸した綿棒で頭蓋骨の表面を10秒間きれいにします。

新鮮な綿パッドで頭蓋骨を乾燥させ、鉛筆を使用して、露出した骨の選択した座標の周りに4ミリメートルの円を描きます。直径0.5ミリメートルの丸いバーを装備したマイクロドリルを使用して、慎重に圧力をかけることなく、マークされた円で頭蓋骨を薄くします。清潔で乾燥した綿棒で骨粉塵を取り除き、滅菌入り鉗子を使用して得られた骨フラップを慎重に取り除きます。

硬膜が露出したら、マウスをCCI装置の立体フレームに移し、頭部が回転方向にレベルになるように耳と鼻のバーで動物を固定する。コントロールボックスの指示に従って、インパクタのベースにあるXおよびY制御ホイールを使用して露出した皮質表面へのインプクタ先端をゼロにして、影響を受ける必要のあるコルテックス座標の真上にインパクタチップを配置します。コントロールボックスを使用して、実験パラメータを毎秒5メートルの速度、250ミリ秒のドウェル時間、軽度の傷害を誘発する1ミリメートルの傷害深さに設定します。

次に、コントロールボックスの衝撃ボタンを押します。無菌綿棒で発生する出血を綿棒し、フレームからマウスを取り除きます。シルクの外科的縫合糸で切開を閉じ、局所抗生物質を部位に塗布してから、マウスを完全な再発まで監視して加熱パッドに置きます。

傷害の翌日、間葉系幹細胞培養標識された超常磁性鉄を3ミリリットルのトリプシンで処理する。摂氏37度で5分後、10%のウシ胎児血清を補充し、15ミリリットルの円錐管に細胞懸濁液を集め、7ミリリットルのあらかじめ温めたDMEM培地で反応を開始する。遠心分離により細胞を沈め、カウントのためにPBS中のペレットを再懸濁する。

次いで、PBSの18マイクロリットル当たり5個の細胞に1.5倍10に細胞濃度を調整する。細胞送達のために、つまみつまみつまみへの応答の欠如を確認した後、頭蓋骨を固定しながらマウスを擦り傷する。マウスのナレ付近にPBSのマイクロリットルあたり4単位のヒアルロニダーゼを含むピペットの先端を45度の角度で配置し、各鼻孔に3マイクロリットルのヒアルロニダーゼ懸濁液を投与する。

動物の顔を清潔なパッドの上に5分間置き、治療を4回繰り返し、合計100単位のヒアルロンジダーゼ治療を行います。最後の治療の後、マウスをパッドに30分間戻してから、ちょうど実証したようにマウスを拘束します。頭部を固定化すると、溶液送達あたり3秒間にわたって間葉幹細胞懸濁液の3マイクロリットルを各鼻孔に投与し、サンプルが完全に消失するまでマウスを30秒間位置に保持する。

2分後、間葉系幹細胞の全容が送達されるまで3回まで送達を繰り返す。その後、完全な再実行まで監視して、そのケージにマウスを戻します。MRIによる間葉系幹細胞の移動を追跡するには、麻酔マウスをMRイメージャーのイメージングホルダーに置きます。

次に、所定の位置に動物を固定し、MRIコイルの中央にホルダーを移動します。繰り返し時間を 1500 ミリ秒に設定し、エコー時間を 2.8 ミリ秒に設定します。次に、視野を16 x 16ミリメートルに、取得行列を128 x 128に、スライス厚さを0.75 x 0.8ミリメートルに設定し、4つの信号平均と90度フリップ角度を使用してスピンエコーシーケンスを使用してT2スターの重み付けスキャンを取得します。

スキャンが完了したら、MRIコイルセンターからマウスホルダーを引き込み、完全な債務が満たされるまで監視してマウスをケージに戻します。T2星の重み付け画像上のラベル付き間葉系幹細胞を追跡および定量化するには、ITケーススナップソフトウェアでデータを開き、アクティブラベルを選択します。各セグメントに異なるラベル色を使用して、低激領域と病変または関心のある他の脳部分のセグメンテーションを作成する。

メインツールバーのポリゴンツールを使用して、間葉系幹細胞とラベル付けされた超常磁性鉄を表す低地を選択し、[受け入れる]をクリックします。セグメント化された領域は、そのセグメントに割り当てられたアクティブなラベルと同じ色で表示されます。すべてのスライスがセグメント化されたら、メスツールを使用して、脳全体の間葉系幹細胞分布を表すセグメント化された領域の3Dマップを開発します。

ラベルを持つセルを表すセグメント化された低強度領域の体積と強度平均の定量分析を実行するには、セグメント化をクリックし、ボリュームと統計量を選択します。鼻腔内送達後24時間、間葉系幹細胞とラベル付けされた超常磁性鉄は、T2星重み画像上の皮質損傷に対する強力な低強度領域として検出され、超常磁性鉄の標的移動を示す。この移行は、信号の大幅な減少なしに、配信後14日まで表示されます。

PBSで治療した負傷した動物は、いかなる時点でも不力領域を示さないので、観察された低圧領域が間葉系幹細胞と標識された超常磁性鉄に相当し、シグナルアーチファクトによるものではないことを示している。標識された間葉系幹細胞の生体分布は、3D再構成、プロイセンブルー染色による組織学的、または標識された間葉系幹細胞内のFITCタグ付き超常磁性鉄の蛍光検出を使用して可視化することができる。必ず、MRI 結果をエストロジーまたはその他の方法で検証してください。

超磁性酸化鉄粒子は細胞が死んだ後も組織に残り、偽陽性シグナルを引き起こす可能性があります。この手順に従って、定量における可能な温気非侵襲的追跡は、脳内の間葉系幹細胞の能力および保持に関する質問に答えるために適用することができる。この開発の後、この技術は、再生医療の分野の研究者が脳の特定の領域に細胞の磨きを改善するための方法を探求する道を開きました。