ライブセルにおけるeIF4E-eIF4G相互作用を測定してeIF4Fアセンブリをモニタリング

eIF4F複合体シグナル伝達の制御は、がんの増殖と生存に関与するmRNAサブセットの翻訳の増加と関連しています。ここでは、生細胞のeIF4F複合体完全性における薬物誘発摂動を評価できるeIF4E-eIF4G細胞ベースのタンパク質間相互作用アッセイについて説明します。タンパク質間界面を効率的に標的とするモダリティの開発への関心が高まっています。

私たちは、eIF4E-eIF4G PPIアッセイがこれらの戦略を促進し、検証するのに役立つと想定していました。このアッセイは、eIF4E-eIF4G阻害剤の最適化をリードするための最適な一次スキームを提供します。細胞の正しい播種とトランスファートランスフェクションの実施は、PPI報告システムの抑制に直接反映される可能性があるため、この製品の最も困難な側面です。

細胞を解凍してカウントした後、ウェルあたり2ミリリットルの標準増殖培地を使用して、HEK293細胞を6ウェルプレートに播種します。2日目の朝、プレーニングトランスフェクションごとに、フェノールレッドを含まない125マイクロリットルの還元血清培地を含むチューブで9マイクロリットルのリポソームベースの溶液を希釈します。希釈したリポソームを室温で5分間インキュベートしながら、各トランスフェクションチューブごとに各プラスミドの3マイクログラムを125マイクロリットルの還元血清培地で希釈して、DNAのマスターミックスを調製します。

DNAマスターミックス2に12マイクロリットルのエンハンサー試薬を加え、よく混ぜます。直ちにこの混合物を希釈したリポソームの各チューブに1対1の比率で加えます。このDNA脂質複合体を室温で15分間インキュベートした後、6ウェルプレートの各ウェルに複合体を添加します。

細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素と24時間インキュベートします。3日目の朝、各ウェルを1ミリリットルのPBSですすぎ、0.3ミリリットルのトリプシンを加えます。プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。

インキュベーション後、フェノールレッドを含まない還元血清培地の各ウェルに2ミリリットルを追加してトリプシンを中和します。.トランスフェクションした細胞を15ミリリットルのチューブに移します。次に、細胞を290x Gで5分間遠心分離します。

培地を吸引し、細胞ペレットを還元血清培地の2ミリリットルに再懸濁します。トランスフェクションしたHEK 293細胞を、90マイクロリットルの培地中のウェルあたり30,000細胞の密度で、96ウェル不透明プレートに播種します。同じ実験で3つの異なる化合物について3回のテクニカルレプリケートを得るには、60ウェルのシードを行います。

エッジのウェルを除外します。トランスフェクションした細胞を播種した直後に、各ウェルに10マイクロリットルの10%DMSO化合物溶液を加えます。目的の各化合物を100%DMSOに溶解して、1ミリモルの化合物ストック溶液を調製します。

各コンパウンド滴定で3回の反復を行うには、8マイクロリットルの1ミリモル化合物ストック溶液を使用します。96ウェルPCRプレートの8ウェルで各滴定ポイントについて、1ミリモルストックの4マイクロリットルを100%DMSOの4マイクロリットルにピペットで移すことにより、各ストック化合物溶液の2倍段階希釈を行います。2倍の段階希釈の最後のポイントの後に余分な4マイクロリットルを廃棄します。

各チューブに36マイクロリットルのHPLCグレードの滅菌水を加えて、10%DMSO中の10倍化合物連続希釈溶液40マイクロリットルを調製します。また、コントロールを準備します。10%DMSはHPLCグレードの滅菌水のみのストック溶液です。

96ウェル不透明プレートの細胞に10マイクロリットルの10倍ワーキング溶液を加えて、意図した最終濃度を得るため、残留DMSO濃度が1%のプレートを摂氏37度で5%二酸化炭素と3時間インキュベートします。3時間後、1容量の基質と19容量の希釈試薬を組み合わせて、ルシフェラーゼ基質試薬の調製を開始します。マルチチャンネルピペットを使用して、細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルに25マイクロリットルの基質試薬を直ちに追加します。

オービタルシェーカーでプレートを350 RPMで室温で50分間振とうします。発光性を評価するには、プレートをプレートリーダーに置きます。ミラーリーダーを発光に設定し、発光フィルターを455に設定します。

測定高さ6.5ミリメートル、測定時間1秒を使用します。細胞生存率を評価するには、各ウェルに33マイクロリットルの生存率アッセイ試薬を添加します。室温で15分後、ミラーリーダーを発光に、蛍光フィルターを600に設定して、プレートリーダーで発光を評価します。

測定高さは6.5ミリメートル、測定時間は1秒です。プレートリーダーからのデータを使用して、原稿に記載されている4パラメータフィッティング曲線方程式にデータをカーブフィットすることにより、各コンパウンドのIC 50値を決定します。HEK 293細胞をeIF4E-eIF4G相補系でトランスフェクションした後、後退させてmTOR阻害剤で処理しました。

治療の4時間後に発光を評価したところ、PP242とラパマイシンの両方がシグナルの用量依存的な阻害を生じさせました。PP242もラパマイシンも細胞生存率の有意な低下をもたらさず、eIF4E-eIF4G相補系における発光の減少は非特異的な細胞死によるものではなく、EIF4E-4G相互作用の破壊によるものであることを示しています。m7GTPプルダウン実験後のウェスタンブロット解析では、4EBP1が媒介する内因性eIF4E-eIF4G相互作用の破壊が、測定されたeIF4E-eIF4Gアッセイシグナルと相関していることが示されました。

PP242は、ラパマイシンよりも全4EBP1リン酸化のより強力な阻害剤でした。どちらの阻害剤もmTORシグナル伝達に正常な影響を与え、ラパマイシンはmTORC1基質に対してより活性が高く、PP242はmTORC1とmTORC2の両方を標的としました。この製品の最も重要な側面は、取引日に細胞を播種し、フェノールレッドを含まない培地で細胞を再播種し、eIF4E-eIF4G相補アッセイの発光を評価し、同じプレート上で生存率アッセイで実行することです。

二次生存率アッセイは、標的および既知の特異的効果の任意の薬物を評価するために実施することができる。