中性子結晶学データの収集とタンパク質構造における水素原子のモデリング処理

中性子結晶構造解析は、生体高分子中の水素原子の位置を決定するための構造技術です。中性子構造は、プロトン化状態や水分子の配向を明らかにし、反応機構や結合相互作用を解明します。X線回折とは対照的に、中性子回折には非破壊的な技術であるという利点があります。

感光基や金属センサーを持つタンパク質は、放射線障害を受けることなく研究することができます。中性子タンパク質結晶構造解析を行うには、大きな壊れやすいタンパク質結晶を石英キャピラリーに取り付けて室温でデータを収集します。水晶キャピラリーの取り付けは日常的に行われていないため、この技術のデモンストレーションは有益です。

結晶回収には、タンパク質結晶が入った密封されたサンドイッチボックスを9ウェルの大容量シリコン化ガラスプレートに開け、マイクロピペットを使用して結晶化リザーバー溶液から10〜20マイクロリットルをスライドガラスに移します。顕微鏡で結晶を評価します。適切なサイズのマイクロループを使用して結晶を採取し、その結晶をリザーバー溶液の液滴に入れます。

水晶に取り付けるには、直径2ミリメートル、長さ50ミリメートルの石英キャピラリーを取り、ピペットでリザーバーバッファーを吸引し、キャピラリーの一端をリザーバーバッファーで満たします。取り付けループを使用して、水晶を水晶キャピラリー内のリザーバーバッファーにそっと配置します。チューブをタップしてリザーバーバッファーとクリスタルをキャピラリーの下に移動させ、長く細いピペットを使用してクリスタルの周囲から溶液を吸引します。

薄い紙の芯を使用して結晶を慎重に乾燥させ、毛細管壁を乾燥させ、毛細血管の端に20〜50マイクロリットルの重水素化緩衝液を加えます。ヒートワンドを使用して蜜蝋の一部を溶かし、気密シールが形成されるまで、溶けた蜜蝋に毛細管をそっと挿入します。結晶実装後2日目、6日目、および10日目に重水素化緩衝液を20〜50マイクロリットルの新鮮な重水素化緩衝液と交換し、示されているように各蒸気交換後に新鮮な溶融蜜蝋でキャピラリーを再シールします。

少なくとも2週間の蒸気交換後、パテを使用して、装置サンプルステージに固定されたIMAGINE中性子回折計ゴニオメーターサンプルスティックに石英キャピラリーを固定し、サンプルとスティックを中性子ビームと検出器領域に下げます。ビームライン制御用コンピュータでデータ取得プログラムを開き、データ収集戦略の設定や装置名、画像名などの実験パラメータを入力するための設定タブをクリックします。[収集] タブをクリックし、露出時間や収集するフレーム数などのデータ収集パラメーターを入力します。

光学グラフィック ユーザー インターフェイス内で、ラムダの最小値として 2.78 をクリックし、ラムダの最大値として 4.5 をクリックして、データ コレクションの準範囲を設定します。「スキャンの開始」をクリックして、データ収集を開始します。中性子データの収集後、同じ結晶上の同じ温度に対応するX線データセットを収集します。

クライオデータ収集の前に、サンドイッチボックスからリザーバー溶液を取り出し、サンドイッチボックスに重水素化リザーバー緩衝液を充填し、1週間平衡化して3回繰り返す。さらに3ラウンドのリザーバー溶液交換を行った後、マイクロループで結晶を回収し、結晶を凍結保護剤溶液に2時間浸してから、クライオクリスタルマウントに取り付けられたマイクロループに結晶をマウントします。マウントされたクリスタルとクライオマウントを液体窒素に沈めます。

結晶が凍結したら、クライオストリームを取り付けた高分子中性子回折装置のサンプルステージに結晶を取り付けます。水晶振動子がデータ収集用に取り付けられ、中央に配置されていることを確認し、提案情報を入力し、フォルダアイコンをクリックしてデータ収集戦略テーブルをロードし、[送信]をクリックしてデータ収集を開始します。回折した中性子は、MaNDi飛行時間型検出器によって検出されるため、リアルタイムで見えるようになります。

X線と中性子のジョイントデータリファインメントを行うには、まずCCP4を開き、変換を選択して拡張MTZプログラムを変更し、中性子データのRフリーデータフラグとX線データフラグを一致させます。中性子データ反射ファイルをMTZ形式でインポートします。[別のMTZファイルから無料のRデータをインポート]を選択し、X線MTZファイルをインポートします。

新しく一致したMTZファイルに名前を付けて、「実行」をクリックします。次に、Phoenixソフトウェアパッケージを開き、絞り込みの下で[準備完了セット]をクリックします。タンパク質座標ファイルをアップロードし、水素が存在しない場合はモデルに追加することを選択し、交換可能な部位ではHD、それ以外の場所ではドロップダウンメニューからHを選択します。

「溶媒分子に重水素を追加」を選択し、「実行」をクリックして開始します。ストラクチャのリファインメントについては、「リファインメント」タブでフェニックスを開きます。Refine プログラムを使用して、X 線データと中性子データの両方を使用してリファインメントを設定します。

[構成]タブで、解析されたX線構造からPDBファイルを入力します。neutronデータからMTZファイルをアップロードします。MTZファイルデータをneutron R freeの中性子データとして割り当てます。

X線データからMTZファイルをアップロードし、X線データおよびX線Rフリーとして割り当てます。[リファイン設定] で、標準のリファインメント ストラテジが選択されていることを確認し、サイクル数を 5 に増やします。すべてのパラメーター、詳細、水素を選択します。

水素精製モデルを個別モデルに変更し、ADPに乗った力をオフにしてから、原子力を検索します。X-HDからの核距離を使用するを選択します。「実行」をクリックして、絞り込みを開始します。

フェニックスでモデルを構築するには、クートで開くをクリックします。Cootで、X線電子密度と中性子散乱長密度マップを可視化します。ディスプレイ マネージャを選択し、neutron 2FOFC 中性子散乱長密度マップを削除します。

「MTZを開く」を選択し、「MTZを開く」を選択して、中性子データMTZファイルを開きます。振幅と位相の両方のオプションで、ドロップダウンメニューからno_fill_neutronデータを選択して、未充填の中性子散乱長密度マップを開きます。残渣の目視検査を実行して、モデルがデータに適合するかどうかを判断し、水素-重水素交換可能な場所の差密度マップピークを分析して、正しい配向と占有率を決定します。

中性子SLDマップと水素結合相互作用に従って、水分子の向きを変えます。中性子SLDマップに従って、タンパク質残基水素-重水素交換可能部位のプロトン化状態と配向を調整します。さらにインタラクティブなモデルの構築と改良を行い、完全な構造を取得します。

水性緩衝液中で成長した水素化タンパク質結晶は、約1, 000 x 900ミクロンの大きさです。結晶は、中性子回折データ収集の3週間前に、酸化重水素ベースのバッファーとの蒸気交換のために水晶キャピラリーに取り付けることができます。中性子回折データは2.30オングストローム分解能で数日間収集され、X線回折データセットは同じ結晶で収集されました。

FOからFC中性子散乱を引いた長さの密度密度マップのピークは、パラギンなどの残基の配向に関する貴重な情報を提供し、FOからFC中性子散乱長を引いた密度の正のピークも、ヒスチジンなどの滴定可能な基を持つ残基のプロトン化状態を決定する上で非常に有益です。水分子の電子散乱長密度マップと中性子散乱長密度マップのマップオーバーレイは、水素結合の相互作用をX線データから推測できる一方で、中性子はこれらの水素結合の位置について明確な情報を提供することを示しています。中性子散乱長密度省略マップは、水素-重水素側鎖官能基配向を決定するために使用できます。

交換不可能な水素原子が炭素に結合している中性子散乱長密度マップは、密度キャンセルのために電子密度マップと比較すると不完全であるように見えます。したがって、X線データと中性子データの両方を使用してサンプルの共同微細化を行い、X線データを使用してタンパク質骨格の位置を決定することが望ましいです。中性子タンパク質の結晶構造解析には、大きな結晶が必要です。

水晶の取り扱いと取り付けには、水晶を損傷して簡単に割れ、データ品質を損なう可能性のある水晶に損傷を与えないように注意する必要があります。中性子タンパク質結晶構造解析は、タンパク質反応メカニズムに関する洞察を提供し、反応論、突然変異誘発、または分光法によってその役割をさらに調査できる触媒的に関連性のある残基または水分子を明らかにする可能性があります。